CC BY
60
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2008 Биология Вып. 9(25)
УДК 612.018:612.017.1:611.018.53
РЕГУЛЯЦИЯ ФЕНОТИПИЧЕСКОГО СОЗРЕВАНИЯ ^ И N^1 КЛЕТОК ГОРМОНАМИ РЕПРОДУКЦИИ
С. В. Ширшева,ь, И. В. Некрасоваа, Е. Г. Орловаь
а Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13
ь Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Установлено, что главная роль в снижении числа CD3-CD16+ клеток в крови женщин в I триместре беременности принадлежит эстриолу и прогестерону (Рг). Повышение уровня МК клеток в III триместре обусловлено Рг, стимулирующий эффект которого негативно контролируется лептином. Аналогичная тенденция выявлена в отношении регуляции процентного содержания МКТ клеток гормонами репродукции: снижение уровня данных клеток в I триместре под действием хорионического гонадотропина и повышение к концу беременности под влиянием лептина и эстрадиола.
Введение
Процесс гестации является феноменом естественной трансплантации полуаллогенного плода, так как генофонд зиготы наполовину заимствован от отца. Однако при нормальном течении беременности отторжения эмбриона не происходит.
Как известно, гормоны репродукции, синтез которых тесно связан с процессом гестации, могут эффективно воздействовать на пролиферацию и дифференцировку не только репродуктивных тканей, но и клеток иммунной системы, контролирующих антигенный гомеостаз материнского организма (Ширшев, 2002). Показано, что эти гормоны могут регулировать разнообразные функции клеток иммунной системы, оказывая при этом оп-позитные по отношению друг к другу эффекты (Ширшев, Куклина, 2000).
В последнее время большое внимание уделяется исследованию функций клеток врожденного иммунитета, среди которых важную роль играют NK клетки (CD3-CD16+CD56dnn), а также NKT клетки (CD 3+CD16+CD 56+CD161+). Молекула CD16 для данных клеток является одним из главных рецепторов, передающих сигнал к активации при ее связывании. Она представляет собой низкоаффинный рецептор для Fc-фрагмента IgG1 и IgG3 (Fcy RIII) и участвует в обеспечении реакции антителозависимой клеточной цитотоксичности, а также индукции секреции цитокинов. Лигирование данного рецептора приводит к активации ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) с последующей поляризацией литических гранул и выбросом их содержимого (Bryceson et al., 2005).
Установлено, что NK клетки CD16+CD56dim проявляют большую цитотоксичность, по сравнению с CD16-CD56brigh (Cooper et al., 2001). NKT клетки способны распознавать антигены в комплексе с CD1d или молекулой главного комплекса гистосовместимости класса G (HLA-G), представленными на клетках плаценты, что может привести к аборту, а при повышении процента CD3+CD16+ клеток в I триместре беременности увеличивается риск развития гестоза (Борзова и др., 2005).
Очевидно поэтому во время физиологически протекающей беременности функции NK/NKT клеток периферического пула супрессированы (Mahmoud et al., 2004; Clark et al., 2008).
Поскольку для большинства гормонов репродукции показана экспрессия рецепторов на данных субпопуляциях лимфоцитов (Ширшев, 2002), эти гормоны могут быть основными регуляторами их функциональной активности.
Целью данного исследования явилось изучение влияния основных гормонов репродукции на процесс фенотипического созревания NK и NKT клеток в культуре.
Материалы и методы исследования
Объекты исследования
В работе использованы сепарированные моно-нуклеары периферической венозной крови здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста, полученные в фолликулярную фазу менструального цикла. Клетки выделяли из гепаринизи-рованной крови (25 МЕ/мл) центрифугированием в градиенте плотности (р = 1,077 г/мл) фиколл-верографина («Pharmacia», Швеция; «Спофа», Че-
© С. В. Ширшев, И. В. Некрасова, Е. Г. Орлова, 2008
100
хия). Чистота выделения составила 90%; жизнеспособность, определяемая в тесте с эозином, -95-98 %.
синтез прогестерониндуцируемого блокирующего фактора (PIBF) способен угнетать цитолитический потенциал МК клеток (Laskarin et а1., 1999).
Г ормоны и другие биологически активные
вещества
Гормоны использовали в концентрациях, отражающих их уровни в крови в I и III триместрах беременности соответственно: хорионический гонадотропин (ХГ) («Profasi», Италия) - 100 и 10 МЕ/мл, эстриол (Е3) («Biomedicals Inc.», Германия) - 2 и 20 нг/мл, эстрадиол (Е2) («Sigma», США) - 1 и 10 нг/мл, прогестерон (Pr) («Sigma», США) - 20 и 100 нг/мл, лептин («Sigma», США) - 10 и 35 нг/мл. В качестве контроля использовали офици-нальные растворители гормонов.
Культивирование клеток
Мононуклеары культивировали с гормонами в среде 199 (НПО «Биомед», Россия) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки («Serva», Германия), 0,01М HEPES («Serva», Германия), 300 мкг/мл L-глутамина («Serva», Германия), 100 мкг/мл гентамицина («Pharmacia», Швеция). После суточной инкубации в гейте лимфоцитов оценивали уровень CD3-CD16+ (NK) и CD3+CD16+ (NKT) клеток (Primary Anti-Human CD3, Primary AntiHuman CD16, НПО «Сорбент», Россия) на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter, США).
Статистическая обработка
При статистической обработке результатов вычислялись средняя арифметическая величина и ее стандартная ошибка. Достоверность различий между средними величинами оценивалась с помощью парного t - критерия Стьюдента. Отличия считались достоверными при р < 0,05.
Основные результаты
Установлено, что суточная инкубация клеточных культур с Е3 в концентрации, соответствующей I триместру беременности, снижает процент лимфоцитов, экспонирующих CD16. При этом в концентрации, характерной для III триместра беременности, гормон не оказывает достоверного влияния на исследуемый показатель (рис. 1). Возможно, данный эффект связан с тем, что низкие дозы Е3 способны усиливать продукцию интерлейкина-10 (Correale et al., 1998), который обладает противовоспалительной активностью и угнетает функциональную активность NK клеток (Conti et al., 2003).
Добавление в клеточные культуры Pr в концентрации, соответствующей I триместру беременности, достоверно снижает уровень CD3-CD16+ клеток. При этом доза Pr, соответствующая III триместру беременности, напротив, повышает количество CD3-CD16+ клеток в культуре (рис. 2). Как показано, Pr самостоятельно, а также опосредованно через
Г ормональное воздействие
□ CD3-CD16+ клетки □ CD3+CD16+ клетки
Рис. 1. Влияние Е3 на уровень CD 3- 16 и CD 3 16 клеток
Примечание: здесь и далее * - /><0,05 по сравнению с соответствующим контролем
В отличие от NK клеток, данные гормоны (Е3 и Pr) не оказывают статистически значимого влияния на изменение уровня NKT клеток (см. рис.1, 2). Напротив, культивирование клеток с Е2 в дозе, соответствующей III триместру, повышает процент CD3+CD16+ лимфоцитов, не влияя на уровень CD3-CD16+ клеток (рис. 3). В литературе имеются сведения о том, что Е2 способствует генерации новой субпопуляции регуляторных NKT клеток, характеризующихся высоким уровнем экспрессии молекулы CD16 (Matejuk, Afentoulis, 2006). Возможно, именно с этим эффектом гормона связано повышение процента CD3+CD16+ в данном эксперименте.
Гормональное воздействие
□ CD3-CD16+ клетки □ CD3+CD16+ клетки
Рис. 2. Влияние Рг на уровень CD3- 16 и CD3 16 клеток
ХГ не оказывает существенного влияния на уровень CD3-CD16+ клеток, но при этом достоверно снижает процентное содержание CD3+CD16+ лимфоцитов в дозе, характерной для I триместра (рис.
102
С. В. Ширшев, И. В. Некрасова, Е. Г. Орлова
4). Sulke с соавторами показано, что даже после 4 часов инкубации ХГ способен угнетать цитотокси-ческую активность МК клеток ^и1ке et а1., 1985). По всей видимости, данный эффект гормона не связан с модуляцией экспрессии молекулы CD16.
Г ормональное воздействие
□ CD3-CD16+ клетки □ CD3+CD16+ клетки
Рис. 3. Влияние Е2 на уровень CD3- 16+ и CD3+ 16+ клеток
Г ормональное воздействие
□ CD3-CD16+ клетки □ СЛ3+С016+ клетки
Рис. 4. Влияние ХГ на уровень CD3- 16+ и CD3+ 16+ клеток
При оценке роли лептина в процессах формирования цитотоксических МК и МКТ клеток установлено, что гормон в концентрации, характерной для I триместра, повышает уровень CD3-CD16+, а в дозе, соответствующей III триместру, напротив, снижает процент данных клеток. Параллельно гормон в дозе, соответствующей III триместру беременности, повышает процент CD3+CD16+ лимфоцитов (рис. 5), что подтверждает данные о существенной регулирующей роли лептина в отношении функциональной активности МК клеток (Мо^аіа et а1., 2003).
Подводя итог, можно предположить, что главная роль в снижении числа CD3-CD16+ клеток, а следовательно, и в понижении цитотоксичности всего пула МК клеток в I триместре, принадлежит Е3 и Рг. Повышение уровня МК клеток в III триме-
стре, по-видимому, обусловлено исключительно Рг, стимулирующий эффект которого негативно контролируется лептином. Это подтверждает данные о том, что, хотя количество CD3-CD16+ ЫК-клеток и снижается в I триместре, к концу беременности их уровень имеет тенденцию к увеличению и постепенному возвращению к показателям у небеременных женщин (Махмутходжаев и др., 2002). Аналогичная тенденция выявлена в отношении регуляции процентного содержания МКТ клеток гормонами репродукции: снижение уровня данных клеток в I триместре под действием ХГ и повышение к концу беременности под влиянием лептина и Е2.
нг/мл) нг/мл)
Г ормональное воздействие
□ CD3-CD16+ клетки □ CD3+CD16+ клетки
Рис. 5. Влияние лептина на уровень CD3- 16+ и CD3+16+ клеток
Таким образом, гормоны репродукции эффективно модулируют фенотипическое созревание NK и NKT клеток в зависимости от дозы, определяемой триместрами что способствует благоприятному исходу беременности.
Библиографический список
Махмутходжаев, А.Ш. Клеточный иммунитет у беременных с аутоиммунным тиреоидитом и гестозом / А.Ш. Махмутходжаев, Л.М. Огоро-дова, И.Д. Евтушенко [и др.] // Бюл. сибир. медицины. 2002. №1. С. 57-62.
Пат. 2265221 РФ. Способ прогнозирования гестоза легкой степени тяжести с ранних сроков беременности / Борзова Н.Ю., Панова И.А., Скрип-кина И.Ю., Сотникова Н.Ю, Кудряшова А.В.; опубл. 27.11.05, Бюл. № 33.
Ширшев, С.В. Механизмы иммунноэндокринного контроля процессов репродукции: в 2 т. / С.В. Ширшев. Екатеринбург: УрО РАН, 2002. Ширшев, С.В. Роль эстрадиола в гонадотропинза-висимой регуляции функций нейтрофилов /
С.В. Ширшев, Е.М. Куклина // Докл. АН. 2000. Т. 375, № 1. С. 118-120.
Bryceson, Y.T. Cytolytic granule polarizationand degranulation controlled by different receptors in resting NK cells / Y.T. Bryceson, M.E. March,
D.F. Barber // J. Exp. Med. 2005. Vol. 202, №. 7. P. 1001-1012.
Clark, D. CD200-dependent and nonCD200-depen-dant pathwaysof NK cell suppression by human IVIG / D.A. Clark, K. Wong, D. Banwatt [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. 2008. Vol. 25. P. 67-72.
Conti, P. IL-10, an inflammatory/inhibitory cytokine, but not always / P. Conti, D. Kempuraj, K. Kandere [et al.] // Immunol. Lett. 2003. Vol. 86 (2). P. 123-129.
Cooper, M.A. The biology of human natural killer-cell subsets / M.A. Cooper, T.A. Fehniger, M.A Caligiuri // Trends Immunol. 2001. Vol. 22. P. 633-640.
Correale, J. Steroid hormone regulation of cytokine secretion by proteolipid protein-specific CD4+ T cell clones isolated from multiple sclerosis patients and normal control subjects / J. Correale, M. Arias, W. Gilmore // J. Immunol. 1998. Vol. 161. P. 33653374.
Laskarin, G. Progesterone directly and indirectly affects perforin expression in cytolytic cells / G. Laskarin, N. Strbo, V. Sotosek [et al.] // Am. J. Reprod. Immunol. 1999. Vol. 42(5). P. 312-320. Mahmoud, F. Effect of IgG therapy on lymphocyte subpopulations in the peripheral blood of Kuwaiti women experiencing recurrent pregnancy loss / F. Mahmoud, M. Diejomaoh, A. Omu [et al.] // Gynecol. Obstet. Invest. 2004. Vol. 58(2). P. 77-83. Matejuk, A. Association of CD45(dim)VLA-4 (+) cells with the NKT cell lineage and their selective expression of IL-13, IP-15, and CCR3 transcripts / A. Matejuk, M. Afentoulis // Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 2006. Vol. 54(3). P. 183-191. Motivala, S.J. Leptin and cellular and innate immunity in abstinent alcoholics and controls / S.J. Motivala, J. Dang, T. Obradovic [et al.] // Alcohol. Clin. Exp. Res. 2003. Vol. 27, № 11. P. 1819-1824. Sulke, A.N. Hormonal modulation of human natural killer cell activity in vitro / A.N. Sulke, D.B. Jones, P.J. Wood // J. Reprod. Immunol. 1985. Vol. 7(2). P. 105-110.
Поступила в редакцию 21.04.2008
The regulation of phenotipic maturing of NK and NKT cells by reproductive hormones
I.V. Shirshev, I.V. Nekrasova, E.G. Orlova
It is established that estriol and progesterone (Pr) are the main inhibitors of CD3-CD16+ cells quantity in the first trimester of pregnancy. Pr determines the increasing of the NK cells level in the third trimester of pregnancy and its stimulating effect is negatively controlled by leptin. The NKT cell procent is regulated by reproductive hormones similarly: the level of the cells is decreased in the first trimester by chorionic gonadotropin and is increased till the end of pregnancy by estradiol.
