CC BY
30
УДК 577.152.9:577.154
Л. М. Султанова (ст. преп.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.), Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), А. А. Шараева (асп.), Т. Н. Михайлова (студ.), В. В. Федорова (асп.)
Исследование влияния глицерина на гидролиз и ферментацию луговых трав целлюлитическими актиномицетами
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail:[email protected]
L. M. Sultanova, V. V. Zorin, N. I. Petukhova, A. A. Sharaeva, T. N. Mikhailova, V. V. Fedorova
Research of influence of glycerol on hydrolysis and fermentation of meadow grass by cellulolytic actinomycetes
Ufa State Petrolium Technical Univercity 1, Kosmonavtov Str, 450062 Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: [email protected]
Показано, что предобработка биомассы луговых трав водно-солевыми растворами, содержащими 2—20 % глицерина (температура — 121 °С, давление — 98 кПА, время — 1 ч) и последующая промывка лигноцеллюлозного субстрата водой приводит к существенному стимулированию роста микроорганизмов, увеличению выхода редуцирующих веществ и возрастанию КМЦ-целлюлазной активности внеклеточных ферментов в процессе культивирования целлю-литических актиномицетов.
Ключевые слова: глицерин; лигноцеллюлоза; микроорганизмы; целлюлаза.
It has been shown that pre-treatment of meadow grass with saline water solutions containing 2— 20 % of glycerol (temperature — 120 oC, pressure — 98 kPa, time — 1 hour) and further washing of lignocelluloses substrate by water lead to significant increase of microorganisms growth, yield of reducing substances and KMC-cellulase activity of extracellular enzymes during the period of cellulolytic actinomycetes cultivation.
Key words: lignocelluloses; cellulase; glycerol; microorganisms.
Отходы лесной и сельскохозяйственной лигноцеллюлозы являются перспективным сырьем для получения альтернативных топлив и химикалий с помощью микроорганизмов 1'2. Одним из экономически целесообразных подходов к использованию лигноцеллюлозы в микробиологических процессах является одновременное осуществление гидролиза целлюлозы, входящей в состав лигноцеллюлозных отходов, и ферментации образующихся моносахаридов микроорганизмами 3. Однако широкое использование растительных отходов на практике зачастую ограничивается стадией гидролиза целлюлозы, поскольку лигнин и ге-мицеллюлоза, входящие в состав лигноцеллю-лозы, оказывают ингибирующее действие на активность целлюлаз микроорганизмов, действуя как физический барьер 4 или взаимодействуя с активными центрами ферментов 2.
Предварительная обработка субстрата горячей водой, водными растворами кислот, щелочей, органических растворителей или ПАВ
Дата поступления 05.10.11
позволяют удалять из сырья токсичные примеси, ингибирующие рост микроорганизмов 5-9. В этом аспекте наиболее интересны процессы ор-ганосольватации лигноцеллюлозы, основанные на применении водных растворов недорогого, нетоксичного, невзрывоопасного соединения, такого как глицерин, с помощью которого из субстрата можно удалять лигнин 8'9.
В настоящей работе исследована возможность применения глицерина для органосоль-ватолиза биомассы луговых трав с целью интенсификации процессов гидролиза субстрата и синтеза целлюлаз микроорганизмами. В качестве тест-культур были использованы цел-люлитические актиномицеты (культуры К-2 и К-7), выделенные из почвенных образцов на среде Гетчинсона с фильтровальной бумагой 10. Ранее, при культивировании этих микроорганизмов на среде Чапека с луговыми травами, без предварительной обработки субстрата глицерином, было выявлено, что в 8-ми суточных культурах накапливается мало редуцирующих
веществ (РВ): 20 и 32 мг/л для К-2 и К-7, со-10
ответственно .
Предобработка биомассы луговых трав 2—20%-ми водно-солевыми растворами глицерина (температура — 121 0С, давление — 98 кПА, время — 1 ч) и последующая промывка лигноцеллюлозного субстрата водой приводит к существенному увеличению выхода РВ в процессе культивирования целлюлитических актиномицетов (рис. 1). Наибольший эффект (почти в 10 раз больше РВ по сравнению с контролем) дает предобработка субстрата 20%-м раствором глицерина при использовании культуры К-7. В то же время простое добавление в среду глицерина перед ее стерилизацией (без последующей промывки субстрата) лишь незначительно увеличивает выход РВ в области концентрации 2—5 % по сравнению с контролем, а при более высоких концентрациях глицерина уровень продуктов гидролиза целлюлозы снижается.
ния процесса гидролиза карбоксиметилцеллю-лозы (КМЦ) с помощью препаратов 8-ми суточной культуральной жидкости микроорганизмов. Обнаружено, что КМЦ-целлюлазная активность внеклеточных ферментов обоих микроорганизмов резко увеличивается в результате предобработки биомассы луговых трав в присутствии 2—5 % растворов глицерина (рис. 2Б).
Примечательно, что в случае культуры К-2 применение более высококонцентрированных растворов глицерина приводит к снижению целлюлазной активности культуры (рис. 2Б) и некоторому замедлению ее роста (рис. 2А). В тоже время, в случае культуры К-7 КМЦ-целлюлазная активность продолжает увеличиваться даже при использовании 10 и 20%-х растворов глицерина для предобработки, достигая значений, в 9—10 раз превышающих активность в контрольном варианте (рис. 2Б).
5 10
Глицерин, %
К-7 (без промывки) ■ К-7 (с промывкой) □ К-2 (без промывки) К-2 (с промывкой)
Рис. 1. Уровень редуцирующих веществ в 8-ми суточных культуральных жидкостях при культивировании микроорганизмов на среде Чапека с луговой травой, подвергнутой обработке растворами глицерина
Обнаружено, что в вариантах с предобработкой и промывкой субстрата более активно, чем в контроле, происходит рост микроорганизмов, о чем свидетельствуют более высокие значения оптической плотности (ОД520) 8-ми суточных культуральных жидкостей (рис. 2А). Это указывает на то, что более высокий выход РВ обусловлен не столько снижением скорости их утилизации микроорганизмами, сколько увеличением скорости гидролиза субстрата. В пользу такого предположения свидетельствуют также результаты исследова-
12 3 4 5 Варианты
к н
лй 1:1
^ я
2 Е-1
Н О
В о
В к
|=г я
„ я
У
Рис. 2. Оптическая плотность (А) и КМЦ-целлю-лазная активность (Б) 8-ми суточных культур микроорганизмов при культивировании на среде Чапека с луговой травой: 1 — контроль (без обработки); 2 — 2% глицерина; 3 — 5% глицерина; 4 — 10% глицерина; 5 — 20% глицерина.
Таким образом, полученные результаты показывают, что глицерин, являющийся отходом производства биодизеля, может быть успешно использован для интенсификации микробиологических процессов, основанных на биоконверсии биомассы луговых трав, однако концентрация глицерина в растворе, оптимальная для предобработки субстрата, зависит от свойств используемого микроорганизма.
Экспериментальная часть
Культуры микроорганизмов выращивали на модифицированной среде Чапека 11, содержащей 1% биомассы луговых трав в качестве ростового субстрата. Для предобработки лиг-ноцеллюлозного субстрата в среду вносили глицерин (2—20 %) и автоклавировали при температуре 121 0С в течение 1 ч. По окончании процесса осуществляли 3-х кратную промывку субстрата стерильной водой, после чего помещали его в стерильную среду с инокуля-том и инкубировали при температуре 30 оС в течение 10 сут. В контрольных экспериментах осуществляли культивирование микроорганизмов в среде, содержащей необработанную глицерином биомассу луговых трав, а также обработанную, но не отмытую от глицерина биомассу.
Рост микроорганизмов контролировали нефелометрически при длине волны 520 нм. Концентрацию редуцирующих сахаров в куль-туральной жидкости определили по методу Шомодьи—Нельсона 12. КМЦ-целлюлазную активность микроорганизмов определяли при температуре 30 оС по скорости образования РВ в реакционной смеси, содержащей 10 мл 1%-го раствора КМЦ в 0.2 М ацетатном буфере рН 5 и 10 мл культуральной жидкости 12. За
единицу условной целлюлазной активности исследуемых микроорганизмов принимали количество фермента, образующее 1 мг глюкозы в инкубационной смеси за 30 ч. Белок в реакционной смеси оценивали методом Лоури 13.
Литература
1. FitzPatrick M., Champagne P., Cunningham M. F., Whitney R. A. // Bioresource Technol.- 2010.-V.101.- P. 8915
2. Alvira P., Tomas-Pejo E., Ballesteros M., Negro M.J. // Bioresource Technol.- 2010.-V.101.- P. 4851.
3. Chen H., Jin S. // Enzyme Microbial. Technology.- 2006.- V.39.- P.1430.
4. Ch-Chang V.S., Holtzapple M. // Appl. Bio-chem. Biotechnol.- 2000.- V.84-86.- P.5.
5. Pedersen M., Meyer A. S. // New Biotechnol.-2010.- V.27, №6.- P.739.
6. Zeitoun R., Pontalier P. Y., Marechal P., Rigal L. // Bioresource Technol.- 2010.- V.101.-P. 9348.
7. Itoh H., Wada M., Honda Y., Kuwahara M., Watanabe T. // J. Biotechnol.- 2003.- V.103.-P.273.
8. Liu J., Takada R., Karita S., Watanabe T., Honda Y., Watanabe T. // Bioresource Technol.-2010.- V.101.- P.9355.
9. Sun F., Chen H. // Bioresource Technol.-2008.- V.99.- P.5474.
10. Султанова Л. M., Петухова Н. И., Зорин В. В., Хусаинова Э. Ф. // Баш. хим. ж.- 2010.-Т.17, №5.- С.60.
11. Руководство к практическим занятиям по микробиологии /под ред. Н.С. Егорова.- M: Изд-во МГУ.- 1983.- 215 с.
12. Хазиев Ф. Х. Методы почвенной энзимоло-гии.— М.: Наука, 1190.- 189с.
13. Практикум по биохимии /под ред. С. Е. Северина, Г. А. Соловьевой.- М: Изд-во МГУ.-1989.- 509 с.
