CC BY
40
УДК 57.084:57.087.3:631.453
РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ALLIUM-ТЕСТА С ПОМОЩЬЮ КОМПЛЕКСА ВИЗУАЛИЗАЦИИ НА ОСНОВЕ МИКРОСКОПА МИКМЕД-6 ДЛЯ ОЦЕНКИ ГЕНОТОКСИЧНОСТИ ПОЧВ
В.В. Столбова, Д.В. Манахов, А.И. Щеглов
Показаны возможности использования видеосистемы на основе светооптического микроскопа Микмед-6 для объективной регистрации результатов Allium-теста при оценке генотоксичности почв. Оцифрованные микроизображения апикальной меристемы корней лука репчатого, Allium cepa L., сохраняют данные, необходимые для расчета ми-тотического и фазных индексов, а также фиксируют объективную картину патологий митоза и аберраций хромосом.
Ключевые слова: генотоксичность почв, комплекс визуализации, микроскоп Мик-мед-6, Allium-тест, патологии митоза.
Введение
Для оценки генотоксичности потенциальных загрязнителей окружающей среды природоохранными организациями рекомендованы тест-системы на основе растений [5, 9], в том числе так называемый Allium-тест [6]. В качестве фитотестера используются луковицы или семена лука репчатого, Allium cepa L. Регистрация результатов основана на ана-телофазном методе цитогенетического анализа [11] и доступна для обычной светополь-ной микроскопии. Различные патологии митоза фиксируют на окрашенных препаратах клеток апикальной меристемы корней или корешков проростков. В качестве тест-функций информативно использовать изменение митотического индекса (МИ) и частоты хромосомных аберраций (ХА). Также возможно учитывать изменение фазных индексов (отражающих соотношение клеток в разных фазах митоза) и частоты аномальных картин митоза (отставание или слипание хромосом), обусловленных нарушением митотического аппарата клетки.
Краткосрочность процедуры, доступность фитотестера, чувствительность к низким концентрациям генотоксикантов делают Allium-тест перспективным для решения ряда научных и практических задач [7]. В последнее время все более широкое применение варианты Allium-теста находят в области экологического мониторинга для оценки гено-токсичности различных компонентов окружающей среды [8, 10], в том числе почв [4].
Для получения сопоставимых результатов в ходе масштабных мониторинговых исследований постановка биотеста должна вестись по стандартизированной методике, а при регистрации результатов ана-телофазного анализа желательно свести до минимума элемент субъективизма. Значительные возможности для объективной регистрации результатов цитогенетических исследований пре-
доставляются с использованием техники цифровой микрофотосъемки.
Поставляемые на рынок системы отечественного и зарубежного производства, позволяющие осуществлять визуализацию исследуемых микрообъектов в цифровом формате, имеют широкий ценовой диапазон. Это дает возможность оптимального выбора оборудования, отвечающего сугубо прикладным задачам.
Цель данной работы — формализация процедуры учета результатов Allium-теста для оценки генотоксичности почв с использованием коммерческого комплекса визуализации на базе отечественного микроскопа Микмед-6.
Объекты и методы исследования
Объекты исследования — микроизображения, полученные с использованием коммерческого комплекса визуализации [12, 13] при проведении Al-lium-теста для оценки генотоксичности почв, поч-вогрунтов и веществ сравнения. Предлагаемый на отечественном рынке комплекс визуализации состоит из цифровой камеры с программным обеспечением и оптико-механического адаптера, с помощью которого камера закрепляется на светооп-тическом микроскопе в фотоканале насадки типа «тринокуляр» и изображение от микроскопа передается на камеру [13]. В работе использовали систему визуализации на основе микроскопа Микмед-6 с тринокулярной насадкой (ОАО «ЛОМО», Россия), оптико-механического адаптера (НПК «Зенит», Россия) [13], цифрового фотоаппарата Canon EOS 1100 D («Canon Inc.», Япония). Микроскоп Микмед-6 внесен в государственный реестр изделий медицинского назначения (регистрационное удостоверение ФСР 2010/08205, сертификат соответствия РОСС Яи.ИМ32.Н00126 по схеме обязательной сертификации медицинского изделия) [12].
Подготовку к микроскопированию проводили по стандартной методике приготовления препаратов из корневой меристемы [1]. Препараты окрашивали 2%-м ацетоорсеином (Sigma-Aldrich, США).
Экспериментальная часть
На рис. 1 показано соединение цифровой камеры через оптико-механический адаптер с фотовыходом тринокулярной насадки микроскопа и через USB-порт с компьютером.
Данный способ соединения микроскопа с фотоаппаратом технически обеспечивает соблюдение принципа микрофотографии, когда центры поля зрения окуляров микроскопа и поля зрения фотоаппарата совмещаются с помощью фототубуса определенной «оптической длины», в данном случае — адаптера соответствующего размера [2]. Согласно описаниям разработчиков оптико-механического адаптера, совмещение полей зрения доступно без дополнительной фокусировки. Однако необходимо отметить, что в данной работе изображение, наблюдаемое в окуляры микроскопа, отражалось на экране монитора только после незначительной перефокусировки с использованием микровинта микроскопа. Фотоаппарат соединяется с компьютером при помощи USB-кабеля (рис. 1). Использование режима «Live View» (в нашем случае — «отдаленная съемка») позволяет видеть изображение до момента съемки на экране монитора.
Рис. 1. Соединение микроскопа Микмед-6 и цифровой фотокамеры с помощью оптико-механического адаптера
Программное обеспечение, поставляемое в пакете с комплексом визуализации EOS Utility версии 2.10.00 («Canon Inc.»), дает возможность управлять съемкой непосредственно с компьютера и не прикасаться к фотоаппарату для исключения вибраций. Результаты доступны немедленно в виде цифрового снимка и изображения на экране монитора компьютера. Образцы микрофотографий представлены на рис. 2 совместно с изображением
Рис. 2. Микрофотографии окрашенных препаратов апикальной меристемы А. сера, полученные с использованием системы визуализации на основе микроскопа Микмед-6 в ходе тестирования почв на генотоксичность (увеличение 10 х 40, цена
деления микрошкалы — 10 мкм, синий светофильтр)
Рис. 3. Преобразование исходных изображений препаратов апикальной меристемы Л. cepa, дающее возможность формализовать процесс оценки величины фазных индексов (цена деления микрошкалы — 10 мкм)
микрошкалы, позволяющей сравнивать размер клеток в различных сериях тестов.
Для расчета показателей генотоксичности учитывают только клетки апикальной меристемы с
ненарушенными клеточными стенками. Преобразование полученных цифровых изображений (их увеличение, изменение контрастности и освещенности) значительно облегчает исследователю про-
Рис. 4. Преобразование исходных микроизображений окрашенных препаратов апикальной меристемы A. cepa, фиксирующее
картины патологий митоза (цена деления микрошкалы — 10 мкм)
цедуру учета. На рис. 3 показаны увеличенные изображения, информативные для оценки МИ и фазных индексов, а также преобразованное в соответствующем масштабе изображение микрошкалы.
Помимо использования в качестве тест-функций митотического и фазных индексов, мито- и генотоксичность потенциальных загрязнителей или природных сред может быть охарактеризована по изменению частоты определенных патологий митоза и ХА, доступных к анализу ана-телофазным методом цитогенетического исследования. На рис. 4 представлены увеличенные фрагменты (рис. 3) изображений, фиксирующие патологии митоза, часто обозначаемые как «отставание» (верхний ряд) и «слипание» (нижний ряд, слева) хромосом. Такое представление данных дает возможность однозначно классифицировать аберрации хромосом и проводить оценку их частоты.
Результаты и их обсуждение
Опробованная в данной работе система визуализации на базе отечественного микроскопа Микмед-6 позволяет получать цифровые микроизображения клеток апикальной меристемы лука репчатого, используемого в качестве фитотестера для измерения показателей мито- и генотоксично-сти почв и природных сред. Применение комплекса визуализации расширяет возможности ци-тогенетического анализа и делает процедуру учета результатов АШиш-теста более формальной.
Оцифрованные изображения дают возможность неограниченно долго хранить информацию, исходную для расчета показателей генотоксичности тестируемых природных сред. Стандартные давленые препараты доступны микроскопическому анализу очень непродолжительное время и их невозможно повторно использовать для характеристики уровня генотоксичности объектов в случаях неоднозначных оценок или спорных ситуаций.
Согласно работе [3], микрофотографии при ци-тогенетических исследованиях являются одновременно методом объективной регистрации и объектом исследования. Преобразование полученных микроизображений в блоке компьютера по стандартным программам облегчает процедуру получения данных для расчета МИ и фазных индексов, характеризующих особенности процесса деления клеток апикальной меристемы. Опробование каждой клетки апикальной меристемы на предмет отнесения ее к пулу делящихся или интактных клеток позволяет оценить величину МИ. Возможность отчетливо распознать фазу митоза, в которую клет-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Т. идр. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. М., 2004.
ка вступила на момент фиксации препарата, дает материал для расчета величин фазных индексов.
Особенности учета результатов АШиш-теста по данным цитогенетического анализа в обычном оптическом режиме вносят значительный элемент субъективизма в характеристику форм проявлений генотоксичности тестируемых образцов. Так, выделяемые спектры структурных перестроек хромосом и патологий митоза могут существенно различаться в силу определенных предпочтений исследователя придерживаться тех или иных существующих классификаций. Анализ цифровых микроизображений позволяет объективно охарактеризовать спектр аберраций хромосом и картины патологий митоза. Сохранение и представление картин патологий митоза в цифровой форме дает возможность однозначно определить и обозначить вид аберрации, при этом процесс идентификации нарушений и сравнение их спектров становится более объективным.
Качество полиграфической передачи полутоновых фотоизображений в научных изданиях до недавнего времени не совсем отчетливо позволяло читателям оценить информативность микросъемки. Однако электронные версии лишены этого недостатка, и это особенно наглядно для цифровых микроизображений, что является несомненным преимуществом их использования при публикации результатов цитогенетического анализа.
В качестве недостатка представленного способа учета результатов АШиш-теста на основе микрофотографий необходимо отметить невозможность на изображении учитывать клетки, лежащие в разных фокусных плоскостях. Хотя при обычном оптическом режиме эксперимента данные объекты легко учитываются после перефокусировки препарата.
Выводы
Использование системы визуализации на базе отечественного микроскопа Микмед-6 позволяет сделать более объективным способ регистрации эффектов мито- и генотоксичности при учете результатов АШиш-теста. Доступность оборудования, возможность получения цифровых микроизображений и удобство работы с ними вполне отвечают целям выполнения рутинных процедур цитогене-тического анализа в ходе экологического мониторинга. Применение техники цифровой микрофотосъемки формализует процедуру АШиш-теста и позволяет приблизиться к решению проблемы стандартизации метода для оценки состояния почв и природных сред по показателям генотоксичности.
2. Натяганова А.В., Трифонов В.Д. Фототубус для соединения цифровых камер со светооптическими микроскопами // Цитология. 2007. Т. 49, № 3.
3. Низовцев В.В. Пособие по микросъемке с основами оптики микроскопа. М., 1986.
4. Удалова А.А. Биологический контроль радиаци-онно-химического воздействия на окружающую среду и экологическое нормирование ионизирующих излучений: Автореф. дис. ... докт. биол. наук. Обнинск, 2011.
5. Constantin M.J., Owens E.T. Introduction and perspectives of plant genetic and cytogenetic assays. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program // Mutation Res. 1982. Vol. 99, Iss. 1.
6. Fiskesjo G. Allium test: In vitro toxicity testing protocols // Methods in Molecul. Biol. 1995. Vol. 43.
7. Fiskesjo G. The Allium test as a standard in environmental monitoring // Hereditas. 1985. Т. 102.
8. Fiskesjo G. The Allium test in a wastewater monitoring // Environ. Toxicol. Water Qual. 1993. Vol. 8, Iss. 3.
9. Grant W.F. The present status of higher plant bio-assays for detection of environmental mutagens // Mutation Res. 1994. Vol.310.
10. Leme D.M., Marin-Morales M.A. Allium cepa test in environmental monitoring: A review on its application // Ibid. 2009. Vol.682.
11. Rank J., Nielsen M.H. Evaluation of the Allium anaphase-telophase test in relation to genotoxicity screening of industrial wastewater // Ibid. 1994. Vol. 312.
12. URL: http://www.lomo-microsystems.ru/came-ras.html
13. URL: http://www.zenit-npk.ru
Поступила в редакцию 14.09.2015
ALLIUM-TEST RESULTS REGISTRATION FOR SOIL
GENOTOXICITY ASSESSMENT WITH IMAGING EQUIPMENT
BASED MICROSCOPE MIKMED-6
V.V. Stolbova, D.V. Manakhov, A.I. Shcheglov
Possibility of using special video system based light-optical microscope Mikmed-6 is shown for objective registration of Allium-test results at soil genotoxicity estimation. Digitized microimages of apical meristem of Allium cepa L. roots store data to calculate the mitotic and phase-indexes, as well as record an objective picture of pathology mitosis and chromosomal aberrations.
Key words: soil genotoxicity, imaging eguipment, microscope Mikmed-6, Allium-test, pathology mitosis.
Сведения об авторах
Столбова Валерия Владимировна, канд. биол. наук, ст. препод. каф. радиоэкологии и экотоксикологии ф-та почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова. Тел.: 8(495) 939-25-08; e-mail: [email protected]. Манахов Дмитрий Валентинович, канд. биол. наук, ст. препод. каф. радиоэкологии и экотоксикологии ф-та почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова. Е-mail: [email protected]; [email protected]. Щеглов Алексей Иванович, докт. биол. наук, профессор, зав. каф. радиоэкологии и экотоксикологии ф-та почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова. Е-mail: [email protected].
