Регуляция гена интерлейкина-2 Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 612.414.017.1.019.08

А. А. Мюльберг, Т. В. Гришина, О. В. Жмайлова-Сеник РЕГУЛЯЦИЯ ГЕНА ИНТЕРЛЕЙКИНА-2

Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра биохимии биолого-почвенного факультета

Интерлейкин-2 (IL-2) был открыт в 1976 г. как основной фактор для Т-лимфоцитов, выделенных из костного мозга человека [78]. Он был первым клонированным цитокином типа I [112], а также первым цитокином типа I, для которого был клонирован рецепторный комплекс (IL-2R) [63, 84]. Последний состоит из трех субъединиц, которые кодируются тремя независимыми генами и по-разному комбинируются, формируя рецепторы высокой, промежуточной и низкой аффинности [41, 80, 111]. В Т-клетках система IL-2/IL-2R является критической для правильной регуляции пролиферации CD4+ и CD8+ Т-клеток после воздействия антигенов. Известно также, что IL-2 опосредует в Т-клетках процесс клеточной смерти, индуцированной активацией (AICD), механизмом петли обратной связи и интернализации рецептора [36] и тем самым вносит вклад в генерацию и функционирование CD4+CD25+ регуляторных Т-клеток [70]. В этих клетках IL-2-сигнализация up-регулирует экспрессию трансфактора FoxP3 [33, 131]. Недостаточность в продукции регуляторных Т-клеток может быть основной причиной аутоиммунитета, который возникает в отсутствии IL-2-сигнализации и характеризуется неконтролируемым накоплением активированных Т-клеток на периферии [71, 101]. Следовательно, IL-2/IL-2R система регулирует или воздействует на многие критические функции в биологии Т-клеток, включая амплитуду клональной экспансии, развитие и рост эффекторных или регуляторных Т-клеток и последующую редукцию числа Т-клеток, специфических для данного антигена. В дополнение к этим воздействиям на Т-лимфоциты IL-2 оказывает плеотропные эффекты на другие типы клеток. Так, он может повышать цитолитическую активность NK-клеток, увеличивать продукцию иммуноглобулинов В-клетками и, вероятно, оказывать воздействие на нейтрофилы и моноциты [36].

Большинство IL-2 продуцируется активированными CD4+-клетками. Некоторое количество этого цитокина секретируется CD8+-клетками, а также скоротечно дендритными клетками [36, 44]. Хотя экспрессия IL-2 контролируется на многих уровнях, большинство исследований было сфокусировано на транскрипционной регуляции. Многочисленные регуляторные элементы гена IL-2 локализуются на минимальном регионе промотора размером ~ 300 п. н., который расположен непосредственно upstream от сайта инициации транскрипции [94]. В этом регионе гена IL-2 были идентифицированы несколько важных позитивных регуляторных элементов, связывающих разнообразные транскрипционные факторы [36, 57, 104], а также сайт связывания негативного элемента FoxP3 регуляторных клеток CD4+CD25+ [126, 136]. Наконец были получены многочисленные доказательства необходимости оккупации всех связывающих сайтов промотора гена IL-2 соответствующими транскрипционными факторами для обеспечения оптимальной транскрипции этого гена. © А. А. Мюльберг, Т. В. Гришина, О. В. Жмайлова-Сеник, 2009

Интерлейкин-2 (IL-2). Интерлейкин-2 был впервые выделен из костного мозга в 1976 г. как Т-клеточный ростовой фактор, который индуцировал пролиферацию активированных Т-клеток и являлся одним из первых цитокинов, охарактеризованных по молекулярному весу [78]. Ген IL-2 был клонирован в 1983 г. [28, 112]. Это позволило установить, что пролиферативная активность IL-2 осуществляется благодаря единственному молекулярному виду. Кристаллическая структура протеина была установлена в 1992 г. [6].

IL-2 — мономерный секретируемый гликопротеин, полипептидная часть которого состоит из 133 аминокислот (15,4 кДа) [42]. Его предшественник дополнительно включает 20 аминокислот на N-конце, которые являются гидрофобным секреторным сигналом, важным для взаимодействия с рецептором IL-2 [31]. При сравнении аминокислотных последовательностей в IL-2 различных видов млекопитающих обнаружена высокая степень гомологии и структурный консерватизм данного полипептида [42]. По своим структурным характеристикам IL-2 является типичным для семейства короткоцепочечных цитокинов типа I и представляет собой глобулу, описанную как «пучок из четырех а-спиралей» [6]. Были определены главные сайты контактов IL-2 с тремя субъединицами IL-2R [138]. Показано существование единственной дисульфидной связи (Cys58/105), которая играет ключевую роль в создании биологически активной конформации молекулы. Кроме того, IL-2 гликозилирован по OH-группе Thr3, но эта модификации несущественна для его биологической активности. Вероятно, роль гликозилирования состоит в повышении растворимости IL-2 в водном окружении [36].

IL-2 относится к провоспалительным цитокинам Th 1 типа. Он оказывает воздействие на многие типы клеток, из которых самыми предпочтительными являются Т-лимфоциты. Действительно, одним из самых быстрых последствий активации Т-клеток через их антиген/рецептор является de novo синтез IL-2, способствующий быстрой и избирательной экспансии популяций эффекторных Т-клеток, активируемых антигеном [61]. Таким образом, главная функция IL-2 — обеспечить пролиферацию как CD4+, так и СD8+ Т-клеток.

Индуцированное этим цитокином деление осуществляется посредством про-пролиферативных сигналов от протоонкогенов c-fos и c-myc в сочетании с анти-апоптотическими сигналами от членов семейства Bcl-2 [76, 83]. В дополнение к анти-апоптическим сигналам IL-2 также оказывает позитивное воздействие на клеточный метаболизм и гликолиз, которые необходимы для долговременного выживания Т-клеток [34].

Кроме того, исследования, проводимые на IL-2-дефицитных мышах, показали, что, вероятно, самой важной функцией IL-2 является отрицательная регуляция иммунных ответов для того, чтобы предотвратить аутоиммунную реакцию. Эти ингибирующие эффекты IL-2 создают ауторегуляторную петлю негативной обратной связи, которая осуществляется несколькими механизмами. Во-первых, продукция IL-2 крайне скоротечна. Таким образом, в отсутствии продолжающейся антигенной стимуляции, активированные Т-клетки умирают из-за отсутствия цитокина в своем микроокружении. Во-вторых, IL-2 инициирует про-апоптический путь через усиление FasL экспрессии на активированных Т-клетках [92, 116]. Так как Т-клетки также экспрессируют Fas/CD95, это событие ведет к запрограммированной клеточной смерти (апоптозу) активированных Т-лимфоцитов. В этом отношении IL-2- - мыши проявляют поразительно схожий аутоиммунный фенотип с Fas' '-видами мышей [50]. Кроме того, имеются неопровержимые доказательства, что IL-2 может действовать в течение развития регуляторных Т-клеток, чтобы предотвратить аутоиммунную реакцию, посредством запуска развития CD4+CD25+ регуляторных Т-клеток [33, 70, 131].

Наконец, недавно описана классическая ауторегуляторная петля обратной связи, в которой IL-2 ингибировал свою собственную продукцию. Эта ауторегуляторная петля зависела от активации передатчика сигнала и активатора транскрипции-5 (STAT5) и индукции транскрипционного репрессора В-лимфоцитарного белка созревания (Blimp-1), зависимой от IL-2. Таким образом, после активации антигеном наивных Т-клеток продуцируется IL-2, экспрессируется высоко-аффинный IL-2R. Секретирующийся IL-2 связывается со своим рецептором, что ведет к активации STAT5 и индукции Blimp-1, в конечном счете репрессируется ген IL-2. Blimp-1 является ключевым конечным медиатором репрессии IL-2, и Blimp-1-дефицитные клетки продуцируют больше интерлейкина-2 [43, 117].

Механизм, который определяет затухание сигналов гена интерлейкина-2 после активации Т-клетки, изучен недостаточно, но представляет собой другой критический аспект, контролирующий временную экспрессию этого гена. ZEB (TCF8) и CREM (Icer) связываются с минимальным промотором гена IL-2 и ингибируют продукцию репортер-ного гена, однако механизм этого действия не определен [8, 54]. Показано также, что IL-2 продукция в развивающихся Th1 клетках регулируется гетеродимеризацией Rel-A и T-bet на проксимальном промоторе IL-2 гена [51].

Многочисленные типы регуляторных Т-клеток (Treg) стали известными недавно. Они включают IL-10-секретирующие Treg-клетки, TGF-P секретирующие Th3 клетки, у5 Т-клетки, а также NKT-клетки. Тем не менее, регуляторные Т-клетки экспрессирующие forkhead box 3 (FoxP3) транскрипционный фактор, оказались наиболее изучаемым субтипом. Этот субтип характеризуется экспрессией CD25+ (IL-2Ra), рецептора фактора некроза опухоли, индуцируемого глюкокортикоидами (GITR), антигена 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA-4), CD621 и CD103 [124]. Примерно 10 % периферических CD4+ Т-клеток экспрессируют FoxP3 в то время, как он обнаружен только в 1 % CD8+ популяции [95, 97]. Эти регуляторные Т-клетки супрессируют широкий круг лейкоцитов, включая Т-клетки, В-клетки, дендритные клетки (DCs), натуральные киллеры (NK-клетки) и NKT-клетки [96].

Treg-клетки входят в отдельные популяции: «натуральные» регуляторные Т-клетки (nTreg), которые развиваются из CD4+ Т-клеток в тимусе, «индуцированные» регуляторные Т-клетки (iTreg), которые происходят из наивных Т-клеток путем дифференцировки в присутствии трансформирующего фактора роста-Р и IL-2, и тип 1 регуляторных клеток, который продуцируют IL-10. nTreg- и некоторые линии iTreg-клеток типично экспрессируют транскрипционный фактор FoxP3 [120, 136]. Существуют структурные, биохимические и функциональные доказательства кооперативного взаимодействия между NF-AT и FoxP3. Были получены кристаллические структуры NF-AT-AP1- и NF-AT-FoxP3-комплексов на NF-AT-AP1 композитном сайте промотора IL-2 гена. Сравнение структур этих комплексов показало, что FoxP3 и AP1 оккупируют один и тот же регион ДНК и взаимодействуют с перекрывающимися, но не с идентичными остатками NF-AT. NF-AT-AP1-комплекс активирует, а NF-AT-FoxP3-комплекс репрессирует экспрессию IL-2 гена, формируя стабильную, неподверженную ремоделированию нуклеосомную структуру [108]. Белки FoxP3 с мутациями, которые разрушают область контакта NF-AT-FoxP3, были не способны down-регулировать экспрессию IL-2 гена [126].

У людей с мутацией в Х-связанном гене FOXP3 развиваются мультиорганные аутоиммунные заболевания, известные так же как иммунодисрегуляция, а спонтанные мутации в гене FOXP3 у скорбутных штаммов мышей также ассоциируются с агрессивными аутоиммунными заболеваниями [136]. Стабильное присутствие nTreg-клеток на периферии существенно, поскольку острое удаление CD4+CD25+-FoxP3+ клеток у взрослых мышей

приводит к подобному синдрому прогрессивной аутоиммунной и воспалительной болезни [125]. Таким образом, регуляторные Т-клетки уникальной линии CD4+CD25+-FoxP3+ приводят в действие активную иммунную супрессию и существенны для поддержания аутотолерантности. Периферическая толерантность, опосредованая этими клетками, дополняет и укрепляет «центральную» толерантность, процесс, с помощью которого аутореактивные клоны Т-клеток удаляются при негативной селекции в тимусе [115].

Интерлейкин-2 играет критические роли в развитии и функциях регуляторных Т-клеток. Вместе с тем он является также крайне важным для надлежащих эффекторных функций обычных Т-клеток, таких, как продукция цитокинов, рост и выживание. Поэтому существенные дисфункции IL-2 как у людей, так и мышей ассоциируют с развитием аутоиммунитета, а также иммунодефицитами [109]. Это означает, что баланс между про-и анти-воспалительными эффектами IL-2 является критическим для соответствующего возникновения и протекание иммунного ответа.

В дополнение к этим эффектам интерлейкин-2 «предоставляет помощь» другим клеточным типам, активно участвующим в иммунном ответе, таким, как В-клетки и NK-клетки. Так, например, IL-2 усиливает продукцию NK-производных цитокинов (TNF-a, IFN-y и GM-CSF). Кроме того, IL-2 и IL-12, действуя синергично, тем самым повышают цитотоксическую активность NK-клеток. Показана также роль IL-2 в увеличении секреции антител В-клетками. Как и в Т-клетках, интерлейкин-2 увеличивает экспрессию IL-2Ra в В-клетках, увеличивая тем самым их чувствительность к IL-2 [36].

Значительные количества IL-2 секретируются CD4+ Т-клетками. Большая часть этих Т-клеток продуцирует IL-2 сразу же после стимуляции антигеном, в то время как остальные Th1 цитокины экспрессируются в больших количествах только после дифференциации Т-хелперов [47]. Кроме того, CD8+ Т-клетки также секретируют ощутимые количества IL-2 после стимуляции их TCR. Показано также, что минорные количества интерлейкина-2 продуцируются и АРС. Относительно недавно было обнаружено, что DCs скоротечно секретируют IL-2 после микробного вызова, чтобы усилить активацию Т-клеток. Это подтверждается данными, полученными в опытах с DCs из IL-2-деффицитных мышей, которые повреждаются в способности содействовать пролиферации Т-клеток. Однако макрофаги, очевидно, не продуцируют IL-2 в ответ на бактериальную активацию [44].

Рецептор интерлейкина-2 и его функции. Антиген-индуцированный иммунный ответ Т-клеток критически регулируется взаимодействием IL-2 с высокоаффинным IL-2 рецепторным (IL-2R) комплексом. Этот комплекс состоит из трех субъединиц IL-2Ra (CD25), IL-2RP (CD122) и общей гамма-цепи или Yс (CD132). CD122 и Yс первоначально собираются в структуру P-листа и родственны членам класса I суперсемейства цитокиновых рецепторов. С другой стороны, CD25 и IL-15Ra содержат так называемые «суши»-модули в своем внеклеточном регионе [83]. Все три субъединицы необходимы для формирования высокоаффинного IL-2R (Kd ~ 10-11 M). IL-2R не существует в виде пресформиро-ванного гетеротримера. Скорее, CD25 по своей собственной инициативе связывает IL-2 (Kd ~ 10-8 M), что способствует ассоциации CD122 и y^ Покоящиеся Т-лимфоциты экспрессируют комплекс промежуточной аффиности (Kd ~ 10-9 M), состоящий из IL-2RP- и Y^^ran Кристаллическая структура IL-2, связанного с IL-2R показывает, что каждая субъединица рецептора взаимодействует с интерлейкином-2 с наибольшим контактом по поверхности IL-2/CD25 и что существенное взаимодействие имеет место между CD122 и y^ которое приводит к стабильному четвертичному комплексу IL-2-CD25-CD122-YC [107].

Из всех субъединиц a-цепь обладает самым коротким цитоплазматическим доменом, составленным только из 13 аминокислот, в то время как IL-2RP- и YC-цепи содержат

в цитоплазматическом домене 286 и 86 аминокислот соответственно [64, 93]. Общая гамма-цепь разделяется рецепторами для IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 и IL-15 [62, 83]. В дополнение к YC-цепи IL-15 также разделяет с IL-2 субъединицу IL-2RP. Разделение субъединиц может играть роль в обеспечении избыточности в воспалительных ответах. Хотя IL-2 и IL-15 используют идентичные рецепторные субъединицы, чтобы передавать сигналы, эти цито-кины тем не менее проявляют противоположные эффекты in vivo [66]. Следует отметить, что CD25 также up-регулируется в мышиных и человеческих дендритных клетках, Ви NK-клетках [13, 81, 110].

Как свидетельствуют длины цитоплазматических доменов рецепторных субъединиц IL-2, IL-2RP и YC являются ответственными за ^2-сигнализацию. В обычных Т-клетках в ответ на связывание IL-2 гетеродимеризация Р- и Y-субъединиц запускает активацию и рекрутирование Janus-киназ (Jak), которые в свою очередь фосфорилируют тирозиновые остатки в цитоплазматических доменах Р-цепи [64]. Специфически Jak1 рекрутируются на серин-богатый домен P-цепи, в то время как Jak3 связывается с цитоплазматическим доменом y^ Фосфорилированные тирозины затем служат в качестве докирующих сайтов для адапторных протеинов, таких, как SHC протеин (SH — SRC homology домен; С — домен гомологии коллагена) и STAT5 [15]. SHC протеины в конце концов приводят к активации Ras-Raf-MAP-киназного и PBK-киназного путей, которые способствуют транскрипции цитокинов, выживанию, вхождению в клеточный цикл и росту Т-клеток. В ответ на активацию фосфорилированными тирозинами STAT5 димеризуются и транс-лоцируются в ядро, где они связываются с последовательностями ДНК, содержащими интерферон^-активируемые сайты (GAS), отвечают за пролиферацию клеток и регулируют экспрессию митогенных генов и генов выживания [65]. Интересно, что IL-2Ra-промотор также является мишенью STAT5 и включает 3 позитивно регулируемых региона (PRR). PRRI регулируется сыворотно-чувствительным фактором (SRF) и NF-kB, тогда как PRRII является мишенью Elf-1 (члена семейства Ets факторов лимфоидно-миелодных клеток) и архитектурного протеина HMGA1. STAT5, Elf-1 и GATA-1-подобный протеин связывают PRRIII [90]. Это поддерживает позитивную петлю обратной связи, где сигнализация IL-2-рецептора обеспечивает дальнейшую продукцию самого рецептора.

Регуляция экспрессии гена IL-2Ra с помощью PRRI и PRRII является результатом как специфических протеин/ДНК, так и протеин/протеин взаимодействий HMGA1, Elf-1, NF-kB и SRF. Например, протеин HMGA1 может физически взаимодействовать in vitro c каждым из трех протеинов, которые связываются с этими регуляторными элементами [90]. В результате многочисленных взаимодействий между транскрипционными факторами, которые связаны с PRRI и PRRII, формируется высокоупорядоченный мультипротеиновый комплекс (известный как энхансеосома), который регулирует in vivo активность промотора гена IL-2Ra [18].

Хотя сигнализация другими гамма-цитокинами может также индуцировать пролиферацию и выживание Т-клеток, IL-2 остается самым эффективным цитокином для экспансии этих клеток. В ответ на TCR-сигнализацию важную роль в IL-2-продукции играет CD28-костимуляция, которая опосредует транскрипцию IL-2 гена и стабилизацию IL-2 мРНК. Последняя, в свою очередь, вызывает почти 1000-кратную клональную экспансию Т-клеток [85], которая может существенно ингибироваться самим IL-2 [71]. Фактически IL-2 индуцирует далее экспрессию его рецептора [40]. Используя математические модели, было показано, что основной ранний эффект IL-2 на Т-клетки — мишени, является зависимым от способности IL-2 уменьшать скорости их смерти без изменения скорости их деления [37]. Однако в дополнение к пролиферативным, провоспалительным

и способствующим выживанию эффектам IL-2 также обладал антивоспалительными сигналами. Баланс про- и антивоспалительных свойств IL-2 вносит свой вклад в контролируемый воспалительный эффект.

Несколько событий, опосредованных IL-2, помогают контролировать воспалительные ответы. В ответ на связывание IL-2 рецепторный комплекс быстро интернализуется, приводя к лизосомальной деградации IL-2 [60]. Эта интернализация, по-видимому, зависима от YC-цепи [64]. IL-2 может также лимитировать его собственную продукцию в негативной петле обратной связи даже в отсутствии регуляторных Т-клеток. Продукция IL-2 Т-клетками достигает пика спустя 24 ч культивирования в присутствии анти-CD3 или анти-CD8 антител и снижается в 3 раза после 72 ч, как было определено внутриклеточным окрашиванием и real-time PCR IL-2 мРНК [30]. Однако истощение IL-2, использующее нейтрализирующие антитела, ингибирует это время-зависимое снижение IL-2 и фактически существенно увеличивает частоту IL-2+ Т-клеток, уровень продукции IL-2 в расчете на Т-клетку, а также уровни IL-2 мРНК. Драматическое уменьшение продукции IL-2 через 72 ч является независимым от регуляторных Т-клеток. IL-2 также является критическим для индукции активации-индуцированной смерти Т-клеток (ASID) через up-регуляцию Fas-лиганда и down-регуляцию антиапоптотического FLIP [92].

Необходимость IL-2 для развития регуляторных Т-клеток была спорной. После открытия FoxP3, как ключевого маркера CD4+CD25+ регуляторных клеток, стало возможным исследовать регуляторные клетки в IL-2-дефицитных животных [56]. Установлено, что в IL-2 и CD25 дефицитных животных FoxP3-регуляторные Т-клетки еще генерируются. Однако несмотря на сходное абсолютное число этих клеток на периферии, процентное отношение FoxP3-регyляторных Т-клеток существенно уменьшается у данных животных. Важно, что такие животные демонстрируют ряд аутоиммунных заболеваний [3, 135]. Тем не менее неизменные процент и частоты тимусных FoxP3-регуляторных Т-клеток привели к убеждению, что IL-2 может быть более важным в периферальной индукции, в поддержании и размножении Treg. Действительно, другие животные недостаточные в IL-2R, обнаруживают потенциальную зависимость от последующей сигнализации IL-2 в развитии регуляторных Т-клеток [135].

В настоящее время известен ряд сигнальных путей регуляторных Т-клеток, которые отвечают на стимуляцию IL-2 и отличаются от таковых эффекторных CD4+ Т-клеток. Мышиные Tregs не проявляют PI3K путей в ответ на стимуляцию IL-2 in vitro, но STAT5 еще активируется. Отсутствие активации PI3K приписывается экспрессии PTEN, который регулирует пролиферативную способность регуляторных Т-клеток [7, 119]. Однако экспрессия PTEN down-регулируется в ответ на стимуляцию TCR в Tregs [7].

С другой стороны, сходно с эффекторными Т-клетками, активация STAT сохраняется и в регуляторных Т-клетках. Интересно, что STAT-связывающие сайты были найдены в FoxP3 гене мышей и людей [7, 119], чего не наблюдалось в наивных CD4+CD25+ Т-клетках [129, 137]. Соответственно, Tregs up-регулируют экспрессию FoxP3 в ответ на стимуляцию IL-2 как у людей, так и у мышей. Однако IL-2-зависимая индукция FoxP3 в наивных CD4+CD25+ клетках выявляется тогда, когда эти клетки сочетаются с регуляторными Т-клетками. И в этом случае транскрипция FoxP3 обусловлена посредничеством STAT5 [129]. Фактически, Т-клетки, недостаточные в STAT5, неспособны к дифференции в регуляторные Т-клетки [15].

IL-2RP-дефицитные животные отличаются тем, что демонстрируют существенно более высокое истощение FoxP3-регуляторных Т-клеток на периферии по сравнению с IL-2 или CD25 дефицитными животными [26, 33, 137]. Это привело к гипотезе, что

благодаря избытку цитокинов, связывающихся с рецептором IL-2 (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 и IL-15), отсутствие одного интерлейкина-2 или CD25 не эффективно в противодействии развитию регуляторных Т-клеток. Полное отсутствие FoxP3-рeгулятoрных Т-клеток в ус-/--животных поддерживает эту гипотезу, так как любой из этих цитокинов требует ус-компонента в их соответствующих рецепторах. Кроме того, Treg в ^-2-/--мышах проявляют повышенную экспрессию IL-15Ra и IL-7Ra, вероятно, для компенсации потери IL-2-сигнализации [14]. Фактически, IL-2/IL-15 нокаутированные мыши подобно IL-2RP-дефицитным животным показывают сходное уменьшение в регуляторных Т-клетках, что подтверждает вклад IL-15 в развитие этих клеток. Было продемонстрировано, что сигнальный домен IL-7Ra мог замещать IL-2RP в IL-2RP-дeфицитным мышах в развитии Treg [1З1]. Эти исследования были завершены генерацией химерного рецептора, составленного из экстрацитоплазматического домена IL-2RP и цитоплазматического домена IL-7Ra. Совокупность полученных результатов демонстрируют что ус-сигнализация через ус-цитокины является критической для развития регуляторных Т-клеток и может в ограниченной степени восполнить недостаточность IL-2 сигнализации [69].

Ген интерлейкина-2. Регуляторные сайты и транскрипционные факторы. В геноме человека имеется лишь одна копия гена IL-2, локализованная на 4-й хромосоме. Ген включает 6684 п. н. и состоит из 4 экзонов и З интронов [100]. Первые экспериментальные данные по организации транскрипционных контрольных элементов, которые ответственны за Т-лимфоцит-специфическую индукцию IL-2 гена, были представлены в 1986 г. Т. Футжита и сотрудниками [З5]. Авторы идентифицировали ближайший upstream регион IL-2 гена как элемент, контролирующий индуцибельную экспрессию IL-2 гена человека в Т-клетках.

Полученные экспериментальные данные позволили определить минимальный участок промотора гена интерлейкина-2, который был назван «промотор/энхансер гена IL-2» или «минимальный высококонсервативный энхансер» [94]. Он представляет собой участок ДНК длиной ~ З00 п. н. upstream от точки старта транскрипции и компануется из корового (от —40 до +40 п. н.) и регуляторного (от —З00 до -40 п. н.) промоторов. IL-2-коровый промотор содержит близлежащий consensus ТАТА-бокс, который расположен на участке от -З2 до -25 п. н. Хотя ТАТА-бокс и является критическим для индуцибельной экспрессии гена IL-2, функция этого элемента и других последовательностей корового промотора не определена [121]. Регуляторный промотор гена IL-2 содержит секвенцион-ные элементы, ответственные за индукцию экспрессии гена IL-2, связанную с активацией TCR, а также чувствительные участки, опосредующие CD28 ко-стимуляцию, супрессию иммуносупрессантами, такими, как CsA и FK506 и элементы, репрессирующие активацию гена IL-2. Показано, что промотор IL-2 — высоко консервативен, он обладает 86 %-ной гомологией у человека и мыши. Вклад архитектуры регуляторного промотора в детерминацию уровней транскрипции гена IL-2 остается неясным. Не ясны также «природа», локализация и протяженность истинного энхансера гена IL-2.

В структуре регуляторного промотора гена IL-2 выделяют следующие пять регионов связывания основных регуляторных факторов: ARRE-1- и ARRE-2-элементы, NF-AT/TATA, NF-AT/AP-1 и CD28RR. Порядок расположения этих регионов в промоторе гена IL-2, их нуклеотидные последовательности и сайты связывания транскрипционных факторов, участвующих в регуляции гена интерлейкина-2 представлены на рис. 1. Имеются многочисленные доказательства того, что все сайты связывания в промоторе IL-2 должны быть оккупированы соответствующими транскрипционными факторами, чтобы обеспечить оптимальную транскрипцию.

ARRE-2

Upstream промоторный регион

Коровый промотор

і

NF-AT

АР-1

Oct

NF-kB

£ НМвА А СЯЕВ

Рис. 1. Изображение минимального промотора 1Ь-2 гена от -300 п. н. до сайта старта транскрипции +1 п. н. (А). Известные регуляторные элементы и соответствующие транскрипционные факторы, идентифицированные в 1Ь-2 гене (Б)

Черными прямоугольниками отмечены сайты связывания функциональных транскрипционных факторов; приводятся общепринятые обозначения элементов промотора. Пунктирные линии указывают сайты связывания НМОА1.

N¥^7 транскрипционные факторы — семейство протеинов, ядерных факторов активированных Т-клеток, служит главным передатчиком кальциевого сигнала, которое ассоциируется с ТСЯ активацией через Т-клеточный рецептор. КБ-АТ протеины экспрессируются конститутивно, но входят в ядро только после их освобождения из цитоплазмы, процесса, который требует каталитического действия кальцинейрина. Были идентифицированы 5 протеинов семейства КБ-АТ, каждый из которых кодируется отдельным геном. Четыре из них КБ-АТс1— №-АТс4 регулируются кальцием, в то время как №-АТс5 им не регулируется. КБ-АТс1, 2, 3, 5 экспрессируются клетками иммунной системы, тогда как КБ-АТс4 — клетками, не принадлежащими иммунной системе. В промоторе 1Ь-2 гена были идентифицированы четыре КБ-АТ-связывающих сайта [48, 67]. Экспрессия 1Ь-2 гена была неизменна у ЫЕ-ЛТс1'/-- или #Г-ЛТС2-/'-дефицитных мышей, что указывало на потенциальную избыточность КБ-АТс изоформ и возможную компенсацию другими протеинами семейства КБ-АТ у этих мышей. Действительно, Т-клетки, лишенные КБ-АТс1 и КБ-АТс2, не могут продуцировать 1Ь-2, тогда как Т-клетки, лишенные КБ-АТс1 и КБ-АТс3, продуцируют 1Ь-2 в заметно меньших количествах [67, 68]. Это указывает, что КБ-АТс1, №-АТс2 и КБ-АТс3 все позитивно регулируют транскрипцию 11-2 гена [86].

АР-1 транскрипционные факторы являются гомо- или гетеродимерами из продуктов двух протоонкогенов и ГОБ. Это родственные белки с-_щп (Мг 36 кД) и с-

10 (Мг 41 кД). Члены Го8- и _]ип-семейств содержат высоко консервативный регион, включающий основной ДНК-связывающий домен и мотив для димеризации, так называемую Ь21Р-лейциновую застежку. Активация Т-клеток посредством взаимодействия ТСИ/СБЗ ведет к активации РКС-ББК1-ЖК, Яас-ЖК и Яа8-ЯаГ- БИК сигнальных путей и впоследствии к индукции АР-1. В то время как Яа8-БИК путь ведет к продукции с-!^,

JNK-сигнальный путь приводит к формированию АР-1 посредством фосфорилирования с-jun, допускающего его ассоциацию с c-fos [106]. АР-1 связывается с IL-2 энхансером в тесной ассоциации с другими транскрипционными факторами, такими, как протеины NF-AT-семейства и Oct-1. Взаимодействие между АР-1 и другими факторами усиливает ДНК-связывающие сродство каждого взаимодействующего партнера. ДНК-связывающая активность АР-1 является необходимой, но недостаточной для его транскрипционной активности. Способность с-jun активировать транскрипцию зависит от N-терминального фосфорилирования киназой JNK.

ARRE-1 и ARRE-2-элементы промотора IL-2 являются композитными ДНК-сайтами, содержащими участки связывания двух транскрипционных факторов, NF-AT и АР-1. Так, ARRE-1 включает в себя слабый NF-AT связывающий сайт (GAAA) и сильный для связывания АР-1 (TGTGTAA). ARRE-2 элемент содержит слабый ДНК-сайт для NF-AT (GGAAAA) и слабый сайт связывания для АР-1 (TGTTTCA), разделенные парой оснований (AC), которая значительно уменьшает связывание NF-AT с его индивидуальным сайтом [22, 68].

Взаимодействие AP-1 и NF-AT с их индивидуальными сайтами связывания в этих композитных элементах характеризуется относительно высокими скоростями диссоциации. Однако, когда все три протеина (NF-AT, с-jun и с-fos) связываются с композитным ДНК-сайтом, наблюдается сильный кооперативный эффект, стабилизирующий данный комплекс [21]. Тесное взаимодействие NF-AT и АР-1 факторов на композитных элементах ДНК составляет мощный механизм интеграции сигналов кальциевого (Ca2+ и кальциней-рина) и протеинкиназного с-Ras (PKC^-Ras^-Raf^-MAPK) путей в регуляции экспрессии интерлекин-2 гена. Используя NF-AT мутантные протеины, которые не способны взаимодействовать с с-fos/c-jun димерами, но с сохранившейся способностью связываться с ДНК или транскрипционной активностью, удалось показать, что экспрессия IL-2 гена абсолютно зависима от кооперации между NF-AT и с-fos/c-jun димерами [68].

NF-kB транскрипционные факторы. Семейство NF-kB млекопитающих состоит из NF-kB1 (р50), NF-kB2 (р52), RelA (p65), RelB и с-Rel и играет важную роль в регуляции многих генов иммунной системы [38]. В Т-клетках наиболее часто находятся гомодимеры р50, гетеродимеры р50-р65 (RelA) и рбО-с-Rel [99]. IL-2 промотор содержит два сайта связывания NF-kB, один из которых находится между -200 и -180 п. н, а второй локализуется внутри CD28RE [105]. Связывание членов семейства NF-kB с CD28RE после активации Т-клеток изменяется с течением времени. Спустя один час после стимуляции главным ком -понентом являются гомодимеры RelA, тогда как через 6 ч доминируют c-Rel-cодержащие комплексы [46]. Было показано, что для усиления связывания с-Rel c CD28RE необходимы HMGA1 протеины [46, 105]. С-Rel играет существенную роль в ремоделировании нуклеосомной структуры IL-2 хроматина при активации CD3/CD28 соответствующими антителами [89]. Уровни IL-2 являются нормальными в RelA-дефицитных Т-клетках, тогда как в c-Rel-дефицитных клетках продукция IL-2 нарушена. Повышенная экспрессия IL-2, найденная у Nfkb 1-/"-мышей, указывает на то, что гомодимеры р50 репрессируют экспрессию гена IL-2 in vivo [128]. В совокупности эти данные подтверждают, что в регуляции IL-2 гена активирующую роль играют только р50-р65- или р50-c-Rel-гетеродимеры.

NF-kB факторы в сочетании с другими транскрипционными факторами участвуют в регуляции гена IL-2 частично через CD28-отвечающий элемент этого гена, необходимый для CD28-опоcредованной транскрипционной активации IL-2 промотора. CD28RE структурно входит в регион CD28RR IL-2 промотора (CD28 receptor region), который был впервые идентифицирован как 5-AGAAATTCCA-3' последовательность, локализованная

между позициями -164 и -154 п. н. относительно начала старта транскрипции IL-2 гена [17]. Показано, что CD28RE обладает гомологией с консенсус последовательностью сайта NF-kB, и связывает RelA гомодимеры и c-Rel-содержащие комплексы, а также NF-AT протеины со слабой гомологией с c-Rel ДНК-связывающим доменом NF-kB [74, 105]. CD28RR также содержит связывающий сайт для АР-1, который функционирует кооперативно с CD28RE. Интересно, что CD28RE отделяется от соседнего AP-1 сайта (IL-2-TRE) только двумя парами оснований. Этот сайт, подобно другим TREs, может связываться in vitro c транскрипционными регуляторами, протеинами класса базальных лейциновых застежек (bZip) — ATF-2/CREB и с димерами c-fos/c-jun. Исследования in vivo с использованием T- клеток линии Jurkat установили, что CD28RE-TRE последовательность, будучи соединенной с минимальным базальным промотором, функционирует как композитный элемент и может опосредовать многократно увеличенную митоген- и CD28-завиcимую активацию транскрипции, которая параллельна физиологической регуляции продукции IL-2 [17].

Октамер-связывающие протеины Oct-1 и Oct-2. В периферических Т-лимфоцитах и в некоторых линиях Т-клеток экспрессируются два протеина Oct-1 и лимфоцит-специфический фактор Oct-2, которые взаимодействуют с двумя октамер-связывающими сайтами ATGCAAAT внутри IL-2 промотора. Проксимальный Oct-связывающий сайт может также формировать комплекс с АР-1; плотная ассоциация и функциональная кооперация октамера и АР-1 фактора весьма важна для индукции активности IL-2 промотора в ответ на РМА и иономицин [87].

CREB. Расшифровка данного названия [сАМР-отвечающий элемент (CRE)-cвя-зывающий протеин] показывает, что CREB активируется фосфорилированием в ответ на изменение уровня сАМР помимо других сигналов. Семейство CREB у млекопитающих включает CREB, CREM и ATF-1. CREB и ATF-1 экспрессируются повсеместно, тогда как CREM экспрессируется на максимальном уровне в нейроэндокринных тканях. Первичная структура активаторов семейства CREB показала наличие центрально расположенного, киназа-индуцибельного домена из 60 аминокислот (KID, так же известный, как Р-бокс), который содержит сайт фосфорилирования РКА (RRPSY) и иные потенциальные сайты фос-форилирования другими киназами. KID фланкирован гидрофобными, богатыми глицином доменами, обозначаемыми Q1 и Q2, которые действуют как конститутивные активаторы. Они найдены во многих регуляторных, ко-активаторных и базальных транскрипционных факторах и представляют поверхности взаимодействия для других трансфакторов.

Участок полипептидной цепи, простирающийся от KID и включающий последовательность, богатую основными остатками, и Q2-домен, часто обозначают как домен конститутивной активации (CAD). Наконец на С-конце у всех членов семейства CREB локализована основная область и домен димеризации — лейциновая застежка bZIP, образующие в совокупности ДНК-связывающий домен (рис. 2) [27, 45, 73, 88]. Гены CREB

CAD

Рис. 2. Структура протеина СКЕБ Представлена сегрегация конститутивной и киназа-индуцибельной СЯЕБ активности в отдельных

доменах протеина.

и CREM создают некоторые продукты альтернативного сплайсинга, которые кодируют полипептиды с различными активаторными или репрессорными способностями. Так, например, в случае CREM с альтернативного, управляемого CRE внутреннего промотора, в ответ на стимуляцию сАМР синтезируется усеченный основной домен/bZIP полипептид, называемый ICER (репрессор индуцибельного сАМР-отвечающего элемента). В соответствии с отсутствием активационного домена ICER действует как мощный транскрипционный репрессор гена IL-2, связывающийся с CRE-подобным мотивом промотора IL-2 в позиции —1б0 и формируя комплекс с NF-AT [8].

CREB опосредует активацию сАМР-отвечающих генов путем связывания в виде димера с консервативными CRE-сайтами. Различная регуляция генов-мишеней сАМР через CREB достигается благодаря различиям в композиции последовательностей и расположения CRE на промоторе. Впервые описанный как палиндром TGACGTCA [24, 77], CRE также существует в виде половинного мотива (CGTCA), который менее активен в связывании CREB и менее способен реагировать на сАМР, чем полный CRE-палиндром [25]. Обычно CRE локализованы в пределах ~ 100 п. н. от ТАТА-бокса. CRE, расположенные upstream на промоторе, менее активны.

CREB связываются с палиндромными CRE в виде димера с наномолярной аффинностью. Формирование лейциновой застежки, межсубъединичные солеобразные мостики и водородные взаимодействия способствуют димеризации CREB [99]. Основное распознавание CREB осуществляется главным образом остатками, расположенными на одной поверхности спирали ДНК-связывающего домена CREB и включают инвариантные остатки Asn293, Arg301 и Lys305. Lys305, по-видимому, необходим для различия между CRE (TGACGTCA) и близкородственным АР-1 сайтом (TGACTCA).

Помимо других сигналов, CREB активируется фосфорилированием в ответ на сАМР сАМР действует обычно как классический внутриклеточный вторичный мессенджер. Аккумуляция сАМР в ответ на активацию G-протеин-сочетанных рецепторов индуцирует большинство клеточных ответов через сАМР-зависимую протеинкиназу (РКА). В основном состоянии РКА находится в цитоплазме в виде неактивного гетеродимера, состоящего из двух регуляторных (R) и двух каталитических (С) субъединиц. Индукция сАМР высвобождает С-субъединицы, которые пассивно диффундируют в ядро и индуцируют экспрессию генов в клетках путем фосфорилирования CREB по остаткам Ser133 в сайте RRPSY [73]. Фосфорилирование CREB по Ser133 способствует рекрутированию транскрипционного ко-активатора СВР и его паралога р300.

Вместе с тем фосфорилированию CREB по Ser133 способствуют различные ростовые факторы и стрессорные сигналы, активирующие различные клеточные киназы. В их число входят кальций-кальмодулин киназы I, II и IV, Lim-киназа, и ряд MAPKAPK (MAP-KAP2, MAP-KAP3, MSK1 и MSK2, RSK1 и RSK2), а также PKB/Akt и PKC [52]. Однако между активностью CREB после обработки сАМР и после воздействий стрессор-ных/митогенных сигналов существуют различия, и эти различия, по-видимому, реализуется на уровне промотора. Так, активация клеточных генов в ответ на NGF требует дополнительных факторов связывающих промотор, которые действуют совместно с CREB. Это взаимодействие зависимо от фосфорилирования Ser133. Более того активация клеточного рецептора в Jurkat клетках стимулирует фосфорилирование CREB по Ser133 в отсутствии активации CRE репортерного гена. Очевидно, что способность генов-мишеней CREB отвечать на один сигнал, но не на другой — вопреки сопоставимому фосфорилированию Ser133 CREB — может отражать или различия в оккупации CRE на промоторе или способность CREB рекрутировать транскрипционный аппарат [52, 73, 88].

CREB стимулирует базальную транскрипцию CRE-содержащих генов и опосредует индукцию транскрипции в ответ на фосфорилирование протеинкиназой А. Соответственно трансактивационный домен CREB — двураздельный, состоящий из конститутивного ^2-домен: аминокислотные остатки 160-283) и индуцибельного (KID-домен: остатки 100-160) активаторов, которые объединяют усилия в ответ на стимуляцию сАМР [73, 88]. Q2-домен способствует экспрессии гена-мишени посредством его взаимодействия с dTAFII110/hTAFII135 компонентами комплекса TFIID, основного транскрипционного фактора, состоящего из ТАТА-связывающего белка (ТВР) и ТВР-ассоциированных факторов (TAFs). Взаимодействие между TAFs и Q2 опосредуется кластером гидрофобных аминокислот, мутации которых разрушают TAF-связывание, рекрутирование полимеразы и активацию транскрипции [32]. Q2-домен, но не KID, опосредует рекрутирование компонентов комплекса инициации транскрипции, включая Pol II, IIB и IID. Однако Q2 относительно неэффективен в стимуляции последующих ступеней реакции. Наоборот, фосфорилированный РКА по Ser133 KID эффективно стимулирует изомеризацию рекрутированного полимеразного комплекса и многие раунды транскрипции [73, 88]. Кроме того, фосфорилирование Ser133 делает возможным для KID рекрутировать ко-активаторные паралоги СВР и р300 на промотор за счет взаимодействия с доменом KIX этих паралогов. Как полагают, после рекрутирования СВР опосредует активацию генов-мишеней путем ассоциации с комплексом PolII [52, 118], а также с помощью внутренней гистон-ацетилтрансферазной активности, посредством которой он ацетилирует гистоны, связанные с промотором [132].

Ко-активаторы транскрипции цитокиновых генов. Скоординированная сборка транскрипционных факторов на регуляторных регионах цитокиновых генов необходима, чтобы обеспечить оптимальный уровень транскрипции, опосредованной РНК-полимеразой II. Важную роль в этом процессе играют архитектурные протеины HMGA. Вместе с тем ключевыми регуляторами транскрипции являются транскрипционные ко-активаторы СВР (CREB-связывающий протеин) и р300.

Архитектурные протеины HMGA. Архитектурные протеины HMGA семейства млекопитающих являются полипептидами, построенными из примерно сотни аминокислот и обладающие модульной секвенционной организацией. Это семейство состоит из 3 членов: HMGA1a, HMGA1b и HMGA2. HMGA1a и HMGA1b продуцируются одним геном и альтернативным сплайсингом мРНК, тогда как HMGA2 продуцируется отдельным геном [53]. Тем не менее, все они являются высокородственными членами семейства архитектурных протеинов. HMGA протеины имеют три высокопозитивно заряженных региона, представленных последовательностями ККPRGRPKK для HMGA1a и HMGA1b, и KKPRGPRK для HMGA2 [102]. Эти мотивы взаимодействуют с минорным желобом А/Т-богатых участков ДНК и получили название АТ-ловушек. Наоборот, С-терминалы содержат высокий процент негативно заряженных аминокислотных остатков.

ДНК-связывающие мотивы различно размещены вдоль молекул трех HMGA протеинов (рис. 3), что результируется во взаимодействующей модульной системе, составленной из набора трех протеинов, способных осуществлять направленные взаимодействия с различно размещенными А/Т-богатыми регионами ДНК. Структурный анализ показал, что так называемые АТ-ловушки этих белков направленно присоединяются к перекрестку (стыку) 4 цепей ДНК и к ДНК-собранной нуклеосоме [91]. Наличие трех ДНК-связывающих доменов позволяет HMGA1 взаимодействовать с несколькими А/Т -регионами вдоль линейной протяженности ДНК, что способствует устранению изломов и образованию петель ДНК и последующей транскрипции ДНК или хроматина в присутствии дистального энхансера

Рис. 3. Схема последовательностей протеинов HMGA, указывающая на различие расположение АТ-ловушек (светло-серые) и С-терминальных окончаний (черные) вдоль молекул трех протеинов

и Holo РНК P о1 II [5]. Связываясь с ДНК, упакованной в нуклеосомы, HMGA1 могут изменять ротационное обрамление нуклеосомных коровых частиц, взаимодействуя с пунктами входа и выхода нуклеосомной ДНК [90, 91] и удаляя гистон Н1 [102]. Таким образом, эти протеины могут играть роль в позиционировании или скольжении нуклеосом. Вместе с тем HMGA протеины могут взаимодействовать с различными транскрипционными факторами, причем регионы, наиболее часто вовлекаемые в протеин/протеин взаимодействия, включают в себя первый ДНК-связывающий домен и аминокислотные остатки между вторым и третьим доменами HMGA1 [113].

Промотор IL-2 гена богат АТ парами (см. рис. 1), и неудивительно, что в экспериментах по ДНКаза I-футпринтингу, HMGA связывались со многими сайтами поперек промотора. Исследования, в которых использовали антисмысловую экспрессию для HMGA мРНК, показали, что эти белки являются позитивным активатором промотора IL-2 гена [46]. Показано также, что HMGA влияют на связывание с ДНК многих главных транскрипционных факторов, таких, как NF-AT, NF-kB и AP-1. При этом архитектурные протеины изменяют связывание трансфакторов с сайтами, перекрывающими или соседствующими с их А/Т богатыми участками связывания [16]. Так высокие концентрации HMGA способны ингибировать связывание NF-AT [46, 103]. Кроме того, HMGA могут оказывать различные воздействия на трансфакторы одного и того же семейства. Так, например, HMGA оказывает большое положительное влияние на in vitro связывание c-Rel, но не RelA с CD28RR IL-2 промотора [104]. Эти примеры иллюстрируют значение протеин/ протеин взаимодействий в модуляции связывания транскрипционных факторов с ДНК, осуществляемых архитектурными протеинами.

HMGA протеины участвуют в регуляции многих генов. Однако одним из наиболее изученных механизмов генной регуляции, в которую вовлекаются эти протеины, является регуляция гена интерферона-p. Активация экспрессии INF-в обусловлена мультифакторным комплексом, который собирается в энхансерном регионе гена, свободного от нуклеосомы. Этот комплекс формируется трансфакторами NF-kB, IRF, ATF-2/c-jun и HMGA1 протеинами [79, 130]. HMGA1 выполняют двойную функцию в этом процессе: 1) они индуцируют аллостерические изменения в ДНК, увеличивая таким образом сродство транскрипционных факторов (TFs) к их связывающим сайтам и 2) устанавливают протеин/протеин взаимодействия с этими же факторами. Данная новая структура, называемая энхансеосо-мой, ответственна за модификацию и ремоделирование нуклеосомы, которая маскирует ТАТА-бокс, что способствует начальной транскрипции. Это ремоделирование запускается рекрутированием на энхансеосому ацетилтрансферазных протеинов СВР/р300 и ассоциированных с ними факторов PCAF/GCN5, которые в дополнение к модификации

гистонов ацетилируют HMGA1 [79]. Ацетилирование последних по Lys7l посредством PCAF/GCN5 приводит к стабилизации энхансеосомы. Позже другая ацетилтрансфераза, СВР/р3GG, модифицирует HMGA1 по Lys65, что дестабилизирует энхансеосому и репрессирует транскрипцию.

Рекрутирование на промотор/энхансер-элемент хроматина ремоделирующих факторов ген-специфическими молекулярными комплексами, очевидно, является широко распространенным механизмом активации генов. Важно подчеркнуть, что HMGА участвуют в регуляции большого числа генов, действуя механизмами очень сходными с таковыми для INF-в гена. Примером таких генов могут служить ген IL-2Ra и ген рецептора инсулина (IR) [12, 91].

Суммируя вышеизложенное можно заключить, что протеины HMGA прямо связываются с ДНК, модифицируя ее конформацию и облегчая в результате связывание группы транскрипционных факторов. С другой стороны, протеины HMGA взаимодействуют как с ДНК, так и с TFs, генерируя мультипротеиновый стереоспецифический комплекс, связанный с ДНК [79]. Кроме того, протеины HMGA взаимодействуют с TF, который обладает низким сродством к ДНК, модифицируя его конформацию и обеспечивая его связывание с ДНК с высокой аффиностью. Наконец, замещая гистон Н1, протеины HMGA способствуют дерепрессии транскрипции [1G2].

Транскрипционные ко-активаторы СВР ир300. Транскрипционные ко-активаторы СВР (CREB связывающий протеин) и р300 являются ключевыми регуляторами транскрипции, опосредованной РНК полимеразой II. Данные, полученные на пациентах, нокаутированных мышах и исследования, использующие различные культуры клеток, указывают, что способность этих мультидоменных протеинов ацетилировать гистоны и иные протеины является критической для многих биологических процессов. СВР и/или его паралог р300 представлены во всех многоклеточных организмах, но не у низших эукариотах, таких, как дрожжи [132]. Сравнение аминокислотных последовательностей этих мультидоменных протеинов из различных источников обнаружило присутствие многих почти идентичных регионов: три Cys-His богатых региона (СН1, 2 и 3), связывающий сайт для транскрипционного фактора CREB (KIX домен), бромо-домен, HAT-домен и домен взаимодействия с ко-активатором 1 стероидных рецепторов (SID), тогда как другие регионы являются мало консервативными (рис. 4) [132].

СВР и р300 могут взаимодействовать с факторами базальной транскрипции, ТАТА-связывающими протеинами ТВР и TFIIB и/или формировать комплекс с РНК-полимеразой II [23, 82, 118]. Эти взаимодействия осуществляются через N- и С-терминальные активационные домены AD (см. рис. 4).

В дополнение СВР и р300 могут связывать множество разнообразных транскрипционных факторов и других протеинов через свои CH1-, CH3-, KIX- и SID-домены [19, 118]. Посредством одновременных взаимодействий с базальной транскрипционной машиной и с одним или более upstream транскрипционными факторами СВР и р300 функционируют как

AD AD

I-----------------1 I--------------------1

PHD finger ])(і

СВР/

Р300

СНІ

КПЗ BD

SID

Рис. 4. Структура протеинов семейства СВР/р300

Представлены регионы и функциональные домены, которые являются высоко консервативными для СВР и р300.

физические мосты или каркасы, стабилизируя тем самым транскрипционный комплекс. Интересно, что некоторые из этих протеин/протеин взаимодействий могут регулироваться теми же самыми пост-транскрипционными модификациями, субъектом которых является хроматин, такими, как фосфорилирование [1], сумоилирование [39] и метилирование [127], указывая тем самым, что СВР и р300 сами являются мишенями сигнальных каскадов.

Вторым важным аспектом ко-активаторной функции СВР и р300 является их способность ацетилировать гистоны нуклеосомы на проксимальном промоторе, что приводит к увеличению доступности ДНК для других важных регуляторов [58, 118]. Внутри НАТ-домена СВР и р300 были идентифицированы два функционально важных региона. Один из них (аминокислоты 1495-1541 в СВР) является частично консервативным среди протеинов НАТ, и постулировалось, что он является связывающим сайтом Co-A [72]. Второй важный регион в НАТ-домене СВР, который не найден в других протеинах НАТ, это Zn-фингер PHD типа. Он характеризуется (Cys^-His-Cys-мотивом и преимущественно находится в протеинах, которые функционируют на уровне хроматина. Zn-фингер PHD является интегральной частью энзиматического ядра ацетилтрансферазного домена СВР [9, 55], но он необязателен для НАТ активности р300 [9]. НАТ-домену предшествует бромо-домен, построенный из 110 аминокислот, который найден во многих хроматин-ассоциированных протеинах. Функция бромо-домена — связывание ацетиллизина [29] и он, следовательно, может играть роль в присоединении СВР и р300 к специфическим сайтам хроматина.

Предпочтительные сайты in vitro ацетилирования N-терминальных хвостов гисто-нов посредством СВР/р300 — это Lys12 и Lys15 в гистоне Н2В, Lys14 и Lys18 в гистоне Н3 и Lys5 и Lys8 в гистоне Н4 [98]. В дополнение к их способности ацетилировать гистоны СВР и р300 ацетилируют и другие протеины, подобные транскрипционным факторам и ко-активаторам. В этих случаях СВР и р300 выступают в роли факторов ацетилтрансфераз-ных активностей (FAT) и осуществляют равноценно важный способ транскрипционной регуляции, влияя на формирование или разрушение протеин/протеин или протеин/ДНК взаимодействий. Одним из примеров такой функции является ассоциация СВР/р300 с дополнительными HATs PCAF/GCN5, о которой говорилось выше. Для сборки полноценной энхансеосомы на INF-в энхансере необходимо ацетилирование HMGA1 по остатку Lys71, которое, по-видимому, осуществляется примерно через 4 ч после вирусной инфекции посредством PCAF/GCN5. Во время пика ацетилирования Lys71 HMGA1 все активаторы гена интерферона-Р находятся на энхансере, запирая энхансеосому в «метастабильной» конфигурации, которая инициирует рекрутирование Pol II, SWI/SNF и TFIID. Последующее ацетилирование Lys65 посредством СВР/р300 коррелирует деацетилирование Lys71, нарушает взаимодействие HMGA1 с ДНК энхансера INF-в и дестабилизирует энхансеосому [79].

Другим примером нарушения протеин/протеин взаимодействий посредством FAT служит ко-репрессор CtB (карбокси-терминал связывающий протеин). Взаимодействия ко -репрессора CtB со множеством транскрипционных репрессоров будут блокировано ацетилирированием сайтов взаимодействия CtB с помощью гистон-ацетилазы СВР/р300 [134]. Наконец FAT влияет на сохранение в ядре ядерного фактора гепатоцитов (HNF4) или half-life протеинов E2F. Таким образом, в то время как СВР и р300 являются существенными ко-активаторами для множества транскрипционных факторов, относительная важность мост/каркас функции HAT/FAT варьируют.

Важность ацетилтрансферазной функции СВР и р300 в фундаментальных биологических процессах указывает на то, что их энзиматическая активность, вероятно, является

субъектом регуляции. НАТ-активность СВР и р300 положительно регулируется in vitro посредством фосфорилирования р42/р44 МАР киназой [1] или протеинкиназой А (РКА) [11]. Наоборот, протеинкиназа С5 опосредует фосфорилирование консервативного остатка Ser89, уменьшая активность СВР [132]. Необходимо отметить, что Ser89 является единственным сайтом фосфорилирования, который был подтвержден in vivo. Поэтому биологическую значимость in vitro фосфорилирования СВР/р300 посредством р42/р44 МАР киназой, cdk2 и РКА необходимо еще установить.

Взаимодействие с другими протеинами также могут влиять на НАТ активность СВР и р300 или в позитивной, или в негативной манере. Например, взаимодействие с транскрипционными факторами такими, как CААТ/энхансер, связывающий протеин (С/EBPa), ядерный фактор эритроидного происхождения (2NF-E2) и ядерный фактор гепатоцитов (HNF-1 a) положительно регулирует НАТ активность СВР/р300 [20], тогда как связывание транскрипционного фактора PU.1 (Ets семейство онкопротеинов) ингибирует ацетилтранс-феразную активность [49].

Позиционированная нуклеосома на промоторе IL-2 гена. Многочисленными работами по изучению ДНК последовательности, необходимой для позиционирования нуклеосом, обнаружено, что высокогибкая поли (АТ) ДНК собирает нуклеосомы более легко, чем суммарная ДНК [2, 122, 123]. Исследования установили, что искусственная повторяющаяся последовательность TATAAACGCC обладает наивысшей аффинностью для связывания нуклеосом и собирает четко позиционированную нуклеосому. Последнее, очевидно, обусловливается чередующимися A/С и С/G богатыми элементами в фазе со спиральным повтором, что обеспечивает гибкую последовательность, которая может бороться с торсионным напряжением, когда она ассоциирована с нуклеосомами. Последовательность проксимального промотора IL-2 имеет высокое содержание A/T (~ 65 %), превышающее таковое в других индуцибельных цитокиновых генах (например, в промоторе GM-CSF А/Т содержание около 48 %). Заметная периодичность А/Т протяженности в 10-20 п. н. через большую часть региона минимального промотора IL-2 могла бы потенциально поставить эту последовательность в нуклеосома-позиционирующий класс ДНК фрагментов, содержащих «ТАТА-тетрады».

Чтобы определить роль структуры хроматина в регуляции транскрипции гена IL-2, исследователи [4] изучили сборку нуклеосомы поперек промотора IL-2. С этой целью были использованы радиоактивно меченые фрагменты промотора, простирающие от -235 до -55 п. н. (180 п. н.) и от -220 до -1 п. н. (220 п. н.). Было осуществлено картирование расщепления этих фрагментов ДНКазой I и расщепления их по гидроксильным радикалам (DNAaseI and hydroxyl radikal footprinting). Кроме того, были определены границы трансляционно-позиционированной нуклеосомы с помощью различных энзимов рестрикции (MseI, HinfI и SspI). Результаты этих экспериментов показали, что in vitro позиционированная нуклеосома локализована на участке промотора простирающемся от - 210 до - 60 п. н. Как уже говорилось выше, этот участок промотора включает в себя регионы CD28RR, NFIL-2B и ARRE1, которые содержат сайты связывания для NF-kB, NF-AT, AP-1, CREB и HMGA1. Связывание транскрипционных факторов с этими сайтами (за исключением архитектурного протеина HMGA1) блокировалось присутствием нуклеосомы. Вместе с тем нуклеосома делает недоступным и ТАТА-бокс. Напомним, что в Treg клетках с ДНК ARRE1-сайта и трансфактором NF-AT, локализованном в этом сайте, взаимодействует FoxP3.

Данные по доступности хроматина промотора гена IL-2 в покоящихся Jurkat Т-клетках, полученные из геномного футпринтинга посредством PCR соединенного

с лигированием (LM-PCR), а также из опытов по изучению доступности рестриктазам (DraI, MseI и HinfI) иMNase с использованием real-time PCR (CHART-PCR), представили доказательства наличия сходно позиционированной нуклесомы in vivo на этом промоторе [4]. Аналогичные результаты были получены на линии T-клеток EL4. Анализ доступности хроматина промотора гена IL-2 посредством CHART-PCR показал, что позиционированная нуклеосома локализована на участке от - 200 до - 60 п. н. [89]. Регион, охваченный этой нуклеосомой, становится ремоделированным после активации как Jurkat, так и EL4 клеток. Данное ремоделирование требует сочетания TCR-сигнализации и CD28 ко-стимуляции, которая приводит к ацетилированию гистонов, деметелированию цитозина, ремоделированию хроматина и большей доступности ДНК-связывающим протеинам [4,

89, 114]. Однако подобное ремоделирование нуклеосомы, позиционированной на этом участке IL-2 промотора, становится невозможным в регуляторных Т-клетках [108], поскольку ARRE1 регуляторный элемент блокирован комплексом NF-AT — FoxP3 [126].

Итак, транскрипция IL-2 гена плотно контролируется объединенными действиями многочисленных транскрипционных активаторов, взаимодействующих с регуляторным промотором этого гена. Однако вклад последовательностей корового промотора и архитектуры регуляторного региона IL-2 в установке уровней его транскрипции остается не ясным. Тем не менее становится очевидным, что регуляторный промотор IL-2 лишен многих свойств, ассоциированных с энхансерными элементами. Так, например, местоположение и ориентация между регионами, регуляторного и корового промотора IL-2 являются важными для установления уровня транскрипции этого гена. Более того, регуляторный регион промотора IL-2 способен опосредовать высокие уровни экспрессии, даже тогда, когда спиральное фазирование между сайтами связывания трансфакторов нарушается [121].

Несмотря на то, что минимальный промотор IL-2 гена весьма активен in vitro, эта область или более обширный фрагмент гена IL-2 размером 2,8 kb upstream, не дают тканеспецифическую и зависимую от числа копий активацию in vivo, которая повторяет транскрипцию эндогенного гена IL-2 [10, 75]. Таким образом, другие регуляторные элементы должны располагаться дальше 5' upstream, контролируя экспрессию гена IL-2 in vivo. В соответствии с этим взглядом, экспрессия в мышах зеленого флуюоресцирующего белка (GRP) под контролем последовательности 5’ upstream IL-2 размером 8,4 kb имела большее сходство с экспрессией эндогенного гена IL-2 [133].

Суммируя все вышесказанное, можно заключить, что регуляторный промотор гена IL-2 не является «высококонсервативным энхансером», который способен регулировать экспрессию данного гена in vivo и на котором может собираться энхансеосома. Очевидно, что его можно рассматривать как минимальный регуляторный регион гена интерлейкина-2.

Литература

1. Ait-Si-Ali S., Carlisi D., Ramirez S. Phosphorylation by p44 MAP Kinase/ERK1 stimulates CBP histone acetyl transferase activity in vitro // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. Vol. 262. N 1. P. 157-162.

2. Anselmi C., Bocchinfuso G., De Santis P. A theoretical model for the prediction of sequence-dependent nucleosome thermodynamic stability // Biophys. J. 2000. Vol. 79. N 2. P. 601-613.

3. Aoki C. A., Roifman C. M., Lian Z. X. IL-2 receptor alpha deficiency and features of primary biliary cirrhosis // J. Autoimmun. 2006. Vol. 27. N 1. P. 50-53.

4. Attema J. L., ReevesR., Murray V The human IL-2 gene promoter can assemble a positioned nucleosome that becomes remodeled upon T cell activation // J. Immunol. 2002. Vol. 169. N 5. P. 2466-2476.

5. BaggaR., MichalowskiS., SabnisR. HMG I/Y regulates long-range enhancer-dependent transcription on DNA and chromatin by changes in DNA topology // Nucleic Acids Res. 2000. Vol. 28. N 13. P. 2541-2550.

6. Bazan J. F Unraveling the structure of IL-2 // Science. 1992. Vol. 257. N 5068. P. 410-413.

7. Bensinger S. J., Walsh P. T., Zhang J. Distinct IL-2 receptor signaling pattern in CD4+CD25+ regulatory T cells // J. Immunol. 2004. Vol. 172. N 9. P 5287-5296.

8. Bodor J., Bodorova J., GressR. E. Suppression of T cell function: a potential role for transcriptional repressor ICER // J. Leukoc. Biol. 2000. Vol. 67. N 6. P. 774-779.

9. Bordoli L., Husser S., Luthi U. Functional analysis of the p300 acetyltransferase domain: the PHD finger of p300 but not of CBP is dispensable for enzymatic activity // Nucleic Acids Res. 2001. Vol. 29. N 21. P. 4462-4471.

10. Brombacher F., Schafer T., Weissenstein U. IL-2 promoter-driven lacZ expression as a monitoring tool for IL-2 expression in primary T cells of transgenic mice // Int. Immunol. 1994. Vol. 6. N 2. P 189-197.

11. Brouillard F., Cremisi C. E. Concomitant increase of histone acetyltransferase activity and degradation of p300 during retinoic acid-induced differentiation of F9 cells // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. N 41. P. 39509-39516.

12. Brunetti A., Manfioletti G., Chiefari E. Transcriptional regulation of human insulin receptor gene by the high-mobility group protein HMGI (Y) // FASEB J. 2001. Vol. 15. N 2. P. 492-500.

13. Bryceson Y. T., March M. E., Ljunggren H. G., LongE. O. Activation, coactivation, and costimulation of resting human natural killer cells // Immunol. Rev. 2006. Vol. 214. P 73-91.

14. Burchill M. A., Yang J., Vang K. B., Farrar M. A. Interleukin-2 receptor signaling in regulatory T cell development and homeostasis // Immunol. Lett. 2007a. Vol. 114. N 1. P. 1-8.

15. Burchill M. A., Yang J., Vogtenhuber C. IL-2 receptor beta-dependent STAT5 activation is required for the development of Foxp3+ regulatory T cells // J. Immunol. 2007b. Vol. 178. N 1. P. 280-290.

16. Bustin M. Regulation of DNA-dependent activities by the functional motifs of the high-mobility-group chromosomal proteins // Mol. Cell Biol. 1999. Vol. 19. N 8. P. 5237-5246.

17. Butscher W. G., Powers C., Olive M. Coordinate transactivation of the interleukin-2 CD28 response element by c-Rel and ATF-1/CREB2 // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. N 1. P. 552-560.

18. CareyM. The enhanceosome and transcriptional synergy // Cell. 1998. Vol. 92. N 1. P. 5-8.

19. Chan H. M., La Thangue N. B. p300/CBP proteins: HATs for transcriptional bridges and scaffolds // J. Cell Sci. 2001. Vol. 114. Pt. 13. P. 2363-2373.

20. Chen C. J., Deng Z., Kim A. Y. Stimulation of CREB binding protein nucleosomal histone acetyltransferase activity by a class of transcriptional activators // Mol. Cell Biol. 2001. Vol. 21. N 2. P. 476-487.

21. Chen L., Glover J. N., Hogan P. Gl. Structure ofthe DNA-binding domains from NFAT, Fos and Jun bound specifically to DNA // Nature. 1998. Vol. 392. N 6671. P. 42-48.

22. Chinenov Y., Kerppola T. K. Close encounters of many kinds: Fos-Jun interactions that mediate transcription regulatory specificity // Oncogene. 2001. Vol. 20. N 19. P 2438-2452.

23. ChoH., Orphanides G., SunX. A human RNA polymerase II complex containing factors that modify chromatin structure // Mol. Cell Biol. 1998. Vol. 18. N 9. P. 5355-5363.

24. Comb M., Birnberg N. C., SeasholtzA. A cyclic AMP- and phorbol ester-inducible DNA element // Nature. 1986. Vol. 323. N 6086. P. 353-356.

25. Craig J. C., Schumacher M. A., Mansoor S. E. Consensus and variant cAMP-regulated enhancers have distinct CREB-binding properties // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. N 15. P. 11719-11728.

26. D’Cruz L. M., Klein L. Development and function of agonist-induced CD25+Foxp3+ regulatory T cells in the absence of interleukin 2 signaling // Nat. Immunol. 2005. Vol. 6. N 11. P. 1152-1159.

27. De CesareD., Sassone-CorsiP. Transcriptional regulation by cyclic AMP-responsive factors // Prog. Nucleic Acid. Res. Mol. Biol. 2000. Vol. 64 P. 343-369.

28. Devos R., Plaetinck G., Cheroutre H. Molecular cloning of human interleukin 2 cDNA and its expression in E. coli // Nucleic Acids Res. 1983. Vol. 11. N 13. P. 4307-4323.

29. Dhalluin C., Carlson J. E., Zeng L. Structure and ligand of a histone acetyltransferase bromodo-main. // Nature. 1999. Vol. 399. N 6735. P. 491-496.

30. DiSanto J. P., Guy-Grand D., Fisher A., TarakhovskyA. Critical role for the common cytokine receptor gamma chain in intrathymic and peripheral T cell selection // J. Exp. Med. 1996. Vol. 183. N 3. P. 1111-1118.

31. EckenbergR., Moreau J. L., Melnyk O., Theze J. IL-2R beta agonist P1-30 acts in synergy with IL-2, IL-4, IL-9, and IL-15: biological and molecular effects // J. Immunol. 2000. Vol. 165. N 8. P. 4312-4318.

32. Felinski E. A., Quinn P. G. The CREB constitutive activation domain interacts with TATA-binding protein-associated factor 110 (TAF110) through specific hydrophobic residues in one of the three subdomains required for both activation and TAF110 binding // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. N 17. P. 11672-11678.

33. Fontenot J. D., Rasmussen J. P., Gavin M. A., Rudensky A. Y. A function for interleukin 2 in Foxp3-expressing regulatory T cells // Nat. Immunol. 2005. Vol. 6. N 11. P. 1142-1151.

34. Frauwirth K. A., Thompson C. B. Regulation of T lymphocyte metabolism // J. Immunol. 2004. Vol. 172. N 8. P. 4661-4665.

35. Fujita T., Shibuya H., Ohashi T. Regulation of human interleukin-2 gene: functional DNA sequences in the 5’ flanking region for the gene expression in activated T lymphocytes // Cell. 1986. Vol. 46. N 3. P. 401-405.

36. Gaffen S. L., Liu K. D. Overview of interleukin-2 function, production and clinical applications // Cytokine. 2004. Vol. 28. N 3. P. 109-123.

37. Ganusov V. V., Milutinovic D., De Boer R. J. IL-2 regulates expansion of CD4+ T cell populations by affecting cell death: insights from modeling CFSE data // J. Immunol. 2007. Vol. 179. N 2. P. 950-957.

38. Ghosh S., May M. J., Kopp E. B. NF-kappa B and Rel proteins: evolutionarily conserved mediators of immune responses // Annu. Rev. Immunol. 1998. Vol. 16. P. 225-260.

39. Girdwood D., Bumpass D., Vaughan O. A. P300 transcriptional repression is mediated by SUMO modification // Mol. Cell. 2003. Vol. 11. N 4. P. 1043-1054.

40. Goebel J., Forrest K., Wills-Karp M., Roszman T. L. Tubulin polymerization modulates interleukin-2 receptor signal transduction in human T cells // J. Recept. Signal. Transduct. Res. 2006. Vol. 26. N 1-2. P. 87-106.

41. Goldsmith M. A., Lai S. Y., Xu W. Growth signal transduction by the human interleukin-2 receptor requires cytoplasmic tyrosines of the beta chain and non-tyrosine residues of the gamma c chain // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. N 37. P. 21729-21737.

42. Goldsmith, M. A., Greene W. C. // Cytokine Handbook / Ed. by A. Thomson. London, 1994. P. 57-80.

43. Gong D., Malek T. R. Cytokine-dependent Blimp-1 expression in activated T cells inhibits IL-2 production // J. Immunol. 2007. Vol. 178. N 1. P. 242-252.

44. Granucci F., Vizzardelli C., Pavelka N. Inducible IL-2 production by dendritic cells revealed by global gene expression analysis // Nat. Immunol. 2001. Vol. 2. N 9. P. 882-888.

45. Haus-Seuffert P., Meisterernst M. Mechanisms of transcriptional activation of cAMP-responsive element-binding protein CREB // Mol. Cell Biochem. 2000. Vol. 212. N 1-2. P. 5-9.

46. Himes S. R., Reeves R., Attema J. The role of high-mobility group I (Y) proteins in expression of IL-2 and T cell proliferation // J. Immunol. 2000. Vol. 164. N 6. P. 3157-3168.

47. Ho I. C., Kim J. I., Szabo S. J., Glimcher L. H. Tissue-specific regulation of cytokine gene expression // Cold Spring. Harb. Symp. Quant. Biol. 1999. Vol. 64. P. 573-584.

48. Hogan P. G., Chen L., Nardone J., Rao A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT // Genes Dev. 2003. Vol. 17. N 18. P. 2205-2232.

49. Hong W., Kim A. Y., Ky S. Inhibition of CBP-mediated protein acetylation by the Ets family oncoprotein PU.1 // Mol. Cell. Biol. 2002. Vol. 22. N 11. P. 3729-3743.

50. Hsu H. C., Matsuki Y., Zhang H. G. The Fas signaling connection between autoimmunity and embryonic lethality // J. Clin. Immunol. 2001. Vol. 21. N 1. P. 1-14.

51. Hwang E. S., Hong J. H., Glimcher L. H. IL-2 production in developing Th1 cells is regulated by heterodimerization of RelA and T-bet and requires T-bet serine residue 508 // J. Exp. Med. 2005. Vol. 202. N 9. P. 1289-1300.

52. Johannessen M., Delghandi M. P., Moens U. What turns CREB on? // Cell Signal. 2004. Vol. 16. N 11. P. 1211-1227.

53. Johnson K. R., Lehn D. A., Elton T. S. Complete murine cDNA sequence, genomic structure, and tissue expression of the high mobility group protein HMG-I (Y) // J. Biol. Chem. 1988. Vol. 263. N 34. P. 18338-18342.

54. Juang Y. T., Wang Y., Solomou E. E. Systemic lupus erythematosus serum IgG increases CREM binding to the IL-2 promoter and suppresses IL-2 production through CaMKIV // J. Clin. Invest. 2005. Vol. 115. N 4. P. 996-1005.

55. Kalkhoven E., Teunissen H., Houweling A. The PHD type zinc finger is an integral part of the CBP acetyltransferase domain // Mol. Cell. Biol. 2002. Vol. 22. N 7. P. 1961-1970.

56. KhattriR., Cox T., Yasayko S. A., RamsdellF. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells // Nat. Immunol. 2003. Vol. 4. N 4. P. 337-342.

57. Kim H. P., Imbert J., Leonard W. J. Both integrated and differential regulation of components of the IL-2/IL-2 receptor system // Cytokine Growth. Factor Rev. 2006. Vol. 17. N 5. V. 349-366.

58. Kundu T. K., Palhan V. B., Wang Z. Activator-dependent transcription from chromatin in vitro involving targeted histone acetylation by p300 // Mol. Cell. 2000. Vol. 6. N 3. P. 551-561.

59. Kuo C. T., Leiden J. M. Transcriptional regulation of T lymphocyte development and function // Annu. Rev. Immunol. 1999. Vol. 17. P. 149-187.

60. Lamaze C., Dujeancourt A., Baba T. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway // Mol. Cell. 2001. Vol. 7. N 3. P. 661-671.

61. Lenardo M., Chan K. M., Hornung F. Mature T lymphocyte apoptosis - immune regulation in a dynamic and unpredictable antigenic environment // Annu. Rev. Immunol. 1999. Vol. 17. P. 221-253.

62. Leonard W. J. Cytokines and immunodeficiency diseases // Nat. Rev. Immunol. 2001. Vol. 1. N 3. P. 200-208.

63. Leonard W. J., Depper J. M., Crabtree G. R. Molecular cloning and expression of cDNAs for the human interleukin-2 receptor // Nature. 1984. Vol. 311. N 5987. P. 626-631.

64. Lin J. X., Leonard W. J. Signaling from the IL-2 receptor to the nucleus // Cytokine. Growth. Factor. Rev. 1997. Vol. 8. N 4. P. 313-332.

65. Lord J. D., McIntosh B. C., Greenberg P. D., Nelson B. H. The IL-2 receptor promotes lymphocyte proliferation and induction of the c-myc, bcl-2, and bcl-x genes through the trans-activation domain of Stat5 // J. Immunol. 2000. Vol. 164. N 5. P. 2533-2541.

66. Ma A. Pleiotropic functions of IL-15 in innate and adaptive immunity // Mod. Aspects Immunobiol.

2000. Vol. 1. P. 102-104.

67. Macian F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function // Nat. Rev. Immunol.

2005. Vol. 5. N 6. P. 472-484.

68. Macian F., Lopez-Rodriguez C., RaoA. Partners in transcription: NFAT and AP-1 // Oncogene. 2001. Vol. 20. N 19. P. 2476-2489.

69. Maerten P., Shen C., Bullens D. M. Effects of interleukin 4 on CD25+CD4+ regulatory T cell function // J. Autoimmun. 2005. Vol. 25. N 2. P. 112-120.

70. Malek T. R. The main function of IL-2 is to promote the development of T regulatory cells // J. Leukoc. Biol. 2003. Vol. 74. N 6. P. 961-965.

71. Malek T. R., Bayer A. L. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2 // Nat. Rev. Immunol. 2004. Vol. 4. N 9. P. 665-674.

72. Marmorstein R., Roth S. Y. Histone acetyltransferases: function, structure, and catalysis // Curr. Opin. Genet. Dev. 2001. Vol. 11. N 2. P. 155-161.

73. Mayr B., Montminy M. Transcriptional regulation by the phosphorylation-dependent factor CREB // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001. Vol. 2. N 8. P. 599-609.

74. McGuire K. L., Iacobelli M. Involvement of Rel, Fos, and Jun proteins in binding activity to the IL-2 promoter CD28 response element/AP-1 sequence in human T cells // J. Immunol. 1997. Vol. 159. N 3. P. 1319-1327.

75. Minasi L. E., Kamogawa Y., Carding S. The selective ablation of interleukin 2-producing cells isolated from transgenic mice // J. Exp. Med. 1993. Vol. 177. N 5. P. 1451-1459.

76. Miyazaki T., Liu Z. J., KawaharaA. Three distinct IL-2 signaling pathways mediated by bcl-2, c-myc, and lck cooperate in hematopoietic cell proliferation // Cell. 1995. Vol. 81. N 2. P. 223-231.

77. Montminy M. R., Sevarino K. A., Wagner J. A. Identification of a cyclic-AMP-responsive element within the rat somatostatin gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. Vol. 83. N 18. P. 6682-6686.

78. Morgan D. A., Ruscetti F. W., Gallo R. Selective in vitro growth of T lymphocytes from normal human bone marrows // Science. 1976. Vol. 193. N 4257. P. 1007-1008.

79. Munshi N., Agalioti T., Lomvardas S. Coordination of a transcriptional switch by HMGI (Y) acetylation // Science. 2001. Vol. 293. N 5532. P. 1133-1136.

80. Nakamura Y., Russell S. M., Mess S. A. Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signaling // Nature. 1994. Vol. 369. N 6478. P. 330-333.

81. Naranjo-Gomez M., Oliva H., Climent N. Expression and function of the IL-2 receptor in activated human plasmacytoid dendritic cells // Eur. J. Immunol. 2007. Vol. 37. N 7. P. 1764-1772.

82. Neish A. S., Anderson S. F., Schlegel B. P. Factors associated with the mammalian RNA polymerase

II holoenzyme // Nucleic. Acids. Res. 1998. Vol. 26. N 3. P. 847-853.

83. Nelson B. H., WillerfordD. M. Biology of the interleukin-2 receptor // Adv. Immunol. 1998. Vol. 70.

P. 1-81.

84. Nikaido T., Shimizu A., Ishida N. Molecular cloning of cDNA encoding human interleukin-2 receptor // Nature. 1984. Vol. 311. N 5987. P. 631-635.

85. Pei Y., Zhu P., Dang Y. Nuclear export of NF90 to stabilize IL-2 mRNA is mediated by AKT-dependent phosphorylation at Ser647 in response to CD28 costimulation // J. Immunol. 2008. Vol. 180. N 1. P. 222-229.

86. Peng S. L., Gerth A. J., Ranger A. M., Glimcher L. H. NFATc1 and NFATc2 together control both T and B cell activation and differentiation // Immunity. 2001. Vol. 14. N 1. P. 13-20.

87. Phillips K., Luisi B. The virtuoso of versatility: POU proteins that flex to fit // J. Mol. Biol. 2000. Vol. 302. N 5. P. 1023-1039.

88. Quinn P. G. Mechanisms of basal and kinase-inducible transcription activation by CREB // Prog. Nucleic Acid. Res. Mol. Biol. 2002. Vol. 72. P. 269-305.

89. RaoS., GerondakisS., WoltringD., ShannonM. F. c-Rel is required for chromatin remodeling across the IL-2 gene promoter // J. Immunol. 2003. Vol. 170. N 7. P. 3724-3731.

90. Reeves R. Molecular biology of HMGA proteins: hubs of nuclear function // Gene. 2001. Vol. 277. N 1-2. P. 63-81.

91. ReevesR., Leonard W. J., Nissen M. S. Binding of HMG-I (Y) imparts architectural specificity to a positioned nucleosome on the promoter of the human interleukin-2 receptor alpha gene // Mol. Cell Biol. 2000. Vol. 20. N 13. P. 4666-4679.

92. Refaeli Y., Van Parijs L., London C. A. Biochemical mechanisms of IL-2-regulated Fas-mediated T cell apoptosis // Immunity. 1998. Vol. 8. N 5. P. 615-623.

93. Rickert M., Wang X., Boulanger M. J. The structure of interleukin-2 complexed with its alpha receptor // Science. 2005. Vol. 308. N 5727. P. 1477-1480.

94. Rothenberg E. V., Ward S. B. A dynamic assembly of diverse transcription factors integrates activation and cell-type information for interleukin 2 gene regulation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol. 93. N 18. P. 9358-9365.

95. Sakaguchi S. Naturally arising FoxP3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self // Nat. Immunol. 2005. Vol. 6. P. 345-352

96. Sakaguchi S., Powrie F. Emerging challenges in regulatory T cell function and biology // Science.

2007. Vol. 317. N 5838. P. 627-629.

97. Sakaguchi S., Sakaguchi N., Asano M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases // J. Immunol. 1995. Vol. 155. N 3. P. 1151-1164.

98. Schiltz R. L., Mizzen C. A., Vassilev A. Overlapping but distinct patterns of histone acetylation by the human coactivators p300 and PCAF within nucleosomal substrates // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. N 3. P. 1189-1192.

99. Schumacher M. A., Goodman R. H., Brennan R. G. The structure of a CREB bZIP. somatostatin CRE complex reveals the basis for selective dimerization and divalent cation-enhanced DNA binding // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. N 45. P. 35242-35247.

100. SeigelL. J., HarperM. E., Wong-StaalF. Gene for T-cell growth factor: location on human chromosome 4q and feline chromosome B1 // Science. 1984. Vol. 223. N 4632. P. 175-178.

101. Setoguchi R., Hori S., Takahashi T., Sakaguchi S. Homeostatic maintenance of natural Foxp3(+) CD25(+) CD4(+) regulatory T cells by interleukin (IL)-2 and induction of autoimmune disease by IL-2 neutralization // J. Exp. Med. 2005. Vol. 201. N 5. P. 723-735.

102. Sgarra R., Rustighi A., TessariM. A. Nuclear phosphoproteins HMGA and their relationship with chromatin structure and cancer // FEBS Lett. 2004. Vol. 574. N 1-3. P. 1-8.

103. Shang C., Attema J., CakourosD. Nuclear factor of activated T cells contributes to the function of the CD28 response region of the granulocyte macrophage-colony stimulating factor promoter // Int. Immunol.

1999. Vol. 11. N 12. P. 1945-1956.

104. Shannon M. F., Coles L. S., Attema J., Diamond P. The role of architectural transcription factors in cytokine gene transcription // J. Leukoc. Biol. 2001. Vol. 69. N 1. P. 21-32.

105. Shapiro V. S., Truitt K. E., Imboden J. B., Weiss A. CD28 mediates transcriptional upregulation of the interleukin-2 (IL-2) promoter through a composite element containing the CD28RE and NF-IL-2B AP-1 sites // Mol. Cell Biol. 1997. Vol. 17. N 7. P. 4051-4058.

106. Shaulian E., KarinM. AP-1 as a regulator of cell life and death // Nat. Cell Biol. 2002. Vol. 4. N 5. P. E131-E136.

107. Stauber D. J., Debler E. W., Horton P. A. Crystal structure of the IL-2 signaling complex: paradigm for a heterotrimeric cytokine receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2006. Vol. 103. N 8. P. 2788-2793.

108. Su L., Creusot R. J., Gallo E. M. Murine CD4+CD25+ regulatory T cells fail to undergo chromatin remodeling across the proximal promoter region of the IL-2 gene // J. Immunol. 2004. Vol. 173. N 8. P. 4994-5001.

109. Suzuki H., Zhou Y. W., Kato M. Normal regulatory alpha/beta T cells effectively eliminate abnormally activated T cells lacking the interleukin 2 receptor beta in vivo // J. Exp. Med. 1999. Vol. 190. N 11 P. 1561-1572.

110. Tangye S. G., Avery D. T., Deenick E. K., Hodgkin P. D. Intrinsic differences in the proliferation of naive and memory human B cells as a mechanism for enhanced secondary immune responses // J. Immunol. 2003. Vol. 170. N 2. P. 686-694.

111. Taniguchi T. Cytokine signaling through nonreceptor protein tyrosine kinases // Science. 1995. Vol. 268. N 5208. P. 251-255.

112. Taniguchi T., Matsui H., Fujita T. Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2 // Nature. 1983. Vol. 302. N 5906. P. 305-310.

113. TessariM. A., Gostissa M., Altamura S. Transcriptional activation of the cyclin A gene by the architectural transcription factor HMGA2 // Mol. Cell Biol. 2003. Vol. 23. N 24. P. 9104-9116.

114. Thomas R. M., Gao L., Wells A. D. Signals from CD28 induce stable epigenetic modification of the IL-2 promoter // J. Immunol. 2005. Vol. 174. N 8. P. 4639-4646.

115. Turku L. A., Walsh P. T. IL-2 signaling and CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells // Front. Biosci.

2008. Vol. 13. P. 1440-1446.

116. Van Parijs L., Abbas A. K. Homeostasis and self-tolerance in the immune system: turning lymphocytes off // Science. 1998. Vol. 280. N 5361. P. 243-248.

117. Villarino A. V., Tato C. M., Stumhofer J. S. Helper T cell IL-2 production is limited by negative feedback and STAT-dependent cytokine signals // J. Exp. Med. 2007. Vol. 204. N 1. P. 65-71.

118. Vo N., Goodman R. H. CREB-binding protein and p300 in transcriptional regulation // J. Biol. Chem.

2001. Vol. 276. N 17. P. 13505-13508.

119. Walsh P. T., Buckler J. L., Zhang J. PTEN inhibits IL-2 receptor-mediated expansion of CD4+ CD25+ Tregs // J. Clin. Invest. 2006 Vol. 116. N 9. P. 2521-2531.

120. Weaver C. T., Harrington L. E., Mangan P. R. Th17: an effector CD4 T cell lineage with regulatory T cell ties // Immunity. 2006. Vol. 24. N 6. P. 677-688.

121. WeaverJ. R., Good K., Walters R. D. Characterization ofthe sequence and architectural constraints of the regulatory and core regions of the human interleukin-2 promoter // Mol. Immunol. 2007. Vol. 44. N 11. P. 2813-2819.

122. WidlundH. R., KuduvalliP. N., BengtssonM. Nucleosome structural features and intrinsic properties of the TATAAACGCC repeat sequence // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. N 45. P. 31847-31852.

123. Widlund H. R., Vitolo J. M., Thiriet C., Hayes J. J. DNA sequence-dependent contributions of core histone tails to nucleosome stability: differential effects of acetylation and proteolytic tail removal // Biochemistry.

2000. Vol. 39. N 13. P. 3835-3841.

124. Wilczynski J. R., Radwan M., Kalinka J. The characterization and role of regulatory T cells in immune reactions // Front. Biosci. 2008. Vol. 13. P. 2266-2274.

125. WilliamsL. M., RudenskyA. Y. Maintenance of the Foxp3-dependent developmental program in mature regulatory T cells requires continued expression of Foxp3 // Nat. Immunol. 2007. Vol. 8. N 3. P. 277-284.

126. Wu Y., Borde M., Heissmeyer V. FOXP3 controls regulatory T cell function through cooperation with NFAT // Cell. 2006. Vol. 126. N 2. P. 375-387.

127. Xu W., Chen H., Du K. A transcriptional switch mediated by cofactor methylation // Science. 2001. Vol. 294. N 5551. P. 2507-2511.

128. YangL., Cohn L., ZhangD. H. Essential role of nuclear factor kappaB in the induction of eosinophilia in allergic airway inflammation // J. Exp. Med. 1998. Vol. 188. N 9. P. 1739-1750.

129. YaoZ., Kanno Y., KerenyiM. Nonredundant roles for Stat5a/b in directly regulating Foxp3 // Blood. 2007. Vol. 109. N 10. P. 4368-4375.

130. Yie J., MerikaM., Munshi N. The role of HMG I (Y) in the assembly and function of the IFN-beta enhanceosome // EMBO J. 1999. Vol. 18. N 11. P. 3074-3089.

131. Yu A., Malek T. R. Selective availability of IL-2 is a major determinant controlling the production of CD4+CD25+Foxp3+ T regulatory cells // J. Immunol. 2006. Vol. 177. N 8. P. 5115-5121.

132. Yuan L. W., Giordano A. Acetyltransferase machinery conserved in p300/CBP-family proteins // Oncogene. 2002. Vol. 21. N 14. P. 2253-2260.

133. YuiM. A., Hernandez-Hoyos G., RothenbergE. V. A new regulatory region of the IL-2 locus that confers position-independent transgene expression // J. Immunol. 2001. Vol. 166. N 3. P. 1730-1739.

134. Zhang Q., Yao H., Vo N., Goodman R. H. Acetylation of adenovirus E1A regulates binding of the transcriptional corepressor CtBP // Proc. Natl. Acad. Sci. uSa. 2000. Vol. 97. N 26. P. 14323-14328.

135. Zheng L., Sharma R., Gaskin F. A novel role of IL-2 in organ-specific autoimmune inflammation beyond regulatory T cell checkpoint: both IL-2 knockout and Fas mutation prolong lifespan of Scurfy mice but by different mechanisms // J. Immunol. 2007. Vol. 179. N 12. P. 8035-8041.

136. Ziegler S. F. FOXP3: of mice and men // Annu. Rev. Immunol. 2006. Vol. 24. P. 209-226.

137. Zorn E., Nelson E. A., Mohseni M. IL-2 regulates FOXP3 expression in human CD4+CD25+ regulatory T cells through a STAT-dependent mechanism and induces the expansion of these cells in vivo // Blood.

2006. Vol. 108. N 5. P. 1571-1579.

138. ZurawskiS. M., VegaF. Jr., Doyle E. L. Definition and spatial location of mouse interleukin-2 residues that interact with its heterotrimeric receptor // EMBO J. 1993. Vol. 12. N 13. P. 5113-5119.