CC BY
3ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ВОЗДЕЙСТВИЙ НА СВОЙСТВА ВОДНЫХ РАСТВОРОВ
РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ПРОЦЕССА КРИСТАЛЛООБРАЗОВАНИЯ В КРИОПРОТЕКТОРНЫХ СРЕДАХ ДЛЯ КРИОКОНСЕРВАЦИИ КЛЕТОК
Иванова А.А.1, Яковенко С.1, Миронова А.2, Симоненко Е.1
1 Московский Государственный Университет им. М.В.Ломоносова, Москва, Россия 2Клиника ЭКО "АльтраВита", Москва, Россия [email protected]
Эффективная заморозка и хранение человеческой спермы является крайне актуальной задачей для вспомогательных репродуктивных технологий. В качестве проникающих внутрь клетки компонент криопротектора для заморозки сперматозоидов чаще всего используют глицерин, так как водные растворы глицерина способны формировать стеклоподобное состояние, достижение этого состояния необходимое для повышения выживаемости клеток при заморозке [1]. Для криоконсервации клеток используются низкие концентрации глицерина в растворе (10-15% по объему), так как они не токсичны для клеток. В литературных данных нет подробного изучения процесса кристаллообразования в данных растворах.
Поэтому целью данной работы является изучения процесса кристаллообразования в криопротектор-ных средах, основным компонентом которых является водных раствор глицерина.
Оценка средних размеров кристаллов, формирующихся в изучаемых растворах, а также исследование влияния отдельных компонент криопротекторных сред проведены с помощью рентгеноструктур-ного анализа (PETRA III, DESY).
В ходе первых экспериментов был изучен процесс кристаллообразования в водно-глицериновых растворах с концентрацией глицерина 12%об. с добавлением непроникающих компонент: альбумина (4 мг/мл) и сахарозы (0,5М) малых объемов (10-30 мкл). Было обнаружено, что, как и для всех дополнительных компонент, добавление сахарозы приводит к увеличению числа кристаллов в растворе, но их размеры значительно меньше. Данное наблюдение коррелирует с предполагаемой функцией непроникающих компонент [2]. Добавление сахарозы в раствор не только уменьшает осмотический шок, но также может приводить к образованию более мелких кристаллов, что помогает избежать негативного влияния процессов заморозки на клетки. В настоящее время в клиниках при работе со сперматозоидами чаще всего используется метод медленной заморозки больших объемов образцов. Поэтому дальнейшее изучение процесса образования кристаллов льда в криопротекторных растворах было проведено для образцов объемом 1,7 мл. Для получения значений средних размеров кристаллов, формирующихся в растворе при криоконсервации, было написано программное обеспечение, позволяющее численно оценить размеры кристаллов. С помощью данной программы были получены размеры средних кристаллов для базовых растворов при замораживании в больших объемах. Было показано, что для воды (100%) средний размер кристаллов составляет 21±2 мкм, для буферного раствора глицерина (12% об.) 12±1 мкм, в то время как для буферного раствора глицерина с добавлением альбумина (4 мг/мл) и сахарозы (0,04 М) средний размер кристаллов, формирующихся в растворе, составляет 9 ± 1 мкм.
Таким образом, в ходе работы был разработан новый метод анализа дифракционных картин для криопротекторных сред. Методом рентгеноструктурного анализа исследовано влияние глицерина, сахарозы и альбумина на формирование кристаллов в водном растворе объемом 20-30 мкл при витри-фикации. Также было показано, что добавление сахарозы (0,04 М) уменьшает размеры кристаллов, образующихся при заморозке водно-глицеринового раствора (12%), что согласуется с результатами, полученными ранее методом адиабатической калориметрии.
1.Popov I., Greenbaum G. A., Sokolov A. P., and Feldman Y., Phys. Chem. Chem. Phys. J. 2015; 17 (27), 18063-71.
2. Luyet B, Rasmussen D. Study by differential thermal analysis of the temperatures of instability of rapidly cooled solutions of glycerol, ethylene glycol, sucrose and glucose. Biodynamica 1968; 10: 167-191.
