CC BY
71
Г.Ш. Исаева и соавт. Антибиотикорезистентность H. pylori
УДК 616.36-092:579.835.12
Резистентность H. pylori к антибактериальным препаратам и методы ее определения
Г.Ш. Исаева
Кафедра микробиологии Казанского государственного медицинского университета, Казань, Россия
Во всем мире, в том числе в нашей стране, отмечена тенденция к распространению первичной, вторичной и множественной устойчивости H. pylori к антибактериальным препаратам, что значительно снижает эффективность противохе-ликобактерной терапии. Выявлены существенные различия в уровнях антибиотикорезистент-ности H. pylori в различных регионах России, что указывает на назревшую необходимость проведения многоцентровых исследований. Широкое внедрение молекулярно-генетических методов исследований в практических лабораториях позволит выявлять циркуляцию резистентных штаммов и динамику их распространения, оценивать
результаты эрадикационной терапии и, возможно, в будущем определять группы больных с определенными генотипами, определяющими резистентность к стандартным схемам проти-вохеликобактерной терапии. В статье представлен обзор современных представлений о распространении антибиотикорезистентности Helicobacter pylori, ее механизмах и методах определения чувствительности этого микроорганизма к антибактериальным препаратам.
Ключевые слова: H. pylori, антибиотикорезистентность, механизмы, эффлюкс, определение чувствительности.
Antimicrobial Resistance of H. pylori and Susceptibility Determination Methods
G.Sh. Isaeva
Department of Microbiology, Kazan State Medical University, Kazan, Russia
At present, primary, secondary, and multiple resistance of H. pylori to antimicrobial agents tends to increase, which significantly affects efficacy of eradication therapy. There were found significant differences in antimicrobial resistance of H. pylori between Russian regions, which indicate a need for multicenter epidemiological studies. A common use of molecular methods in clinical laboratory practice would allow detection of resistant strains and their
Контактный адрес: Гузель Шавхатовна Исаева Эл. почта: [email protected]
prevalence changes, assessment of H. pylori eradication therapy outcomes and, possibly, identification of patient populations with specific genotypes conferring resistance to standard regimens for eradication. This paper provides a review of currently available data on antimicrobial resistance of H. pylori and its mechanisms as well as susceptibility determination methods for this pathogen.
Key words: H. pylori, antimicrobial resistance, mechanisms, efflux, susceptibility determination.
Г.Ш. Исаева. Антибиотикорезистентность H. pylori
Открытие в 1984 году роли бактерии Helicobacter pylori в развитии хронического гастрита перевернуло представления об этиологии ряда болезней желудочно-кишечного тракта. Это дало мощный импульс для дальнейших исследований в различных областях медицины: микробиологии, гастроэнтерологии, иммунологии, генетики, эпидемиологии, фармакологии. В настоящее время доказано, что в результате использования эрадикационной терапии снижается риск язвенных кровотечений, развития онкологических заболеваний желудка (аденокарциномы, MALT-лимфомы). Но наряду с успехами антибактериальной терапии H. pylori-инфекции в мире отмечена тенденция к распространению штаммов H. pylori, резистентных ко многим препаратам, используемым в схемах лечения.
Антибиотикорезистентность H. pylori
При изучении антибактериального действия различных антимикробных препаратов было выявлено, что клинические изоляты H. pylori чувствительны ко многим ß-лактамам, фосфомицину, макролидам, аминогликозидам, тетрациклинам, хлорамфениколу, рифамицинам, фторхинолонам, нитроимидазолам и нитрофуранам [1]. Все вышеназванные антимикробные препараты применялись с целью эрадикации H. pylori, за исключением хло-рамфеникола (из-за высокой токсичности) и ами-ногликозидов (в связи с отсутствием активности транспорта в микроаэрофильных условиях). Соли висмута и ингибиторы протонной помпы также обладают противохеликобактерной активностью при условии создания высоких концентраций, что не выполнимо in vivo. Рекомендованные схемы для эрадикации H. pylori включают два антимикробных препарата и один антисекреторный препарат, преимущественно ингибитор протонной помпы, к которым могут быть добавлены соли висмута [2].
Однако в последние годы при проведении эра-дикационной терапии одной из существенных проблем, влияющих на результат лечения, стала резистентность H. pylori к антибактериальным препаратам. Известно, что устойчивость микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам может быть природной (видовой), обусловленной отсутствием мишени для действия антибиотика, и приобретенной в результате мутаций или генетических рекомбинаций. На основе исследований, проведенных in vitro, было установлено, что H. pylori имеет природную устойчивость к гликопептидам (ванкомицину), сульфаниламидам, полимиксину, хинолонам первого поколения (налидиксовой кислоте), тримето-приму, противогрибковым препаратам (нистатину,
амфотерицину В) и циклогексимиду [1]. Эти препараты применяют в качестве ингибиторов роста посторонней микрофлоры при создании селективных и транспортных сред для культивирования H. pylori. Механизм приобретенной резистентности H. pylori связан преимущественно с возникновением точечных мутаций, а не с передачей R-плазмид и транспозонов. Также возможно приобретение резистентности путем трансформации при условии обитания двух разных штаммов H. pylori в желудке одного больного.
Как и у многих бактерий, у H. pylori возможно снижение чувствительности к ряду антибиотиков за счет механизма эффлюкса. Основной функцией эффлюкс-систем является выведение токсических субстанций, в том числе и антибиотиков, с помощью специальных эффлюкс-помп. Эффлюкс-помпы -это транспортеры белковой природы, локализованные в цитоплазматической мембране у всех клеток, как прокариот, так и эукариот. Активные, так называемые первичные, транспортеры нуждаются в источниках энергии для выполнения своих функций: они используют энергию, освобождающуюся при гидролизе аденозинтрифосфата. Пассивные, или вторичные, транспортеры функционируют без затраты энергии за счет разницы электрохимического потенциала, создаваемой при откачке ионов водорода и натрия. Эти эффлюкс-системы играют важную роль в возникновении множественной лекарственной устойчивости [3]. Генетические детерминанты эффлюкс-помп могут располагаться не только на хромосомах, но и на плазмидах или транспозонах, что обуславливает легкость передачи этих генов. Антибиотики выступают в качестве индукторов или регуляторов экспрессии генов, кодирующих эффлюкс-системы, и проводят селективный отбор штаммов, обладающих этими механизмами.
В литературе имеются единичные сообщения об обнаружении эффлюкс-механизма резистентности к антибиотикам у H. pylori. D. Dailidiene и соавт. предположили, что резистентность H. pylori к тетрациклину может быть результатом мутации, нарушающей сродство тетрациклина к рибосоме, и/ или результатом действия эффлюкс-помпы, выкачивающей этот антибиотик из клетки [4]. У штаммов H. pylori с индуцибельной резистентностью к тетрациклину в 2006 году был найден ген резистентности к тетрациклину HP1165, идентичный гену tetA Clostridium perfringens, ответственному за механизм эффлюкса тетрациклина из клетки [5]. Механизм эффлюкса TolC может играть роль в резистентности H. pylori к метронидазолу [6]. Описано несколько белков эффлюкс-систем H. pylori, возможно
Г.Ш. Исаева и соавт. Антибиотикорезистентность H. pylori
играющих роль во множественной лекарственной устойчивости, но их роль окончательно не выяснена [7, 8].
Эти данные достаточно противоречивы. Так, J. Bina и соавт. [9], сравнив три эффлюкс-системы H. pylori с уже изученными у таких бактерий, как Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa, заключили, что этот механизм несколько отличается от присущего для грамотрицательных бактерий и не может играть большой роли во множественной лекарственной устойчивости. C. DeLoney и соавт. [10] исключили возможность участия механизма эффлюкса в резистентности к амоксициллину. Но независимо от резистентности к антибиотикам эффлюкс-системы H. pylori играют важную роль в сохранении гомеостаза ионов металлов, необходимого для адаптации этой бактерии в слизистых оболочках [11].
Приобретенную резистентность H. pylori подразделяют на первичную и вторичную: первичная имеет место до применения антибактериальных препаратов для эрадикации H. pylori, а вторичная - после неудачной эрадикационной терапии. В настоящее время описана резистентность H.pylori фактически ко всем препаратам, применяемым для эрадикационной терапии - макролидам, 5-нитрои-мидазолам, тетрациклинам, амоксициллину, фтор-хинолонам, рифампицину и фуразолидону.
Резистентность к макролидам. Механизм действия макролидов связан с нгибированием синтеза белка на уровне рибосом. Точкой приложения их действия является «петля» пептидилтрансфера-зы V домена 23S рРНК. Резистентность H. pylori к макролидам связана с точечной мутацией в гене 23S рРНК в двух позициях 2142 (A2142G и А2142С) и 2143 (A2143G), что приводит к изменению конфигурации рибосомы и снижению сродства антибиотика к мишени [12].
Из макролидов наибольшее использование в схемах эрадикационной терапии имеет кларитро-мицин в связи с низкой минимальной подавляющей концентрацией (МПК - 0,25 мг/л) против H. pylori и хорошими фармакодинамическими свойствами (отсутствие повышения МПК при снижении рН, что важно в кислой среде желудка). В начале 90-х годов ХХ столетия появились единичные сообщения о кларитромицинорезистентных штаммах, а во второй половине 90-х годов наметилась тенденция к увеличению числа таких штаммов. В настоящее время устойчивость H. pylori к кларитромицину варьирует в различных странах и регионах от 0 до 20-25%. В США количество резистентных к кларитромицину изолятов увеличивалось с 4% в 1993-1994 гг. до 12,6% в 1995-1996 гг. [13], сей-
час находится на уровне 10-15% в зависимости от штата [14]. Многоцентровое европейское исследование, проведенное в 17 странах, показало, что средний уровень резистентности к кларитромици-ну составляет 9,9% при значительных колебаниях в зависимости от региона, например на севере Европы - 9,3%, а на юге - 18% [15]. Исследование, проведенное в Италии, показало увеличение в 2 раза количества штаммов, устойчивых к кларитро-мицину, за последние 15 лет: c 10,2% до 21,3% c преобладанием мутации A2143G [16]. При этом распространенность кларитромицинорезистентных штаммов выше у детей, чем у взрослых, что может быть связано с более частым использованием мак-ролидов у детей для лечения респираторных заболеваний [17]. Так, резистентность к кларитроми-цину штаммов H. pylori, выделенных от детей во Франции, выросла с 18,6% в 1993-1996 гг. до 41,6% в 2001-2004 гг. [18].
В России количество устойчивых к кларитро-мицину штаммов возросло с 8% в 1997 г. до 14,4% в 1998 г. и к 1999 г. уровень приблизился к среднеевропейскому - 17,1% [19]. Но в 2000 г. наметилась тенденция к снижению уровня резистентности H. pylori к кларитромицину (16,6%), которая продолжилась и в 2001 г. (13,8%) [20]. В России это может быть связано с заменой кларитромицина на более дешевые препараты в схемах эрадикацион-ной терапии и ограничением его использования в виде монотерапии при лечении других инфекций. Однако наиболее вероятно это связано с незначительным количеством штаммов, исследованных в нашей стране.
Резистентность к кларитромицину оказывает большое влияние на эффективность эрадикации. При терапии по схеме ингибитор протонной помпы + кларитромицин + амоксициллин эрадикация составляла 87,8% при чувствительности H. pylori к кларитромицину, а при резистентности к нему - 18,3%, т.е. эффективность снижалась на 70% [21].
Резистентность к нитроимидазолам. Из нит-роимидазолов для лечения H. pylori используют метронидазол и тинидазол. К обоим препаратам имеется перекрестная резистентность. Мишенью для их действия является структура ДНК. Чтобы стать активным, метронидазол должен проникнуть внутрь клетки. Там NO2 группа восстанавливается в форму гидроксиламинового производного. Восстановленная форма вызывает повреждение ДНК и гибель бактерии. В основе генетических механизмов резистентности лежит мутация гена rdxA, кодирующего синтез кислород-нечувствительной нитроредуктазы, влияющей на превращение препарата в активную форму [22]. Другие
Г.Ш. Исаева. Антибиотикорезистентность H. pylori
белки, такие как флавиноксиредуктазы, кодируемые геном frA, могут быть также вовлечены в процесс восстановления [23]. Кроме того, эффлюкс-помпа TolC может играть роль в резистентности к этой группе препаратов [6].
Мировое распространение резистентности H. pylori к метронидазолу имеет широкие границы. Так, в США и в Европе устойчивость к этому препарату находится в пределах от 20 до 40% [21, 24]. По данным многоцентрового европейского исследования, резистентность к метронидазолу составляла 33,1%, достигая в Южной Европе 40,8% [15]. В Японии отмечают наиболее низкий процент метро-нидазолорезистентных штаммов H.pylori (9-12%), что связывают с редким применением этого препарата [25]. Наивысший уровень распространенности резистентности к метронидазолу отмечают в развивающихся странах, где он составляет 50-80% [26, 27]. Первичная резистентность к метронида-золу в этих странах связана с широким применением этого препарата при лечении протозойных инфекций, в частности амебиаза. При применении метронидазола с целью эрадикации H. pylori часто развивается вторичная резистентность [28].
В России наблюдения за резистентностью к метронидазолу проводятся с 1996 года, когда было обнаружено превышение среднеевропейских показателей - 36,1%, с последующим ростом в 1997 г. до 42%, а в 1999 г. их количество достигло 56,5%. Затем, по данным Российской группы по изучению H. pylori, показатели резистентности к метронида-золу стабилизировались на уровне 55% в 2001 г. [19, 20]. Причиной высокой первичной резистентности H. pylori к метронидазолу в России может быть широкое использование этого препарата при лечении гинекологических заболеваний. В отдельных регионах продолжается рост числа устойчивых штаммов. Наивысший уровень резистентности к метронидазолу был зарегистрирован в Абакане - 79,4% [20]. Это, возможно, связано с широким применением производных 5-нитроимидазола для лечения описторхоза, эндемичного заболевания для этого региона.
Разброс показателей может быть связан с тем, что резистентность к метронидазолу находится под влиянием анаэробиоза. Установлено, что резистентность к метронидазолу исчезает, если штаммы предварительно инкубировали в течение 4 часов в анаэробных условиях [29]. Достигнутый таким образом низкий окислительно-восстановительный потенциал ведет к ускоренному восстановлению метронидазола и появлению его активной формы. Находясь в своей экологической нише - слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, H. pylori
периодически попадает в анаэробные условия, что объясняет успешную эрадикацию у ряда больных с метронидазолорезистентными штаммами. Так, при лечении по схеме: ингибитор протонной помпы + кларитромицин + амоксициллин или метронидазол - эрадикация составляла 97% при чувствительности H. pylori к кларитромицину и метронидазолу, а при резистентности к метронидазолу - 72,6%, т. е. эффективность снижается только на 25% [21, 30]. Активация анаэробных метаболических путей, которые не функционируют в микроаэрофиль-ных условиях, может быть причиной нестабильной резистентности, выявляемой при определении чувствительности H. pylori к метронидазолу in vitro, так как атмосфера инкубации во время культивирования полностью не контролируется. Большинство исследований показало отсутствие внутрилабора-торной воспроизводимости опытов по исследованию чувствительности H. pylori к метронидазолу [31].
Резистентность к бета-лактамам. Амино-пенициллиновый бета-лактам амоксициллин широко используется в схемах, направленных на эради-кацию H. pylori. Антибиотик действует на синтез пептидогликана, блокируя пенициллинсвязываю-щие белки. У небольшого количества штаммов обнаружена мутация в гене pbplA. Связь резистентности к амоксициллину с множественными мутациями в гене pbplA подтверждена независимыми исследованиями [32, 33]. Замена аминокислот Ser^Arg приводит к блокаде пенициллинового транспорта [34].
Случаев развития резистентности к амокси-циллину при его клиническом применении пока официально не зарегистрировано, однако имеются сообщения о возрастании минимальной подавляющей концентрации (МПК) амоксициллина с 0,03 мг/л до 0,25-0,5 мг/л. Механизм такой относительной толерантности к амоксициллину может быть связан с отсутствием четвертого пенициллин-связывающего белка, названного PBP-D (penicillin binding protein-D) [35]. В целом, резистентность к амоксициллину встречается крайне редко (не более 1%) [36]. Российской группой по изучению H. pylori было выделено три амоксициллинорезистентных штамма в 1996 году, в последующие годы таких штаммов выделено не было [19, 20].
Резистентность к тетрациклинам. Тетра-циклины действуют на синтез белка на уровне рибосом путём связывания с 30S субъединицей. Резистентность к тетрациклинам, вероятно, связана с изменением нуклеотидного триплета AGA-926 на 928^TTC, сходного с изменением в позиции 965^967 у E. coli, что приводит к модификации
Г.Ш. Исаева и соавт. Антибиотикорезистентность H. pylori
мишени для связывания тетрациклинов - петли hi [37]. Одиночная или двойная мутация в этих позициях приводят к формированию промежуточных значений МПК [4, 38]. Необходимость наличия трех замен нуклеотидных оснований может объяснять редкость развития резистентности к тетра-циклинам. Описаны и тетрациклинорезистентные штаммы H. pylori, у которых отсутствовала мутация в позиции 926^928, но обнаружен механизм эффлюкса. У этих штаммов было снижено накопление антибиотика внутри клетки [39].
Резистентность H. pylori к тетрациклину в мире находится на низком уровне. Впервые единичные штаммы, устойчивые к этому препарату, были обнаружены в Австралии [40]. В России тетрациклино-резистентные штаммы H. pylori не выделены [19, 20]. В мире резистентность к тетрациклину составляет менее 1%, за исключением Южной Кореи, где она достигает 5,3% [41].
Резистентность к фторхинолонам. Фтор-хинолоны не являются обязательными компонентами схем эрадикационной терапии, рекомендованных III Маастрихтским консенсусом, но относятся к препаратам для терапии после неудачной эрадикации [2]. Мишенью действия фторхиноло-нов является фермент ДНК-гираза, ответственная за суперспирализацию ДНК, а именно субъединица А ДНК-гиразы, кодируемая геном gyrA. Резистентность к фторхинолонам H. pylori связана с изменениями нуклеотидных последовательностей в гене gyrA в позиции 87 или 91 [42].
В последнее время фторхинолоны широко используют для лечения многих заболеваний, что привело к высокому распространению первичной устойчивости H. pylori к этой группе препаратов. Так, в Португалии она составляет 20% [43]. Введение ципрофлоксацина в схемы лечения H. pylori в качестве резервного препарата привело к формированию вторичной резистентности, частота которой, по результатам немецких исследователей, составляет 9% [28].
Резистентность к рифамицинам. Рифами-цины ингибируют субъединицу В ДНК-зависимой РНК-полимеразы, кодируемой геном groB. Мутации этого гена в позициях 524, 525, 585, описанные у H. pylori, такие же как у Mycobacterium tuberculosis и E. coli [44]. Также ранее обнаружена мутация в позиции 149 [45]. Устойчивость H. pylori к рифампицину практически не встречается, так как этот антибиотик используется ограниченно.
Резистентность к нитрофуранам. Нитро-фураны, являясь акцепторами кислорода, нарушают клеточное дыхание бактерий и ингибируют биосинтез нуклеиновых кислот. В Китае обнару-
жена резистентность к фуразолидону на уровне 8,7% и идентифицировано 6 мутаций в генах porD и oorD у фуразолидонорезистентных изолятов [46]. Нитрофураны широко используются при лечении кишечных инфекций, воспалительных заболеваний нижних отделов мочевыделительной системы, вызванных грамотрицательными бактериями, и протозойных инфекций, в частности лямблиоза и трихомониаза. Это может обуславливать развитие первичной резистентности к фуразолидо-ну. Фуразолидон включают в схемы лечения при безболевых формах впервые диагностированной неосложненной язвенной болезни и при лечении хронического гастрита (по желанию больного) в комбинации с коллоидным субцитратом висмута (де-нол) и антибиотиком (амоксициллином) [47]. Хотя этот химиотерапевтический препарат, обладающий противохеликобактерной активностью, не входит в рекомендованные схемы эрадикационной терапии «первой линии», но его низкая стоимость удешевляет курс лечения, что обуславливает его использование в странах с низким доходом населения. Это обстоятельство может привести к быстрому формированию вторичной резистентности к фуразолидону.
Полирезистентность. В последние годы растет количество полирезистентных штаммов, устойчивых к препаратам, применяемым для эрадикации - метронидазолу и кларитромицину. Появление таких штаммов оказывает негативное влияние на эффективность эрадикационной терапии. По данным F. Megraud, при терапии 14 пациентов с полирезистентными штаммами у 9 из них эрадикация не наступила [21]. Рост штаммов, одновременно резистентных к кларитромицину и метронидазолу, может быть обусловлен широким применением этих антибиотиков в одной схеме эрадикационной терапии. Причиной популярности этой схемы эра-дикации являются высокие показатели излечения от H. pylori-инфекции - 90% при условии чувствительности H. pylori к обоим препаратам. Согласно рекомендациям III Маастрихтского Консенсуса (2005 г.) рекомендуемой терапией первой линии для популяций с количеством резистентных штаммов к кларитромицину менее 15-20% является следующая схема: ингибитор протонной помпы+кла-ритромицин+амоксициллин. В популяциях с частотой резистентности к метронидазолу менее 40% предпочтительнее другая схема: ингибитор протонной помпы+кларитромицин+метронидазол [2].
За первые три года наблюдений в России количество полирезистентных штаммов практически не изменялось и было на уровне 5,5% в 1996 г. и 6% в 1998 г. [19]. Этот период характеризовался
Г.Ш. Исаева. Антибиотикорезистентность H. pylori
бурным ростом устойчивости к метронидазолу, но в то же время резистентность к кларитромицину росла медленно. Но как только Россия достигла европейского уровня кларитромицинорезистент-ности, соответственно сразу же возникла тенденция к росту полирезистентности: 8,5% в 1999 г., 10% - в 2000 г., 11,2% - в 2001 г. [20, 47].
Типирование резистентных штаммов H. pylori. Результаты генотипирования штаммов H. pylori позволяют спрогнозировать не только эпидемиологические показатели заболеваний, ассоциированных с H. pylori-инфекцией, но и предсказать их динамику в результате лечения. Большой научный интерес представляет изучение чувствительности H. pylori к антимикробным препаратам и факторов патогенности [48]. К.И. Пюрвеева и соавт. при изучении неудачных случаев эрадикации выявили зависимость между генотипами H. pylori и наличием генов резистентности к кларитромицину [49]. De Francesco V. и соавт. обнаружили ассоциацию между CagA и VacA положительным статусом H. pylori и кларитромицинорезистентностью с помощью ПЦР в реальном времени [50]. Группа исследователей из Арабских Эмиратов под руководством S.A. Mubarak сообщила, что мутации гена резистентности к кларитромицину в позициях A(2142/43)G строго ассоциированы с генами патогенности сagA и vacA [51]. Исследования в этой области перспективны. Возможно, они позволят выделять группу или группы больных с определенными генотипами с высоким риском неудачной эрадикации и разработать мероприятия, позволяющие её избежать.
Методы определения чувствительности H. pylori к антимикробным препаратам
Фенотипическое определение чувствительности H. pylori к антибактериальным препаратам. Методы для определения чувствительности H. pylori к антимикробным препаратам были предложены Институтом по клиническим лабораторным стандартам США (NCCLS) [52]. Европейская группа по изучению H. pylori опубликовала методики, в целом сходные с американскими [31].
Метод серийных разведений на твердых питательных средах может быть использован в упрощенном варианте для тестирования влияния определенных концентраций антибиотиков на штаммы H. pylori. Например, по отношению к кларитромицину изоляты H. pylori делят на чувствительные (<0,25 мг/л), умеренно резистентные (0,5 мг/л) и резистентные (>1 мг/л). Поэтому для упрощенного тестирования рекомендовано исполь-
зовать две среды с концентрациями 0,25 и 1 мг/л. Пограничные концентрации для других антибиотиков: тетрациклин - 2 мг/л, рифабутин - 1 мг/л, ципрофлоксацин - 1 мг/л, метронидазол - 8 мг/л и т.д.
Метод разведения в жидких питательных средах имеет некоторые преимущества по сравнению с методом разведения на плотных средах - это возможность автоматизации учета результатов, но в связи с трудностью культивирования H. pylori в бульоне этот метод менее распространен [53-55].
Диско-диффузионный метод может быть использован для тестирования большинства химио-терапевтических препаратов, исключая метронида-зол. Активация анаэробных метаболических путей, которые не функционируют в микроаэрофильных условиях, может быть причиной нестабильной резистентности H. pylori к метронидазолу [29]. Задержка между приготовлением среды и началом проведения этого теста может привести к изменению окислительно-восстановительного потенциала среды, что ограничивает использование этого метода для метронидазола. Наилучшие результаты получены при тестировании макролидов [56].
E-тесты имеют преимущества в сравнении с диско-диффузионным методом, поскольку позволяют определить непосредственно минимальную подавляющую концентрацию. Причем результаты, полученные с помощью Е-тестов, кореллиру-ют с результатами, полученными методами серийных разведений в плотных и жидких средах [31]. Ограничением использования E-теста в практических лабораториях является его высокая стоимость.
Генотипическое определение чувствительности H. pylori к антибактериальным препаратам. Точечные мутации в ДНК H. pylori, связанные с формированием антибиотикорезистентности, могут быть обнаружены с помощью молекуляр-но-генетических методов. В настоящее время для определения генетических маркеров резистентности H. pylori предложены различные подходы, включая методы гибридизации с олигонуклеотидными зондами, анализ полиморфизма длины рестрикци-онных фрагментов продуктов ПЦР (ПЦР-ПДРФ) и методы ПЦР в реальном времени.
ПЦР-ПДРФ был одним из первых методов, использованных для определения мутаций в гене 23S рРНК H. pylori, связанных с резистентностью к кларитромицину. Метод основан на амплификации участка 23S рДНК и селективном расщеплении ПЦР-продуктов с помощью эндонуклеаз рестрикции, распознающих сайты мутаций. Так, рестрикция с использованием эндонуклеаз BsaI и BsbI была использована для детекции нуклеотид-
Г.Ш. Исаева и соавт. Антибиотикорезистентность H. pylori
ных замен A2142G и A2143G [57], а впоследствии расщепление эндонуклеазой BceAI предложено для определения мутации A2142C [58].
ПЦР в реальном времени с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET) была разработана для определения мутаций резистентности к кларитромицину у штаммов H. pylori, выделенных в чистой культуре [59], а позднее использована для выявления соответствующих мутаций непосредственно в биоптатах [60]. Благодаря высокой чувствительности метод может быть также использован для анализа образцов кала [61] и проведения неин-вазивного обследования детей [62]. Идентификация мутаций осуществляется с помощью постампли-фикационного анализа кривых плавления зондов. Различия в температуре плавления (Tm) зондов позволяют дифференцировать кларитро-мициночувствительные (Tm=62 °С) и резистентные штаммы с мутациями: А2142С (Tm=58 °С), A2143G (Tm=53 °С) и A2142G (Tm=54 °С). Этот метод имеет неоспоримые преимущества: быстрота (результат может быть получен через 2 часа) и отсутствие дополнительных манипуляций с ампли-конами, что снижает риск контаминации.
Молекулярно-генетические методы исследования резистентности H. pylori разработаны и для других антибиотиков. В частности, описаны методы ПЦР в реальном времени с использованием FRET зондов [63] и аллель-специфичной ПЦР [64] для обнаружения резистентности H. pylori к фтор-хинолонам, а также ПЦР-ПДРФ для определения мутаций устойчивости к тетрациклинам [65].
Гистологический метод. Методику флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) для выявления чувствительности к кларитромицину в биопта-тах впервые предложили использовать K. Trebesius и соавт. в 2000 г. [66]. Этот метод позволяет обнаружить H. pylori с помощью зонда к участку видоспе-цифической последовательности 16S рРНК, меченного флюорохромом Cy3, и второго флюоресцин-меченного зонда к участку последовательности 23S рРНК, несущему мутации резистентности к кла-ритромицину. Визуализация результатов осуществляется с помощью флюоресцентного микроскопа. Эту методику можно использовать при исследовании гистологических препаратов, зафиксированных формалином или после парафиновой заливки [67, 68].
Серологические методы определения чувствительности H. pylori к антибактериальным препаратам. Серологические методы основаны на обнаружении белка RdxA H. pylori - маркера гена резистентности к метронидазолу. Известно, что в основе генетических механизмов резистентности H. pylori к метронидазолу лежит мутация гена rdxA, кодирующего синтез кислород-нечувствительной нитроредуктазы, влияющей на превращение препарата в активную форму [22]. Для детекции этого гена предложено обнаружение его продукта - белка RdxA (24 kDa) с помощью иммуноблотинга с использованием кроличьей сыворотки, содержащей специфические анти-RdxA антитела. Этот метод позволяет визуализировать полосу, соответствующую полосе RdxA белка у метронидазолочув-ствительных штаммов и её отсутствие у метронида-золорезистентных. Количество ложноположитель-ных результатов составляет 10% [69].
Заключение
Во всем мире и в нашей стране отмечена тенденция к распространению резистентности H. pylori к антибактериальным препаратам, рекомендованным для эрадикации. Устойчивость H. pylori к проти-вохеликобактерной терапии значительно снижает её эффективность и приводит к формированию вторичной и множественной резистентности. Выявлены существенные различия в уровнях резистентности H. pylori к антимикробным препаратам в различных регионах нашей страны, что отражает и мировые тенденции. Эти факты указывают на назревшую необходимость проведения многоцентровых исследований по изучению резистентности H. pylori в регионах России. Широкое внедрение молекулярно-генетических методов исследований в практических лабораториях позволит выявлять циркуляцию резистентных штаммов и динамику их распространения, оценивать результаты эради-кационной терапии и, возможно, в будущем определять группы больных с определенными генотипами, резистентными к стандартным схемам противохе-ликобактерной терапии. Клинический мониторинг даст возможность прогнозировать эффективность противохеликобактерной терапии и разрабатывать альтернативные схемы лечения, что повысит качество и продолжительность жизни больных.
Литература
1. Megraud F. Resistance of Helicobacter pylori to antibiotics. / In: Scarpignato C., Bianchi Porro G. Clinical pharmacoloy and therapy of Helicobacter pylori infection. Prog Basic Clin Pharmacol 1999; 11:329-45.
2. Malfertheiner P., Megraud F., O'Morain C., et al. Current concepts in the management of Helicobacter pylori infection - The Maastricht III Consensus Report. Gut 2006; 10.
3. Saidijam M., Benedetti G., Ren Q., et al. Microbial drug efflux proteins of the major facilitator superfamily. Curr Drug Targets 2006; 7:793-811.
4. Dailidiene D., Bertoli M.T., Miciuleviciene J. Emergence of tetracycline resistance in: multiple mutational changes in 16S ribosomal DNA and other genetic loci. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:3940-46.
5. Li Y., Dannelly H.K. Inactivation of the putative tetracycline resistance gene HP1165 in Helicobacter pylori led to loss of inducible tetracycline resistance. Arch Microbiol 2006; 185:255-62.
6. van Amsterdam K., Bart A., van der Ende A. Helicobacter pylori TolC efflux pump confers resistance to metronida-zole. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49:1477-82.
7. Kutschke A., de Jonge B.L. Compound efflux in Helicobacter pylori. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49:3009-10.
8. Morrison S., Ward A., Hoyle C.J., Henderson P.J.F. Cloning, expression, purification and properties of a putative multidrug resistance efflux protein from Helicobacter pylori. Int J Antimicrob Agents 2003; 22:242-9.
9. Bina J. E., Alm R.A., UriaNickelsen M., et al. Helicobacter pylori uptake and efflux: basis for intrinsic susceptibility to antibiotics in vitro. Antimicrob. Agents Chemother 2000; 44:248-54.
10. DeLoney C.R., Schiller N.L. Characterization of an in vitro-selected amoxicillin-resistant strain of Helicobacter pylori. Antimicrob Agents Chemother 2000; 44:3368-73.
11. Stahler F.N., Odenbreit S., Haas R., et al. The novel Helicobacter pylori CznABC metal efflux pump is required for cadmium, zinc, and nickel resistance, urease modulation, and gastric colonization. Infect Immun 2006; 74:3845-52.
12. Occhialini A., Urdaci M., Doucet-Populaire F., et al. Macrolide resistance in Helicobacter pylori: rapid detection of point mutations and assays of macrolide binding to ribosomes. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41:2724-8.
13. Meyer J.M., Silliman N.P., Wang W.J., et al. Risk factors for Helicobacter pylori resistance in the United States: the surveillance of H. pylori Antimicrobial Resistance partnership (SHARP) Study, 1993-1999. Ann Int Med 2002; 136:13-24.
14. Duck W. M., Sobel J., Pruckler J. M., et al. Antimicrobial resistance incidence and risk factors among Helicobacter pylori-infected persons, United States. Emerg Infect Dis 2004; 10:1088-94.
15. Glupczynski Y., Megraud F., Lopez Brea M., Andersen L.P. European multicentre survey of in vitro antimicrobial resistance in Helicobacter pylori. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2001; 20:820-3.
Антибиотикорезистентность
Г.Ш. Исаева. Антибиотикорезистентность H. pylori
16. De Francesco V., Margiotta M., Zulla A., et al. Prevalence of primary clarithromycin resistance in Helicobacter pylori strains over 15 year period in Italy. J Antimicrob Chemother 2007; 59:783-5.
17. Koletzko S., Richy F., Bontems P., et al. Prospective multicentre study on antibiotic resistance of Helicobacter pylori strains obtained from children living in Europe. Gut 2006; 55:1711-6.
18. Raymond J., Burucoa C., Pietrini O., et al. Clarithromycin resistance in Helicobacter pylori isolated from French children: prevalence of the different mutations and coexistence of clones harboring two different mutations in the same biopsy. Helicobacter 2007; (12):157-63.
19. Кудрявцева Л.,В., Исаков В.А., Щербаков П.Л., Ивани-ков И.О., Минаев В.И. Динамика резистентности штаммов Helicobacter pylori к антибиотикам у городского населения в России в 1996-1998 гг. В кн.: Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Ивашкин В.Т., Мегро Ф., Лапина Т.Л. - М., Триада-Х,1999, с.191-6.
20. Кудрявцева Л.В. Состояние антибиотикорезистент-ности Helicobacter pylori в России. Эксп и клин гаст-роэнтерол 2003; 3:7.
21. Megraud F. H. pylori antibiotic resistance: prevalence, importance, and advances in testing. Gut 2004; 53:1374-84.
22. Mendz G.L., Megraud F. Is the molecular basis of metro-nidazole resistance in microaerophilic organisms understood? Trends Microbiol 2002; 10:370-5.
23. Marais A., Bilardi C., Cantet F., Mendz G.L., Megraud F. Characterization of the genes rdxA and frxA involved in metronidazole resistance in Helicobacter pylori. Res Microbiol 2003; 154:137-44.
24. Osato M.S., Reddy R., Reddy S. G., et al. Pattern of primary resistance of Helicobacter pylori to metronidazole or clarithromycin in the United States. Arch Int Med 2001; 161:1217-20.
25. Perez Aldana L., Kato M., Nakagawa S., et al. The relationship between consumption of antimicrobial agents and the prevalence of primary Helicobacter pylori resistance. Helicobacter 2002; 7:306-9.
26. Nahar S., Mukhopadhyay A.K., Khan R., et al. Antimicrobial susceptibility of Helicobacter pylori strains isolated in Bangladesh. J Clin Microbiol 2004; 42:4856-8.
27. Torres J., Camorlinga Ponce M., Perez Perez G., et al. Increasing multidrug resistance in Helicobacter pylori strains isolated from children and adults in Mexico. J Clin Microbiol 2001; 39:2677-80.
28. Heep M., Kist M., Strobel S., Beck D., Lehn N. Secondary resistance among 554 isolates of Helicobacter pylori after failure of therapy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000; 19:538-41.
29. Cederbrant G., Kahlmeter G., Ljungh A. Proposed mechanism for metronidazole resistance in Helicobacter pylori. J Antimicrob Chemother 1992; 29:115-20.
30. Wheeldon T.U., Granstrom M., Hoang T.T.H., et al. Importance of the level of metronidazole resistance for the success of Helicobacter pylori eradication. Aliment Pharmacol Ther 2004; 19:1315-21.
31. Glupczynski Y., Broutet N., Cantagrel A., et al. Comparison of the E test and agar dilution method for antimi-
Г.Ш. Исаева и соавт. Антибиотикорезистентность H. pylori
crobial suceptibility testing of Helicobacter pylori. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2002; 21:549-52.
32. Gerrits M.M., van Villet A.H., Kuipers E.J., Kusters J.G. Helicobacter pylori and antimicrobial resistance: molecular mechanisms and clinical implications. Lancet Infect Dis 2006; 6:699-709.
33. Kim J.M., Kim J.S., Kim N., et al. Comparison of primary and secondary antimicrobial minimum inhibitory concentration for Helicobacter pylori isolated from Korean patients. Int J Antimicrob Agents 2006; 28:6-13.
34. Gerrits M.M., Schuijffel D., van Zwet A.A., et al. Alterations in penicillin-binding protein 1A confer resistance to beta-lactam antibiotics in Helicobacter pylori. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:2229-33.
35. Dore M. P., Graham D.Y., Sepulveda A.R. Different penicillin-binding protein profiles in amoxicillin-resistant Helicobacter pylori. Helicobacter 1999; 4:154-61.
36. Megraud F., Lehours P. Helicobacter pylori detection and antimicrobial susceptibility testing. Clinical Microbiology Reviews 2007; 20:280-322.
37. Nonaka L., Connell S.R., Taylor D.E. 16S rRNA mutations that confer tetracycline resistance in Helicobacter pylori decrease drug binding in Escherichia coli ribosomes. J Bacteriol 2005; 187:3708-12.
38. Gerrits M.M., Berning M., Van Vliet A.H.M., Kuipers E.J., Kusters J.G. Effects of 16S rRNA gene mutations on tetracycline resistance in Helicobacter pylori. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47:2984-86.
39. Wu J.Y., Kim J.J., Reddy R., et al. Tetracycline-resistant clinical Helicobacter pylori isolates with and without mutations in 16S rRNA-encoding genes. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49:578-83.
40. Midolo P.D., Korman M.G., Turnbridge J.D., et al. Helico-bacter pylori resistance to tetracycline. Lancet 1996; 347:1194-5.
41. Kim J. J., Reddy R., Lee M., et al. Analysis of metronidazole, clarithromycin and tetracycline resistance of Helicobacter pylori isolates from Korea. J Antimicrob Chemother 2001; 47:459-61.
42. Tankovic J., Lascols C., Sculo Q., et al. Single and double mutations in gyrA but not in gyrB are associated with low- and high-level fluoroquinolone resistance in Helicobacter pylori. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47:3942-4.
43. Cabrita J., Oleastro M., Matos R., et al. Features and trends in Helicobacter pylori antibiotic resistance in Lisbon area, Portugal (1990-1999). J Antimicrob Chemother 2000; 46:1029-31.
44. Heep M., Rieger U., Beck D., Lehn N. Mutations in the beginning of the groB gene can induce resistance to rifamycins in both Helicobacter pylori and Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 2000; 44:1075-7.
45. Heep M., Beck D., Bayerdorffer E., Lehn N. Rifampin and rifabutin resistance mechanism in Helicobacter pylori. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43:1497-9.
46. Su Z., Xu H., Zhang C. et al. Mutations in Helicobacter pylori porD and oorD genes may contribute to furazolidone resistance. Croat Medical 2006; 47:410-5.
47. Лазебник Л.,Б., Морозов И.А., Ильиченко А.А., Хомерики С.Г. Проблемы и перспективы исследований инфекции Helicobacter pylori. Экс клин гастроэн-терол 2006; 2:4-14.
48. Godoy A.P., Ribeiro M.L., Benvengo Y.H. et al. Analysis of antimicrobial susceptibility and virulence factors in Helicobacter pylori clinical isolates. BMC Gastroenterol 2003; 3:20.
49. Пюрвеева К.В., Лапина Т.Л., Момыналиев К.Т. и соавт. Генотипирование в клинической практике ведения больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки. Рос журнал гастроэнтерол, гепатолог, колопроктол 2003; 3(XIII):21-4.
50. De Francesco V., Margiotta M., Zulla A., et al. Clarithro-micyn resistance and Helicobacter pylori genotypes in Italy. J Microbiol 2006; 28:6-13.
51. Mubarak SA., Adeel Islam А., Abida A.E. Analysis of Helicobacter pylori antimicrobial susceptibility and virulence genes in gastric mucosal biopsies in the United Arab Emirates. Indian J Gastroenterol 2007; 26:221-4.
52. NCCLS. 1995. Performance standards for antimicrobial susceptibilities testing. M7-A3. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, PA.
53. Coudron P.E., Stratton C.W. Factors affecting growth and susceptibility testing of Helicobacter pylori in liquid media. J Clin Microbiol 1995; 33:1028-30.
54. Hachem C.Y., ClarridgeJ.E., Reddy R., et al. Antimicrobial susceptibility testing of Helicobacter pylori: comparison of E-test, broth microdilution, and disk diffusion for ampicillin, clarithromycin, and metronidazole. Diagn Microbiol Infect Dis 1996; 24:37-41.
55. Piccolomini R., Di Bonaventura G., Catamo G., et al. Comparative evaluation of the E-test, agar dilution, and broth microdilution for testing susceptibilities of Helicobacter pylori strains to 20 antimicrobial agents. J Clin Microbiol 1997; 35:1842-6.
56. Grignon B., Tankovic J., Megraud F., et al. Validation of diffusion methods for macrolide susceptibility testing of Helicobacter pylori. Microb Drug Resist 2002; 8:61-6.
57. Versalovic J., Shortridge D., Kibler K., et al. Mutations in 23S rRNA are associated with clarithromycin resistance in Helicobacter pylori. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40:477-80.
58. Menard A., Santos A., Mйgraud F., Oleastro M. PCR-restriction fragment length polymorphism can also detect point mutation A2142C in the 23S rRNA gene, associated with Helicobacter pylori resistance to clarithromycin. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:1156-7.
59. Gibson J.R., Saunders N.A., Burke B., Owen R.J. Novel method for rapid determination of clarithromycin sensitivity in Helicobacter pylori. J Clin Microbiol 1999; 37:3746-8.
60. Chisholm S.A., Owen R.J., Teare E.L., Saverymuttu S. PCR-based diagnosis of Helicobacter pylori infection and real-time determination of clarithromycin resistance directly from Helicobacter pylori human gastric biopsy samples. J Clin Microbiol 2001; 39:1217-20.
61. Schabereiter-Gurtner C., Hirschl A.M., Dragosics B., et al. Novel real-time PCR assay for detection of Helicobacter
Г.Ш. Исаева. Антибиотикорезистентность H. pylori
pylori infection and simultaneous clarithromycin susceptibility testing of stool and biopsy specimens. J Clin Microbiol 2004; 42:4512-8.
62. Lottspeich C., Schwarzer A., Panthel K. Koletzko S., Russmann H. Evaluation of the novel H.pylori ClariRes Real-Time PCR Assay for detection and clarithromycin susceptibility testing of Helicobacter pylori in stool specimens from symptomatic children. J Clin Microbiol 2007; 45:1718-22.
63. Glocker E., Kist M. Rapid detection of point mutations in the gyrA gene of Helicobacter pylori conferring resistance to ciprofloxacin by a fluorescence resonance energy transfer-based real-time PCR approach. J Clin Microbiol 2004; 42:2241-6.
64. Nishizawa T., Suzuki H., Umezawa A., et al. Rapid detection of point mutations conferring resistance to fluoro-quinolone in gyrA of Helicobacter pylori by allele-specific PCR. J Clin Microbiol 2007; 45:303-5.
65. Ribeiro M.L., Gerrits M. M., Benvengo Y.H.B., et al. Detection of high-level tetracycline resistance in clinical
isolates of Helicobacter pylori using PCR-RFLP. FEMS Immunol Med Microbiol 2004; 40:57-61.
66. Trebesius K., Panthel K., Strobel S., et al. Rapid and specific detection of Helicobacter pylori macrolide resistance in gastric tissue by fluorescent in situ hybridisation. Gut 2000; 46:608-14.
67. Samarbaf-Zadeh A.R., Tajbakhsh S., Moosavian S.M., et al. Application of fluorescent in situ hybridization (FISH) for the detection of Helicobacter pylori. Med Sci Monit 2006; 12:426-30.
68. Yilmaz O., Demiray E., Ttmer S., et al. Detection of Helicobacter pylori and determination of clarithromycin susceptibility using formalin-fixed, paraffin-embedded gastric biopsy specimens by fluorescence in situ hybridization. Helicobacter 2007; 12:136-41.
69. Latham S.R., Labigne A., Jenks P.J. Production of the RdxA protein in metronidazole-susceptible and - resistant isolates of Helicobacter pylori cultured from treated mice. J Antimicrob Chemother 2002; 49:675-8.
