CC BY
94
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ Акушерство / гинекология / биотехника размножения ♦
УДК 636: 612.646.089.67
Результаты апробации усовершенствованного метода трансплантации эмбрионов у овец: анализ приживляемости зигот, эффективности вынашивания плода и развития ягнят-трансплантантов
П.В. Аксенова, доктор биол. наук ([email protected], [email protected])
Северо-Кавказский зональный НИИ ветеринарии РАСХН (Новочеркасск).
В эксперименте на овцах северокавказской мясошерстной породы получены эмбрионы от доноров и проведена их трансплантация реципиентам. Исследованы рост и развитие ягнят-трансплантантов. При 100%-й полиовуляции реакция составила в среднем 9,14 фолл./гол., выход эмбрионов, пригодных к трансплантации, достиг 68,4 %. Приживляемость эмбрионов составила 33,3 %, эффективность вынашивания плода реципиентами — 100 %. Ягнята-трансплантанты росли и развивались без отклонений, соответственно нормам породы, при 100%-й сохранности поголовья. Иммунологические и биохимические показатели крови находились в пределах нормы.
Ключевые слова: доноры, имплантация, овцы, полиовуляция, реципиенты, трансплантация эмбрионов, приживляемость эмбрионов, эффективность вынашивания плода, ягнята-трансплантанты Сокращения: АлАТ — аланинаминотрансфераза, АсАТ— аспартатаминотрансфераза, ГГТ — гаммаглутамилт-рансфераза, ГСЖК — гонадотропин сыворотки жеребой кобылы, ДВ — действующее вещество, ж.т. — желтое тело, ИФА — иммуноферментный анализ, УЗИ —ультразвуковое исследование, ФСГ — фолликулостимулирующий гормон, ХГЧ — хорионический гонадотропин человека
Введение
Селекционная работа подразумевает рациональное целенаправленное использование уникальных генотипов животных. Однако даже в элитных племенных стадах численность животных, чей генотип полностью используется, невелика. Генетическая роль самки ограничивается небольшим числом потомков, потенциальные возможности ее генеративного аппарата реализуются в течение жизни далеко не полностью. От одной овцы, например, за период ее хозяйственного использования можно получить в среднем 7...8 потомков [8].
Между тем, эффективность использования генетически ценных овец можно значительно повысить посредством трансплантации эмбрионов [7]. Сущность этого биотехнического метода состоит в том, что под влиянием гормональной стимуляции в яичниках высокоценных овец-до-норов созревает намного больше фолликулов, чем при естественном половом цикле [9]. Зиготы, полученные в результате оплодотворения яйцеклеток, трансплантируют для дальнейшего развития в матку менее ценных самок. Таким образом, число потомков может возрасти во много раз, что увеличивает скорость генетического прогресса.
Кроме того, в связи с бурным развитием биоинженер-ных технологий, трансплантация эмбрионов стала составной частью технологии создания трансгенных животных с заданными свойствами.
Цель исследования
Усовершенствовать технологию получения и трансплантации эмбрионов у овец.
Материалы и методы
Объектом исследований служили клинически здоровые взрослые овцы северокавказской мясошерстной породы. Трансплантацию проводили в половой сезон.
Полиовуляцию у овец-доноров (п=5) индуцировали по оригинальной схеме: ушные импланты «Крестар» (ДВ норгестамет) в дозе 3 мг/гол.; препарат «Фоллимаг» (ДВ ГСЖК) внутримышечно, в дозе 1000 ед./гол.; препарат «Оваген» (ДВ овечий питуитарный ФСГ) внутримышечно, дробно, в общей дозе 7 мл/гол.; «Хорулон» (ДВ ХГЧ) внутривенно, в дозе 700 ед./гол [10].
Овец-доноров осеменяли интрацервикально свеже-полученной спермой в дозе 0,1 мл, трехкратно в течение охоты.
Оперативный доступ к внутренним половым органам овец-доноров осуществляли посредством лапа-ротомии. Наличие и качество полиовуляции определяли по количеству желтых тел в яичниках. Эмбрионы извлекали через 72 ч после удаления имплантов по общепринятой технологии с собственными модификациями [11].
Для того, чтобы убедиться в жизнеспособности эмбрионов, перед трансплантацией их культивировали в среде К80М при 39 оС и 5 % СО2 до первого деления. К пригодным для трансплантации относили 2-х и 4-х
П.В. Аксенова
Рис. 1. Полиовуляция в яичнике овцы-донора Рис. 2. Новорожденные ягнята - трансплантанты с матерью-реципиентом, 1 мес
бластомерные эмбрионы, развивающиеся при инкубировании без нарушений в строении и целостности оболочки.
В качестве реципиентов отбирали овец в состоянии естественной охоты, синхронной донорам. Сроки наступления половой охоты фиксировали рефлексологическим путем с помощью баранов-пробников.
При трансплантации прибегали к лапаротомии. Эмбрионы пересаживали со стороны овулировавшего яичника через воронку яйцевода на глубину 4...5 см, по 2 эмбриона на одного реципиента.
Биохимические показатели сыворотки крови ягнят определяли на биохимическом анализаторе Chem Well 2900V (T); гематологические — на гематологическом анализаторе PCE-90Vet.
Под понятием «приживляемость эмбрионов» подразумевали отношение числа пересаженных эмбрионов к количеству родившихся ягнят.
Под термином «эффективность вынашивания плода» подразумевали отношение количества беременных овец к родившим.
Об эмбриональном лизисе условно судили по разнице между числом забеременевших животных (наличие имплантации определяли прогестероновой пробой на беременность) и числом животных с сохраненной беременностью через 2 мес после трансплантации (наличие беременности определяли посредством УЗИ).
Эффективность трансплантации учитывали через 2 мес посредством УЗИ овец-реципиентов, окончательно — по результатам ягнения.
Рост и развитие ягнят-трансплантантов исследовали в соответствии со стандартными зоотехническими методами.
Результаты и обсуждение
Индукция полиовуляции по оригинальной схеме дала достаточно высокие результаты (рис. 1). При 100%-й полиовуляции реакция составила 9,14 фолл./гол., выход эмбрионов, пригодных к трансплантации, достиг 68,4%.
По результатам выборки из общего стада было отобрано 12 реципиентов, у которых начало охоты по времени совпадало с началом охоты у доноров. На основании анализа литературных данных [1.3, 5, 6] и собственных предварительных исследований для улучшения приживляемости трансплантированных эмбрионов через 5 дней после операции реципиентам ввели препарат «Хорулон». Результаты трансплантации приведены ниже.
Из 12 прооперированных животных забеременело 7 (58 %). Эффективность вынашивания при этом сос-
Результаты индукции полиовуляции у овец
Всего обработано овец-доноров, гол. 5
Проявили половую охоту, гол./% 5/100
Реагировало полиовуляцией, гол./% 5/100
Реакция полиовуляции, ж.т./гол. 9,14±1,45
Положительных по извлечению доноров, гол./% 5/100,0
Извлечено эмбрионов, шт./гол. в том числе: 7,13±2,13
пригодных 4,88±0,75
непригодных 2,25±0,61
Из них неоплодотворенные яйцеклетки 1,13±0,51
Выход пригодных эмбрионов, % 68,4
Результаты трансплантации эмбрионов
Прооперировано реципиентов 12
Пересажено эмбрионов 24
Забеременело, гол./% 7/58,3
Эффективность вынашивания плода, % 100
Средний срок беременности, дни 145,4
Родилось ягнят, гол. 8
Приживляемость эмбрионов, % 33,3
Живая масса и сохранность ягнят-трансплантантов
Живая масса, кг:
при рождении 4,7±0,56
в 2 мес 16,6±0,31
к отбивке (4 мес) 21,12±0,72
Сохранность к отбивке, % 100
тавила 100 %. Эмбриональный лизис зафиксирован не был, что, вероятно, обусловлено положительным влиянием инъекции хорионгонадотропина после трансплантации. Средний срок гестации у овец-реципиентов составил 145,4 дня, что является нормой для этого вида животных.
Ягнята-трансплантанты росли и развивались без отклонений, соответственно нормам породы, при 100%-й сохранности поголовья (рис. 2, 3). Масса ягнят при рождении в среднем составила 4,7 кг. В первые два месяца суточный прирост составлял 198 г, в последующие два месяца до отбивки — 75 г.
Иммунологические и биохимические показатели крови ягнят в возрасте 4 мес показаны в таблицах 1 и 2. Все исследуемые показатели находились в пределах нормы.
Таким образом, несмотря на достаточно высокие для технологии трансплантации эмбрионов у овец уровень имплантации эмбрионов и эффективность вынашивания, приходится констатировать довольно низкую приживляемость эмбрионов (из 24 пересаженных эмбрионов родилось 8 ягнят, что составляет 33 %).
Согласно результатам предыдущих исследований, этот показатель не поднимался выше полученного [8, 10]. В собственных экспериментах мы, как правило, во время трансплантаций (как овец, так и коз) пересаживали по 2 эмбриона в один рог (соответ-
Результаты апробации усовершенствованного метода трансплантации эмбрионов у овец: анализ приживляемости зигот, эффективности вынашивания плода и развития ягнят-трансплантантов
1. Гематоиммунные показатели ягнят-трансплантантов
Показатели Лейкоциты, 109/л Эритроциты, 1012/л Гемоглобин, г/л Гематокрит, % Средний оъем эритроцита, фл Среднее содержание гемогобина в 1 эритроците, пг Среднее содержание гемоглобина во всех эритроцитах, г/л Ширина распределения эритроцитов по объему, %
M±m 12,56±0,28 16,72±0,19 76±6,20 23,9±1,18 18,6±0,28 6,6±0,13 359±25,15 19,5±2,26
Норма [4] ,0 4, ,0 5, 8, 3 о 9 о 8 о 5 23,0...35,0 ,0 LO 2 ,0 14, ,0 8, ,0 5, 300.390 ,0 0, 2 ,0 0,
2. Биохимические показатели сыворотки крови ягнят-трансплантантов
Поазатели Значения , М±m Норма [4]
Билирубин общий, ммоль/л 2,2±0,05 1,7...4,3
АлАТ, Ед/л 28,4±0,61 2 5 5
АсАТ, Ед/л 101,3±15,19 66.230
ГГТ, Ед/л 28,15±2,11 2 о 5 о
Щелочная фосфатаза, Ед/л 72,7±7,71 9 8 61
Креатининкиназа, Ед/л 26,4±3,15 6 4 со
Глюкоза, ммоль/л 2,8±1,11 ,2 4, 2,
Общий белок, г/л 63,34±4,15 61.75
Альбумин, г/л 30,8±2,89 6 3 3 2
Мочевина, ммоль/л 5,58±0,16 ,2 9, ,5 4,
Креатинин, моль/л 72,15±5,36 5 3 0 6
Холестерин, ммоль/л 1,7±0,13 1,7...3,5
Кальций, ммоль/л 3,12±0,10 ,9 2, ,3 2,
Магний, ммоль/л 0,89±0,03 ,2 ,9 0,
Фосфор, ммоль/л 2,34±0,07 1,2...3,1
ствующий овулировавшему яичнику) и только в случае наличия овуляций в обоих яичниках эмбрионы пересаживали в оба рога (частота составляет при синхронзированной охоте реципиентов с донорами 6.16 %, при естественной охоте достигает 20 %). В настоящем эксперименте с двойной овуляцией была только одна овца, она же и родила единственную двойню. Другие же реципиенты, несмотря на введение им двух жизнеспособных эмбрионов, рождали одинцов.
В связи с этим, можно предположить, что в норме в одном роге способен, как правило, имплантироваться только один эмбрион, и пересадка второго, возможно, является излишней. Хотя данное предположение косвенно подтверждают наблюдения в хозяйствах при неплановом убое беременных овец (при двойнях плоды, как правило, располагаются в разных рогах), этот вопрос требует более детальной экспериментальной проверки.
Выводы
Трансплантация ранних эмбрионов у овец по приведенной методике с инъекцией реципиентам хорион-гонадотропина (препарат «Хорулон») через 5 дней после операции обеспечила довольно высокий процент наступления беременности (58 %). Эффективность вынашивания плода составила 100 %. Приживляе-мость эмбрионов оставалась недостаточно высокой и
SUMMARY P.V. Aksenovа
North-Caucasian Zonal Research Veterinary Institute
составила 33 %, что вероятно, объясняется нецелесообразностью пересадки второго эмбриона в один и тот же рог. Рост и развитие ягнят-трансплантантов соответствовали породе. Отклонений в изучаемых гематологических и биохимических показателях не наблюдали.
Библиография
1. Bellinge, B.S. The influence of patient insemination on the implantation rate in an in vitro fertilization and embryo transfer program / Bellinge, B.S., Copeland, C.M., Thomas, T.D. et al. // Fertil. Steril. — 1986. — N. 46. — P. 252-256.
2. Compositions and methods for culturing embryos and oocytes, patent number: W02007012117, publication date:2007-02-01, inventor: Roberts Claire Trelford (AU), applicant: Adelaide Res & Innovation pty (au); Roberts Claire Trelford (Au), classification: international: C12N5/02; A61K38/30; C12N5/08; C12N5/02; A61K38/30; C12N5/08; european: C12N5/06B2E; C12N5/06B4F, application number: WO2006AU01042 20060727, priority number(s): AU20050903997 20050727.
3. Coulam, C.B. Effect of seminal plasma on implantation rates. Coulam, C.B. and Stern, J.J. Early Pregnancy. — 1995. — N. 1. — P. 33-36.
4. http://www.vetyakutsk.ru/физиологические-показатели-животных/
5. Pellicer, A. Lower implantation rates in high responders: evidence for an altered endocrine milieu during the preimplantation period / A. Pel-licer, D. Valbuena, F. Cano et al. // Fertil. Steril. — 1996. — N. 65. — P. 1190-1195.
6. Warnes, G.M. Reduced pregnancy rates following the transfer of human embryos frozen or thawed in culture media supplemented with normal serum albumin / G.M. Warnes, D. Payne, R. Jeffrey et al. // Hum. Reprod., 1997. — N. 12. — P. 1525-1530.
7. Айбазов М.М., Аксенова П.В. Возможность и перспективы получения первичных трансгенных животных - продуцентов белков человека //Овцы, козы, шерстяное дело. — 2012. — № 3. — С.33-35.
8. Айбазов М.М., Аксенова П.В. Трансплантация эмбрионов у молочных коз // Culegere de lucrari a Simpozionului stiintific cu participare internationala consacrat aniversarii a 55 de la fondarea Institutului «Realizari si perspective in zootehnie, biotehnologii si medicina veterinara», 6-8 octombrie, Maxi-movca, 2011. — C. 286-290.
9. Аксенова П.В., Айбазов М.М., Коваленко Д.В. Биотехнологические методы и приемы интенсификации воспроизводства овец и коз // Овцы, козы, шерстяное дело. — 2012. — № 2. — С. 35-38.
10. Аксенова, П.В. Научные основы интенсификации воспроизводства коз: автореф. дис. ... докт. биол. наук: защищена 21.12.2012: утв. 10.06.2013 / П.В. Аксенова.— Новочеркасск: МП Книга, 2012. — 51 с.
11. Аксенова П.В., Айбазов М.М., Коваленко Д.В. Техника пересадки эмбрионов у коз // Materialy VI miedzynarodowej naukowi-praktyznej konferencji «Dynamika naukowych badac — 2010, Vol.9 Medycyna Nauk, Biologicznych Chemia i chemiczne technologie, Ekologia, Geografia i geologia, Rolnictwo Weteri-naria». — Przemysl: Nauka i studia, 2010, — C. 35-39.
Approval Results of the Improved Method of the Embryos Transplantation in Sheep: Analysis of Zygotes Adaptability, Effectiveness of Gestation, Growth and Development of lambs. In an experiment on sheep were obtained and transplanted embryos from donors to recipients. Was studied the growth and development of lambs-transplants. With 100 % superovulation the reaction was 9,14 follicules on the ewe. The embryos yield of transplantation was 68,4 %. 58 % of the recipients were pregnant, embryo implantation — 33,3 %. Lambs-transplants grew and developed without deviation, respectively breed standards, immune and biochemical blood indices were within the norms.
