CC BY
41Фізика живого, Т. 1S, No2, 2007. С.б1-б5. © Строцька Є. А., Остапченко Л. І.
УДК 613,648,4+612.112:577.152.3
РЕГУЛЯЦІЯ АКТИВНОСТІ Н+,К+-АТФази ФОСФОРИЛЮВАННЯМ МЕМБРАННИХ БІЛКІВ ПАРІЄТАЛЬНИХ КЛІТИН ЩУРІВ ЗА УМОВ РОЗВИТКУ ВИРАЗКОВОЇ
ХВОРОБИ ШЛУНКА
Строцька Є. А., Остапченко Л. І.
Київський національний університет імені Тараса Шевченка Надійшла до редакції 05.10.2007
Досліджено вплив циклонуклеотид- та кальційзалежного фосфорилювання мембранних білків парієтальних клітин на активність Н+,К+-АТФази. В результаті роботи показано, що при виразковій хворобі шлунка відбуваються порушення в регуляції функціонування Н+,К+-АТФази системою протеїнкіназ. Підвищення активності ферменту, при ініціації сGМР- та Са2+/фосфоліпід-залежних протеїнкіназ вказує на залучення даних кіназ до механізмів розвитку стресової виразки та циклонуклеотидзалежних протеїнкіназ - до етанол-індукованих ушкоджень.
Ключові слова: Н+,К+-АТФаза, виразкова хвороба, парієтальна клітина, фосфорилювання мембранних білків.
ВСТУП
Сьогодні, виразкова хвороба шлунка є найбільш розповсюдженою патологією органів травлення серед населення України, яка є однією з ведучих причин тимчасової втрати працездатності та інвалідності. По кількості смертності серед захворювань частка ВХ складає 15%, перевищуючи серцево-судинні та легеневі патології [1]. Етіологічно значими факторами патогенезу виразкоутворення є нервово-психічні впливи, у вигляді психоемоційного стресу та дія етанолу, які викликають гіперхлоргідрію з утворенням виразкового дефекту слизової оболонки шлунка. Цей процес обумовлений активацією мембранозв’язаного ферменту апікальної частини парієтальних клітин слизової оболонки шлунка -Н+,К+-АТФази. Н+,К+-АТФаза (або протонна помпа) приймає участь у процесі синтезу соляної кислоти, шляхом транслокації протонів (Н+) з цитоплазми парієтальних клітин у міжклітинний простір в обмін на (К+). Відомо, що за умов розвитку даної патології рівень активності ферменту значно зростає [2], однак молекулярні механізми, які призводять до зміни функціональної активності Н+,К+-АТФази, ще не вивчені до кінця. Тому, дослідження процесів внутрішньоклітинної регуляції ферменту може бути спрямовано на пошук причин, які призводять до порушення роботи Н+,К+-АТФази.
Фосфорилюванння білків широко використовуються клітинами як один з шляхів ковалентної модифікації молекул ферменту. Це базисний процес, який впливає на різноманітні клітинні реакції, в тому числі біосинтез білка, ліпідний та енергетичний
обмін, формування цитоскелету, проліферацію та диференціювання клітин [3]. Хімічна модифікація білків є фінальною внутрішньоклітинною реакцією каскадних процесів, що трансформує ефект регуляторів кислотної секреції (гістаміну, гастрину та ацетилхоліну) в конкретну клітинну відповідь у вигляді активації Н+,К+-АТФази. Таким чином, зміни у будь-який системі білкового фосфорилювання, або одному з ланцюгів каскадних реакцій може викликати порушення роботи Н+,К+-АТФази.
Метою даної роботи було оцінити вплив циклонуклеотид- та кальцій-залежного фосфорилювання мембранних білків парієтальних клітин щурів, за умов активації мембранозв’язаних протеїнкіназ, на активність Н+,К+-АТФази при різних експеримент-тальних моделях виразки шлунка.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Дослідження проводили на самцях білих щурів лінії Вістар масою 180-220г. Враховуючи залежність механізмів патогенезу захворювання від етіологічного фактору, нами було обрано різні моделі виразки шлунка, викликаних стресом та етанолом. Стресова модель виразки була створена згідно методики “соціального стресу” в модифікації С.Д. Гройсмана та Т.Г. Каревіної, який має назву “іммобілізаційного стресу” [4]. Етанол-індуковані виразкові ураження слизової оболонки шлунка викликали за модифікацією методу Okabe [5]. Щурам одноразово per os вводили 1 мл етанолу в концентрації 80%.
Строцька Є. А., Остапченко Л. І.
Парієтальні клітини виділяли внаслідок диференційного центрифугування загальної фракції клітин слизової оболонки шлунка за методом [6].
Фракцію плазматичних мембран парієтальних клітин отримували центрифугуванням на градієнті сахарози (30%) [7].
Активацію циклонуклеотидзалежних протеїн-кіназ плазматичних мембран парієтальних клітин проводили за рекомендаціями, які наведені у роботі [3]. Середовище інкубації, загального об’єму 100 мкл містило: 10-6 Моль/л сАМР та сОмР, 25 мМоль/л Тш-НСІ (рН 7.4), 10 мМоль/л MgCl2, 0.3 мг/мл мембранного білка та 0.5 мМоль/л АТР.
Кальційзалежні протеїнкінази плазматичних мембран парієтальних клітин ініціювали за рекомендацією методик [3, 10]. Інкубаційне
середовище об’ ємом 100 мкл для визначення активності Са2+/фосфоліпідзалежних протеїнкіназ, містило: 25 мМоль/л Тш-НСІ (рН 7.4), 10 мМоль/л MgCl2, 1 мМоль/л ЕГТА, 2 мМоль/л ЕДТА, 0,5 мМоль/л СаСІ2, 0,1 мг/мл фосфатидилсерина, 0,3 мг/мл мембранного білка та 0,5 мМоль/л АТР. Визначення активності Са2/кальмодулінзалежних кіназ проводили в 50 мкл стандартного середовища такого складу: 40 мМоль/л Нере8/КаОН (рН 8.0), 5 мМоль/л Mg(CH3COO)2, 10 мкМоль/л
кальмодуліна, 0,3 мг/мл мембранного білка та 0,5 мМоль/л АТР.
Інкубацію проводили для Са2+/фосфоліпід- і Са2/кальмодулін-залежних кіназ при 30°С протягом 2 хв., для циклонуклеотидзалежних протеїнкіназ - при 37°С, 5 хв. Реакцію зупиняли охолодженням. Інкубаційне середовище використовували далі для визначення активності Н+, К+-АТФази.
Активність Н+,К+-АТФази визначали спектрофотометрично, по фосфору, за стандартною методикою [8]. Для пригнічення активності Ка+,К+-АТФази та мітохондріальної АТФази до середовища інкубації додавали 1 мМоль/л оубаїну та 5 мМоль/л азиду натрію. Н+,К+-АТФазна активність визначалась як різниця між загальною АТФазною активністю (Mg2+- і К+-залежної) та К-АТФазною активністю (Mg2+-залежної).
Експериментальні дані оброблялись статистично з використанням ^-критерію Стьюдента. Статистичний аналіз одержаних даних здійснювали в режимі програмного забезпечення Ехеї.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Одним з універсальних способів регуляції активності Н ,К -АТФази у клітині є процес білкового фосфорилювання. Фосфорилювання, що здійснюється протеїнкіназами являється кінцевою ланкою сигнальних процесів в парієтальній клітині, яке направлено на
активацію Н+,К+-АТФази. Вплив фосфор и-лювання на функціонування Н+,К+-АТФази, може бути пов’язаний з прямою активацією молекул ферменту, шляхом приєднання фосфатного залишку АТР-залежним способом до серпнів (Бег27 і Бег952) а-субодиниці або опосередковано, через дію на малі регуляторні білки, які є інтермедіатами активності Н+,К+-АТФази. Хімічна модифікація молекул ферменту забезпечується циклонуклеотид- та кальцій-залежними протеїнкіназами. Гіста-мінова стимуляція секреції кислоти призводить до зростання рівню у клітині сАМР з послідуючою активацією сАМР-залежних протеїнкіназ (ПК А), холінергічна та
гастринова стимуляція - до підвищення
концентрації внутрішньоклітин-ного кальцію
2+
та сОМР, що призводить до активації Са -залежних протеїнкіназ (ПК С) [9, 10]. Рівень активності Н+,К+-АТФази, за умов розвитку виразкової хвороби є суттєво підвищеним, молекулярні механізми активації даної
фосфогідролази остаточно нез’ясовані, тому дослідження впливу фосфорилювання мембранних білків парієтальних клітин на функціональну активність ферменту може відігравати значну роль у пошуку причин, які призводять до порушень в процесах кислотної секреції.
Результати досліджень активності Н+,К+-
АТФази в плазматичних мембранах парієтальних клітин шлунку щурів, внаслідок активації сАМР-, сОМР-, Са2+/фосфоліпід- та Са2+/кальмодулін-залежних протеїнкіназ в контролі та за умов розвитку виразки, викликаної стресом та етанолом, представлено на рис. 1 та 2.
Встановлено, що в умовах виразкоутворення, фосфорилювання мембранних білків циклонуклеотид- та кальцій-залежними протеїн кіназами підвищує рівень активності Н+,К+-АТФази, в порівнянні з контролем. Найбільш суттєвий ефект фосфорилювання ферменту був зафіксований для активації сОМР-залежних протеїнкіназ. Зростання активності Н+,К+-АТФази у 2 рази було виявлено при етанол-індукованій виразці та в 1,8 рази - при стресовій моделі виразкоутворення (рис.1.), що узгоджується з результатами, які було отримано в нашій лабораторії [11], по визначенню вмісту у відповідних клітинах циклічного гуанозин-монофосфату (сОМР) - основного регулятору сОМР-залежної протеїнкінази (ПК О), який за умов розвитку досліджуваної патології зростав. Отримані результати вказують на залучення сОМР-залежного
регуляторного каскаду до розвитку виразкових процесів у парієтальній клітині, а саме участь сОМР-
залежного шляху активації Н+,К+-АТФази за умов розвитку виразки шлунка. Можна припустити, що Н+,К+-АТФаза або регуляторні білки, які є інтермедіатами активації ферменту фосфорилюються сОМР-залежною протеїнкіназою при досліджуваній патології.
110 100
< І 70
Є0
^ І 50
I 1 40
1 Х 30
< 20
10 0
Рис. 1. Активність Н+,К+-АТФази шлунку щурів в
контролі та при виразці, де: 1 - активність ферменту без фосфорилювання; 2-3 - активність Н+,К+-АТФази за умов активації циклонуклеотидзалежних протеїнкіназ парієтальних клітин: 2-сАМР-, 3-сОМР-залежне
фосфорилювання.
Молекулярні механізми впливу сАМР-залежного фосфорилювання на активність Н+,К+-АТФази можуть бути різними. Як відомо з даних літератури, а-субодиниця Н+,К+-АТФази, яка є каталітичною субодиницею ферменту здатна фосфорилюватися сАМР-залежними протеїні-назами [12]. Внаслідок включення фосфатного залишку до двох залишків серину: Бег27 N
термінального кінцю та Бег952, що знаходиться на С-кінці, молекула Н+,К+-АТФази - активується [9]. Крім того, сАМР-залежні кінази можуть підсилювати активність Н+,К+-АТФази, опосередковано, шляхом впливу на мінорні мембранні білки парієтальних клітин [13]. Доведено, що сАМР-залежні протеїнкінази здатні фосфорилювати К - та О - канали [14, 15], які розміщені поряд з Н+,К+-АТФазою, з апікального боку мембрани, тим самим збільшувати їх провідність до відповідних іонів, що безперечно призводить до активації Н+,К+-АТФази.
Нами було помічено підвищення активності Н+,К+-АТФази у 1,4 рази у відповідь на стресовий фактор та у 1,8 рази в умовах розвитку експериментальної етанол-індукованої виразки. Виходячи з того, що активність сАМР-залежної протеїнкінази при стресовій моделі виразки шлунка, суттєво не підвищується [16] та спостерігається зниження концентрації у клітині безпосереднього регулятора ПК А - сАМР [11], тому, можна припустити, що в умовах розвитку досліджуваної виразки зменшується модулюючий вплив з боку сАМР-залежної протеїнкінази на процеси секреції. Основну регуляторну дію за
1 2 з
□ контроль □ стресова виразка □ етанол-и-дукована виразка
таких умов бере на себе сОМР-залежний шлях активації Н+,К+-АТФази. Результати сАМР-залежного фосфорилювання мембранних білків парієтальних клітин, за умов розвитку виразки шлунка, викликаної етанолом відрізняються від стресової виразки, що пов’язано перш за все з різною інтенсивністю проявів механізмів виразкоутворення. Попередніми дослідженнями показано, що в умовах розвитку етанол-індукованої виразки ПК А значно активується [16], що може призводити до підвищення рівню фосфорилювання.
Вивчення ролі Са2+-залежних шляхів фофорилювання на активність Н+,К+-АТФази показало, Са2+/фосфоліпід-залежне фосфорилю-вання мембран парієтальних клітин впливало на активність Н+,К+-АТФази. Спостережений ефект був виражений в обох виразках, де активність ферменту зростала у 1,5 рази, в порівнянні з контролем (рис.2). Цей тип фосфорилювання залежить від функціонування Са2+/фосфоліпід-залежної протеїнкінази, активність якої за умов стрес- та етанол-індукованої виразки, підвищується [16]. Зростання концентрації внутрішньоклітинного Са2+, як одного з найважливіших модуляторів активності ПК С, при досліджуваних експериментальних моделей виразки [11, 17],
може привести до збільшення спорідненості Са2+/фосфоліпід-залежної протеїнкінази до іонів Са2+ та взаємодії з іншим регулятором -фосфатидилсерином.
110
100
90
□ контроль □ стресова виразка и етаноліеадукована виразка
Рис. 2. Активність Н+,К+-АТФази шлунку щурів в контролі та за умов розвитку виразки, індукованої стресом та етанолом, де: 1 - активність ферменту без фосфорилювання; 2-3 - активність Н+,К+-АТФази за умов активації кальційзалежних протеїнкіназ парієтальних клітин: 2- Са2+/кальмодулін-, 3 -
Са2+/фосфоліпід-залежне фосфорилювання.
Можна передбачити, що за умов розвитку
виразкових процесів Н+,К-АТФаза зазнає
фосфорилювання Са2/ фосфоліпід-залежними
протеїнкіназами, оскільки з літературних даних відомо, що сериновий залишок а-субодиниці
Строцька Є. А., Остапченко Л. І.
ферменту (Бег27) може бути також сайтом і до дії ПК С [18], призводячи до стимуляції ензиматичної активності Н+,К+-АТФази на 40-80% [10]. Вплив Са2+/фосфоліпід-залежного фосфорилювання на активність Н+,К+-АТФази має також опосередкований характер. Ця протеїнкіназа здатна фосфорилювати малі білки, які регулюють функціонування даної фосфогідролази [10].
Дослідження впливу Са2+/кальмодулінзалеж-ного фосфорилювання мембранних білків парієтальних клітин на активність Н+,К+-АТФази показало, що в умовах розвитку виразкової патології Са2+/кальмодулін-залежні протеїнкінази практично не впливають на функціонування ферменту.
Інтенсивність змін активності ферменту, які ми виявили при досліджуваних моделях виразки вказують про залежність внутрішньоклітинних молекулярних механізмів розвитку виразки шлунку від етіологічного фактору хвороби.
ВИСНОВКИ
Таким чином, отримані нами результати вказують на те, що при виразковій хворобі шлунка відбуваються суттєві порушення в регуляції функціонування Н+,К+-АТФази системою протеїнкіназ. Зміни показнику активності ферменту, які були отримані внаслідок фосфорилювання мембранних білків парієтальних клітин циклонуклеотид- та кальцій-залежними кіназами доводять про підсилення сОМР-залежного активаційного шляху Н+,К+-АТФази при виразковій хворобі шлунка. Підвищення активності
протонного наносу при ініціації сОМР- та Са2+/фосфоліпід-залежних протеїнкіназ дозволяє зробити припущення про залучення даних кіназ до механізмів розвитку стресової виразки та циклонуклеотидзалежних протеїнкіназ - до етанол-індукованих ушкоджень. Однак, ключова роль протеїнкіназ в активації Н+,К+-АТФази, за умов розвитку виразкової патології, потребує більш детальних досліджень.
Література
1. Белоусова Е. А, Черногорова М. В., Гуров А. Н. Гастроэнтеролог поликлинического звена: эффективность работы врача и качество жизни больных. // РЖГК - 2004 - Т. № 4 - С. 79 - 86.
2. Строцька Є. А., Остапченко Л. І., Неженець О. В. Вплив стресу, етанолу та аспірину на активність Н+,К+-АТФази парієтальних клітин слизової оболонки шлунка. // Гігієна населених місць. - 2005
- № 46 - С. 464 - 468.
3. Остапченко Л. І. Молекулярні механізми регуляції активності циклонуклеотид- та кальційзалежних
протеїнкіназ лімфоїдних клітин в умовах радіаційного впливу. - Київ. - 1999. - 108 стор.
4. Гройсман С. Д., Каревина Т. Г. О влиянии атропина на стрессовые поражения слизистой оболочки желудка у крыс. // Библ. указ. ВИНИТИ. Деп. рукописи. - 1979. - № 12. - С. 131.
5. Cao H., Wang M., Jia J. et all. Comparison of the effects of pantoprazol enantiomers on gastric mucosal lesion and gastric epithelial cells in rats. // J. of health science. - 2004. - Vol. 50. - № 1. - Р. 1 - 8.
6. Таиров М. М., Берсимбаев Р .И.. Аргутинская С. В., Салганик Р. И. Клеточная локализация аденилатциклаз, стимулируемых гистамином в слизистой оболочке желудка крыс и их роль в регуляции желудочной секреции. // Биохимия. -1983. -48. - № б. - С. 1035 - 1041.
7. Рыбальченко В. К., Коганов Н. М. Структура и функции мембран. Практикум. // Изд-во «Выща школа». - 1988. - С.79 - 83.
8. Asano S., Tega Y., Konishi K., Fujioka M., Takeguchi N. Functional expression of gastric H+,K+-ATPase and site-directed mutagenesis of the putative cation binding site and the catalytic center. // J.B.C. - 1996. -Vol. 271.
- № 5. - Р. 2740 - 2745.
9. Chew С. S. Parietal сєіі protein kinases. Selective activation of type I cAMP-dеpеndеnt protein kinase by histamine. // J.Biol.Сhеm. - 1985. - Vol. 260. -Р. 7540 - 7550.
10. Cornelius F., Mahmmoud Y. A. Direct Activation of Gastric H,K-ATPase by N-Terminal Protein Kinase C Phosphorylation. Comparison of the Acute Regulation Mechanisms of H,K-ATPase and Na,K-ATPase. // Biophysical Journal. - 2003. - Vol. 84. - № 13. -Р. 1690-1700.
11. Чайка В. О. Механізми трансдукції сигналу в
парієтальних клітинах слизової оболонки шлунка щурів при експериментальній виразці. Автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.04. // Київський
національний університет імені Тараса Шевченка. -К., 2005. - 20 с.
12. Murtazina D. A., Petukhov S. P., Storey K. B., et all. Phosphorylation of H,K-ATPase alpha-subunit in microsomes from rabbit gastric mucosa by cAMP-dependent protein kinase. // Bioscience Reports - 1999.
- Vol. 19 -№ 2 - Р. 109-14.
13. Goldering J. R., Asher V. A., Barreurher M. F. et all. Dephosphorylation of cAMP-dependent protein kinase regulatory subunit in stimulated parietal cells. // Am. J. Physiol. - 1992. - Vol. 262. - №4. - P. 763 - 73.
14. Malinowska D. H., Sherry A. M., Tewari K. P. and Cuppoletti J. Gastric parietal cell secretory membrane contains PK A- and asid-activated Kir 2.1 K+ channels. // АЛ. Physiol. Сєіі Physio1. - 2004 - Vol. 286. - № 3 -P. 495 - 506.
15. Ma1inowska D. Н., Kupert Е. Y., Bahinski А., Sherry А. М. and Cuppo1etti J. Cloning, functional expression, and characterization of a PКA-activated gastric-C1--channel. // Аm.J.Physio1. Сєіі Physiol. - 1995. -Vol. 268 - Р. 191 - 200.
16. Ковалева В. А. Вплив пероксидації ліпідів на стан слизової оболонки шлунка за умов розвитку виразки. Автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.04. //
Київський національний університет імені Тараса Шевченка. - К., 2005. - 20 с.
17. Pan Long-rui, Tang Q., Fu Q. Et all. Roles of nitric oxide in protective effect of berberine in ethanol-induced gastric ulcer mice. // Acta Pharmacologica Sinica. - 2005. - Vol. 11 - №26. - P. 1334-1338.
18. Kanagawa, M., S. Watanabe, S. Kaya, K. et all. Membrane enzyme systems responsible for the Ca2+-dependent phosphorylation of Ser27, the independent phosphorylation of Tyr10 and Tyr7, and the dephosphorylation of these phosphorylated residues in the a-chain of H/K-ATPase. // J. Biochem. - 2000. -Vol. 127 - P. 821-828.
РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ Н+,К+-АТФази ФОСФОРИЛИРОВАНИЕМ МЕБРАННЫХ БЕЛКОВ ПАРИЕТАЛЬНЫХ КЛЕТОК КРЫС В УСЛОВИЯХ РАЗВИТИЯ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ ЖЕЛУДКА
Строцька С. А., Остапченко Л. I.
Исследовано влияние циклонуклеотид - и кальций-зависимого фосфорилирования мембранных белков париетальных клеток на активность Н+,К+-АТФазы. В результате работы показано, что при язвенной болезни желудка происходят нарушения в регуляции функционирования Н+,К+-АТФазы системой протеинкиназ. Повышение активности фермента, при инициации сОМР- та Са2+/фосфолипид-зависимых протеинкиназ указывает об участии данных киназ в механизмах развития стрессовой язвы и циклонуклеотидзивисимых протеинкиназ - в этанол-индуцированных повреждениях.
Ключевые слова: Н+,К+-АТФаза, язва желудка, париетальная клетка, фосфорилирование мембранных белков.
REGULATION OF H+,K+-ATPase ACTIVITY BY PHOSPHORYLATION OF THE MEMBRANE PROTEINS OF RATS PARIETAL CELLS UNDER STOMACH ULCER DEVELOPMENT
Strotska E.A., Ostapchenko L.I.
In the present study was investigated the effect of parietal cells membrane proteins phosphorylation on H+,K+-ATPase activity under stomach ulcer development. It was shown that nucleotide- and calcium-dependent phosphorylation caused to changes gastric H+,K+-ATPase activity at the stomach ulcer. The significantly increasing enzyme activity was observed under cGMP-and Ca2+/phospholipid-dependent phosphorylation at the stress-induced stomach ulcer and nucleotide-dependent phosphorylation - at the ethanol-induced ulcer damages.
Key words: H+,K+-ATPase, stomach ulcer, parietal cells, proteins phosphorylation.
