CC BY
50
Том 151, кн. 1
Естественные науки
2009
УДК 581.1
РЕДОКС-РЕГУЛЯЦИЯ ТИРОЗИНОВОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ В ОТВЕТНЫХ РЕАКЦИЯХ РАСТЕНИЙ НА РАЗЛИЧНЫЕ СТРЕССЫ И СОЕДИНЕНИЯ
Н.В. Петрова, А.Р. Мухитов, Ф.Г. Каримова
Аннотация
При действии in vivo экзогенных соединений, вызывающих повышение содержания внутриклеточной перекиси водорода, и модификатора тиоловых групп белков показано изменение уровня тирозинового фосфорилирования полипептидов корней гороха. Приведена динамика изменения внутриклеточного содержания Н2О2 при действии на растения различных стрессоров, а также ингибитора каталазы аминотриазола и активатора НАДФН-оксидазы форболового эфира. Полученные результаты свидетельствуют о редокс-регуляции уровня тирозинового фосфорилирования белков растений.
Ключевые слова: тирозиновое фосфорилирование белков, редокс-регуляция, горох.
Введение
В ответ на различные стимулы или стрессы клетка отвечает повышением продукции активных форм кислорода (АФК), источниками которых могут быть мембраны и внутриклеточные компартменты. Из всех форм АФК наиболее стабильной является перекись водорода Н2О2, которая способна проникать через мембраны и окислять тиоловые группы цистеина белков в цитозоле клеток. Известно, что в цитоплазме поддерживаются восстанавливающие условия, в то время как в апопласте и внутриклеточных компартментах поддерживаются более окисляющие условия. Показано, что на поверхности клеток Arabidopsis (ИаНапа стимул вызывает «окислительный взрыв» через гетеротримерный О-белок [1]. Полагают, что продукция АФК внутриклеточными ферментными системами - необходимая компонента ответных реакций клеток всех уровней организации, принципы организации которых высококонсервативны и присутствуют как у позвоночных, так и в растениях, отличаясь в деталях у разных организмов для каждой системы [2]. Редокс-чувствительными клеточными белками являются белки с низким рКа, к которым относятся ферменты фосфорили-рования-дефосфорилирования белков - протеинкиназы (ПТК) и протеинфосфа-тазы (ПТФ), которые прямо взаимодействуют с Н2О2. На клетках позвоночных найдено, что окисление 8И-групп существенного остатка цистеина в каталитическом центре ПТФ подавляет активность ПТФ [3, 4]. Для растений редокс-регуляция активности дефосфорилирующего белки фермента ПТФ была показана на изолированной и очищенной из Arabidopsis ЛаНапа Л1РТР1 в работе Гупты и Луана [5].
Ранее нами было показано влияние экзогенной Н2О2 на фосфорилирование по тирозину белков корней гороха и обращение ее эффекта аскорбатом и восстанавливающим агентом ДТТ [6]. В настоящей работе представлены данные по влиянию экзогенных соединений, вызывающих повышение внутриклеточного содержания Н2О2, а также модифицирующих SH-группы белков, на уровень тирозинового фосфорилирования белков корней гороха и эндогенное содержание Н2О2.
1. Материалы и методы
Растения гороха (Pisum sativum L.) выращивали в условиях 10-часового фотопериода на 0.25 нормы питательной среды Хогланда - Арнона I при интенсивности освещения 10 кЛюкс в течение 7 дней. После отделения от побегов корни инкубировали в среде роста (контроль) или в среде с добавлением эффекторов. Следует заметить, что отделение побегов от корней вызывает стресс, сопровождающийся повышением внутриклеточного содержания АФК. Для характеристики стресса измеряли эндогенное содержание Н2О2 методом FOX1 [7]. Кончики корней гороха длиной 1 см гомогенизировали в ледяном ацетоне (-20 °С) (300 мг корней в 1 мл ацетона). Гомогенат центрифугировали в течение 5 мин при 12000 g. Супернатант использовали для анализа. Среда состояла из равных объемов супернатанта и реактива, содержащего 500 мкМ аммоний-сернокислого железа(11) (FeSO4(NH4)2SO46H2O), 50 мМ ксиленолового оранжевого, 200 мМ сорбитола, 50 мМ H2SO4, которую оставляли на 1 ч при комнатной температуре в плотно закрытой колбе в темноте. Измерение проводили при длине волны 560 нм, используя в качестве контроля смесь, состоящую из равных частей реактива и ацетона.
Детекцию фосфорилированных белков проводили при помощи иммуноб-лоттинга после разделения растворимых белков методом электрофореза и переноса белков на ПВДФ-мембраны. После инкубации с эффекторами кончики корней фиксировали в жидком азоте и гомогенизировали в среде (1 : 2), содержащей: 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5; 1 мМ ДТТ; 1 мМ фенилметилсульфонилфто-рид (ФМСФ); 1 мМ ЭГТА; 0.1 мМ ортованадат; 1 мМ теофиллин; 3% (m/V) по-ливинилпирролидон. Гомогенат центрифуговали в течение 10 мин при 5 °С и 14000 g. Приготовление образца для одномерного электрофореза проводили смешиванием буфера, содержащего 187.5 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 6% ДДС, 15% меркаптоэтанола, 30% глицерина, 0.004% бромфенолового синего с суперна-тантом, в соотношении 1 : 3.
Белки разделяли методом одномерного электрофореза [8] в 6-20%-ном ПААГ. Количество белка на трек составляло 25 мкг.
После проведения электрофореза белки переносили на ПВДФ мембраны в течение 60 мин при постоянной величине электрического тока 150 мА, используя прибор для полусухого блоттинга. Затем мембраны в течение ночи блокировали 1% (m/V) БСА, растворённым в ТБСТ (10 мМ Трис-HCl, рН 7.5; 100 мМ NaCl; 0.05% Твин-20) при 5 °С. Блоты инкубировали 1 ч при комнатной температуре с антителами к фосфотирозину PY20 (Amersham, Англия), конъюгиро-ванными с пероксидазой хрена, в разведении 1 : 1000 в солевом трис-буфере с Твин-20 (pH 7.5) (высокая специфичность использованных нами монокло-
нальных антител PY20, показанная в специальных исследованиях [9], подтверждена в наших экспериментах с белками растений [6]). Для визуализации тиро-зинового фосфорилирования белков блоты инкубировали 1 мин в ECL - реагенте (Amersham) и экспонировали на рентгеновской пленке.
Для визуализации белков мембраны окрашивали 0.1%-ным спиртовым раствором Кумасси R-250 10 мин, затем отмывали 50%-ным этанолом. Для вычисления удельного тирозинового фосфорилирования белков, разделённых электро-форетически, мембраны, окрашенные Кумасси R-250, и рентгеновские плёнки сканировали при помощи Epson Perfection 3170 Photo, и данные переводили в числовые значения оптической плотности при помощи программы Scion Image (Великобритания).
Удельное тирозиновое фосфорилирование выражали в относительных единицах (отн. ед.) как отношение оптической плотности фосфорилированного белка (хемилюминесценции) на плёнке к оптической плотности белка на мембране, окрашенной Кумасси R-250. Количество белка измеряли согласно методу Bradford [10] с БСА в качестве стандарта.
Эксперименты проводились в двух-трех повторностях. Приведены результаты типичного опыта 3-4 серий.
В работе использованы: Трис, глицин, ДТТ, поливинилпирролидон, ДДС, ТЕМЕД, бромфеноловый синий, персульфат аммония, акриламид, Кумасси R-250 и G-250, а также метилен-бис-акриламид фирмы «Bio-Rad» (США). Монокло-нальные антитела против фосфотирозина (клон PY20), ПВДФ мембраны, хеми-люминесцентный реагент (ECL-реагент), Твин-20 и БСА были получены от Amersham Pharmacia Biotech (Великобритания). ФМСФ, ЭДТА, фосфотирозин, теофиллин, аминотриазол, форболовый эфир и йодуксусная кислота были поставлены фирмой «Sigma» (США). Остальные реактивы - NaCl, перекись водорода, ортованадат натрия, глицерин, аммоний сернокислое железо, ксиленоло-вый оранжевый, сорбитол, серная кислота, рентгеновская пленка - отечественного производства. Для приготовления растворов использовали бидистиллиро-ванную воду, дополнительно очищенную на установке Fistreem Cyclon (Англия).
2. Результаты и обсуждение
Тирозиновое фосфорилирование белков играет важную роль в процессах передачи сигнала внутрь клетки и регуляции клеточного метаболизма в норме. Изучение влияния генерации АФК при стрессе на уровень тирозинового фос-форилирования белков актуально в свете конкурентных отношений различных посттрансляционных модификаций белков в регуляции их активности, в частности посттрансляционного окисления/восстановления. Окисление белков, участвующих в регуляции уровня тирозинового фосфорилирования белков, вызывали in vivo действием агентов, повышающих внутриклеточное содержание АФК (наиболее стабильный из них Н2О2).
На рис. 1 приведены данные по изменению уровня тирозинового фосфори-лирования спектра полипептидов (ПП) корней гороха при действии ингибитора каталазы аминотриазола.
Каталаза - один из основных ферментов антиоксидантной защиты растений. Подавление активности каталазы ее ингибитором должно вызвать повышение
(D
S
« о
ч
и р
о -е о о -е
(D О И Л
ч
(D £
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
17 19 21 22 24 26 30 34 36 40 53 57 82
молекулярная масса, кД
е и
«
о
л
и р
о -е с о -е е о н
Л
л е
£
20 1 18 -16 14 12
.д
u 10 Ч
н
S 8Н 6 4 2 0
17 19 21 22 24 26 30 34 36 40 53 57 82
молекулярная масса, кД
Рис. 1. Влияние аминотриазола (10 мМ) in vivo за 5 (а) и 10 (б) мин на тирозиновое фосфорилирование полипептидов корней 7-ми дневных растений гороха. □ - контроль, ■ - аминотриазол
внутриклеточного содержания Н2О2, осуществляющего окисление SH-групп активных центров ПТФ, тем самым ингибируя их активность. Подавление активности ПТФ влечет значительное повышение содержания фосфотирозино-вых белков в связи с тем, что активность ПТФ выше активности ПТК, по крайней мере, в 10 раз [11], что согласуется с полученными нами ранее данными [12] о повышении уровня тирозинового фосфорилирования белков Dunaliella maritima в 10-12 раз специфическим ингибитором ПТФ ортованадатом натрия. Действительно, ингибитор каталазы аминотриазол (рис. 1) вызывал повышение уровня тирозинового фосфорилирования большинства ПП в сравнении с контролем за наблюдаемые времена. За 5 мин действия аминотриазола повышение фосфорилирования наблюдалось у 6 полос ПП: 19, 22, 30, 34, 40 и 57 кД, практически не изменялся уровень тирозинового фосфорилирования у 4-х ПП: 21, 24, 26 и 82 кД и снижался у 3-х полос ПП: 17, 36 и 53 кД.
время, мин
Рис. 2. Динамика изменения внутриклеточного содержания Н2О2 в корнях гороха под действием аминотриазола (10 мМ) и форболового эфира (2 мкМ). 1 - контроль, 2 -форболовый эфир, 3 - аминотриазол
Увеличение времени действия аминотриазола до 10 мин вызывало повышение уровня тирозинового фосфорилирования в сравнении с контролем у восьми из 13-ти ПП: 17, 19, 21, 26, 30, 34, 53 и 82 кД. Снижение тирозинового фосфорилирования в сравнении с контролем за 10 мин наблюдалось только у ПП 22 и 40 кД.
Наиболее выраженное повышение уровня тирозинового фосфорилирования наблюдалось у 3-х ПП 19, 30 и 57 кД за 5 мин и у 5-ти ПП 19, 21, 26, 34, 53 кД за 10 мин действия ингибитора каталазы. Из литературы известно, что длительная обработка растений аминотриазолом приводит к развитию постоянного окислительного стресса [13], это согласуется с полученными нами данными (рис. 1) и подтверждено в наших экспериментах с прямым определением ката-лазной активности (подавление при действии аминотриазола, данные не опубликованы).
Связь изменений уровня тирозинового фосфорилирования белков с повышением внутриклеточного содержания Н2О2 под действием ингибитора каталазы подтверждают наши данные по определению эндогенного содержания Н2О2, вызванное аминотриазолом (рис. 2).
Аминотриазол (рис. 2) вызывал повышение внутриклеточного содержания перекиси водорода в клетках корней гороха уже в самом начале инкубации (за 2 мин). Наблюдаемые в наших экспериментах колебания содержания эндогенной перекиси водорода в контроле и при действии аминотриазола, по всей видимости, связаны с функционированием в клетках мощной антиоксидантной системы.
Повышение внутриклеточного содержания Н2О2, под действием in vivo форболового эфира - активатора НАДФН-оксидазы (рис. 2), основного фермента
14
,е
и
ан 12
ав
о
р 10
ил р о .д е 8
ф .н
с о ф т о 6
е
о н 4
льн
е
д 2
0
14
,е
и
12
ав
о
иро 10
л
и р о .д е 8
ф .н
с о ф т о 6
е
о н 4
ь
л
е 2
д
0
17 19 21 22 24 26 30 34 36 40 53 57 82
молекулярная масса, кД
17 19 21 22 24 26 30 34 36 40 53 57 82
молекулярная масса, кД
Рис. 3. Влияние форболового эфира (2 мкМ) in vivo за 5 (а) и 10 (б) мин на тирозиновое фосфорилирование полипептидов корней 7-ми дневных растений гороха. □ - контроль, ■ - ФМА
супероксидсинтазной сигнальной системы, катализирующего образование внутриклеточной перекиси водорода в физиологических концентрациях (мкМ), вызывало изменение уровня тирозинового фосфорилирования полипептидов (рис. 3) в динамике, отличное от действия ингибитора каталазы (рис. 1).
По нашим данным (рис. 3) за 5 мин из 13-ти выявленных в контроле фос-форилированных по тирозину полос 1111 форболовый эфир вызывал снижение уровня тирозинового фосфорилирования 7 полос ПП: 17, 19, 21, 22, 24, 36 и 82 кД; практически не изменялся уровень фосфорилирования 3-х полос: 34, 53 и 57 кД и только у 3-х полос наблюдалось повышение уровня тирозинового фосфорилирования: 26, 30 и 40 кД (в сравнении с контролем). Напомним, что длительное повышение уровня тирозинового фосфорилирования белков - негативное событие для организмов [11]. Увеличение времени действия форболового эфира до 10 минут вызывало заметное изменение уровня тирозинового фосфори-
лирования I II I 53 и 57 кД, для которых за 5 мин не наблюдалось изменения уровня тирозинового фосфорилирования, он был повышен в сравнении с контролем. За это время повышение фосфорилирования наблюдалось еще у 2-х полос (17 и 26 кД); у I II I 19, 21, 24, 30, 36, 40 кД форболовый эфир за 10 мин вызывал снижение их фосфорилирования.
Изменения уровня тирозинового фосфорилирования белков, вызываемые форболовым эфиром, связаны с функционированием НАДФН-оксидазной сигнальной системы клеток и реализуется через протеинкиназу С. Форболовый эфир широко используется как агонист ПКС. Показано, что при действии фор-болового эфира происходит фосфорилирование p47phox субъединицы фермента НАДФН-оксидазы [14] (на растениях была продемонстрирована кросс-реактивность антител к этой субъединице с белками той же массы). Именно эта субъединица играет ключевую роль в процессе генерации АФК ферментом в ответ на стимуляцию форболовым эфиром, что было показано с использованием р47рь°х(-)-мутантов [15]. При действии форболового эфира происходит прямое взаимодействие ПКС и компонентов НАДФН-оксидазы. Субъединица p47phox НАДФН-оксидазы имеет 2 SH3 домена и сериновые остатки, которые могут распознаваться ПКС. После стимуляции форболовым эфиром ПКС фос-форилирует p47phox по множеству сериновых остатков, что вызывает процесс сборки комплекса НАДФН-оксидазы (в неактивном состоянии НАДФН-оксидаза существует в виде отдельных субъединиц, часть которых расположена в цитозоле, а часть ассоциирована с плазматической мембраной).
ПКС помимо активации НАДФН-оксидазы может изменять содержание свободных ионов кальциия (Са2) в клетках. В связи с этим изменения уровня тирозинового фосфорилирования полипептидов, наблюдаемые нами при его действии, могут быть связаны с регуляцией тирозиновых киназ и фосфатаз компонентами сигнальной сети, чувствительными к изменению содержания Са2+ в клетке [16].
Для выявления вклада тирозиновых фосфатаз в изменение уровня тирози-нового фосфорилирования белков и непосредственного участия SH-групп цис-теиновых остатков в функционировании этих ферментов был применен неспецифический алкилирующий агент - йодуксусная кислота, которая модифицирует цистеиновые остатки белковых молекул [17]. Реакция алкилирования идет по следующей схеме:
R-SH + ICH2COOH = R-SCH2COOH + HI.
В случае тирозинфосфатаз эта модификация должна привести к ингибиро-ванию ПТФ и, соответственно, к повышению уровня тирозинового фосфори-лирования белков.
Действительно, приведенные данные (рис. 4) указывают, что при действии in vivo 50 мМ йодуксусной кислоты в течение 5 мин наблюдалось повышение уровня тирозинового фосфорилирования большинства полипептидов (в 1.2-3 раза). Лишь у двух полос ПП (17 и 82 кД) наблюдалось небольшое снижение уровня тирозинового фосфорилирования в сравнении с контролем. У ПП 36, 40 и 53 кД существенной разницы с контролем не наблюдалось.
(D
S
« о
25 п
20
И 15
а
U й
(D О И Л
ч
(D £
10 -
5
17 19 21 22 24 26 30 34 36 40 53 57 82
молекулярная масса, кД
Рис. 4. Влияние йодуксусной кислоты (50 мМ) in vivo за 5 мин на тирозиновое фосфо-рилирование полипептидов корней 7-ми дневных растений гороха. □ - контроль, ■ -йодуксусная кислота
0
Результаты экспериментов с йодуксусной кислотой (см. рис. 4) однозначно указывают на непосредственную роль тиоловых групп в регуляции активности ферментов дефосфорилирования фосфотирозиновых белков - ПТФ.
Данные, приведенные на рис. 1-4, указывают на незамедлительную реакцию растений на действие испытанных соединений, выражающуюся в быстром и иногда неоднозначном изменении внутриклеточного содержания перекиси водорода (рис. 2). Это влекло изменение уровня тирозинового фосфорилирова-ния белков (рис. 3, 4). Различные стрессовые воздействия на растения (отсечение корней от целого растения, дефицит кальция в среде роста, засоление и низкая температура) также изменяли внутриклеточное содержание перекиси водорода (рис. 5). Результаты, приведенные на рис. 5, свидетельствуют о различной динамике внутриклеточного содержания Н2О2 в зависимости от вида стресса, сходство проявлялось в колебательном характере изменений.
Согласно данным литературы [18], в оптимальных условиях роста продукция внутриклеточных АФК остается на низком уровне - 240 мкМ с-1 О2-, и постоянный уровень Н2О2 в хлоропластах - порядка 0.5 мкМ [18]. Равновесие между продукцией и улавливанием АФК антиоксидантами может быть нарушено рядом неблагоприятных внешних факторов, в результате чего быстро возрастают внутриклеточные уровни АФК (до 240-720 мкМ с- О2- и уровень перекиси водорода в хлоропластах до 5-15 мкМ) [18]. Условия наших экспериментов включали стресс: отделение корней от побегов и инкубирование с эффекторами.
Представленные на рис. 5 результаты говорят о высоком внутриклеточном содержании Н2О2 в корнях, в том числе и за «нулевое» время, то есть через 30 с после отрезания. По абсолютным значениям внутриклеточное содержание Н2О2 в наших экспериментах (рис. 5) сопоставимо с данными литературы [7, 19].
0,5
7 10 30 90 время, мин
10
20
30
60
120 180 время, мин
Рис. 5. Влияние различных видов стресса на содержание эндогенной перекиси водорода в клетках корней гороха: а - механический стресс (отрезание), б - механический стресс на фоне дефицита Са2+, в - засоление (150 мМ NaCl) на фоне механического стресса, г - действие низкой положительной температуры (4 °С) на фоне механического стресса
Из результатов наших экспериментов видно, что за 0.5-60 мин содержание эндогенной Н2О2 колебалось в пределах десятков микромолей/г сырого веса. Согласно данным литературы, в более ранние промежутки времени (до 1 мин) могло наблюдаться еще большее повышение содержания эндогенной Н2О2. Мощная антиоксидантная система клеток растений могла быстро понизить высокое содержание Н2О2, образование которого было вызвано в состоянии механического стресса. Колебания внутриклеточного содержания Н2О2 в динамике (рис. 5), очевидно, объясняются балансом генерации АФК и мощности антиок-сидантной системы клеток. О мощности систем регуляции редокс-статуса на-тивных клеток растений можно судить по данным работы [20], в которой добавление 20 мМ Н2О2 к суспензионной культуре клеток Arabidopsis thaliana вызывало его деградацию за 10-15 мин, тогда как при добавлении такого же количества Н2О2 к протопластам, изолированным из этой же культуры, Н2О2 обнаруживался в течение 3 ч.
Имеется ряд работ, в которых показана тесная взаимосвязь между продукцией АФК и изменением содержания Са в клетке [21]. В связи с этим нами были проведены эксперименты по определению содержания перекиси водорода в клетках в растениях, дефицитных по Са2+ (растения выращивались на среде, где Са2+ был заменен на Na+ согласно ионной силе [22]). Известно, что внешние стимулы вызывают быстрое и кратковременное повышение содержания
3
5
цитозольного Ca2+. Его концентрация после стимуляции может подняться до 100 мкМ от уровня покоя [23]. Кальциевые сигналы регулируют клеточные процессы посредством высокоаффинных, кальций-связывающих белков, таких, как кальмодулин, который в свою очередь регулирует активность белков мишеней в пути передачи сигнала. Именно за счет этих белков в ряде случаев и осуществляется взаимосвязь между внутриклеточной концентрацией [Ca ] и продукцией АФК. Предполагается, что это происходит через через кальмоду-лин-зависимую НАД-киназу, которая запасает НАДФН в ходе сборки и активации оксидазы окислительного стресса. Ca /СаМ может связываться с катала-зой растений, повышая ее активность. Таким способом Са2/СаМ может регулировать уровень Н2О2 в растениях [24]. В ряде исследований предполагается, что изменения во внутриклеточном редокс- и кальциевом гомеостазе являются объединенными последствиями в биотическом и абиотическом стрессе. Н2О2 может стимулировать повышение содержания цитозольного Са через активацию кальциевых каналов [21].
Изменения в содержании перекиси водорода, которые наблюдаются в наших экспериментах с Са -дефицитными растениями (рис. 5, б) указывают на тесную связь между продукцией Н2О2 и содержанием Са в клетках. Из литературы известно, что для продукции АФК при окислительном стрессе требуется поток Са , который активирует НАДФН-оксидазу, локализованную в цито-плазматической мембране, у которой имеются Са-связывающие участки. Заметим, что дефицит Ca2+ в растениях через 60 мин вызывает резкое падение содержания внутриклеточной Н2О2 (рис. 5, б).
Засоление при инкубации отсеченных корней в среде с 150 мМ NaCl (рис. 5, в) вызывало нарастающее повышение содержания перекиси водорода в течение 7 мин (содержание Н2О2 достигло 56 мкМ/г сырого веса), через 10 мин наблюдалось снижение содержания Н2О2. Повышенное образование АФК в электрон-транспортной цепи хлоропластов при засолении, так же как и при охлаждении, согласно данным литературы, вызывается нарушением фотосинтетической фиксации СО2. Показано, что при солевом стрессе в тканях гороха повышается содержание митохондриальной и хлоропластной супероксиддисмутазы и изо-ферментов аскорбатпероксидазы [25], в клетках хлопка - активность различных антиоксидантных ферментов [26], в растениях табака, выращенных на гидропонике, активируются гены каталазы [27], в листьях лимона наблюдалось АФК-индуцированное перекисное окисление липидов [28].
При охлаждении (растения выдерживались в охлажденной среде при постоянной температуре +4 °С) внутриклеточное содержание перекиси водорода колеблется в пределах 20-40 мкМ/г сырого веса (рис. 5, г), к тому же содержание перекиси водорода оставалось неизменным в течение 180 мин, в отличие от механического стресса и при дефиците Са2+ (рис. 5, а, б), где к 180-й минуте содержание Н2О2 резко снижалось. При низкой температуре во всех клетках ткани наблюдается изменение различных параметров - снижение текучести мембран, нарушение функционирования ферментов, в число которых могут входить и ферменты антиоксидантной системы, поскольку каждый фермент имеет температурный оптимум максимальной активности. Для большинства ферментов этот оптимум находится в диапазоне 20-30 °С. При адаптации растений к низким
температурам в клетках синтезируются белки холодового шока, которые выполняют роль антифризов. Синтез белков de novo процесс длительный, очевидно, и адаптация организма более длительная, чем при механическом стрессе.
Из литературы также известно, что при низкой температуре в растениях нарушается фотосинтетическая фиксация СО2, при этом в электрон - транспортной цепи хлоропластов образуются АФК, видимо с этим связано наблюдаемое нами содержание повышения Н2О2 через 30 мин, которое поддерживалось в течение 3 ч (рис. 5, г). Согласно литературным данным холодовое воздействие индуцировало кратковременное, но значительное повышение содержания эндогенной перекиси водорода в клетках озимой пшеницы [29] и развитие условий окислительного стресса в каллусной ткани А. thaliana [30]. Таким образом, данные рис. 5 согласуются с данными литературы о том, что окислительный стресс является универсальным ответом клеток растений на разные виды стресса.
Итак, полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют о ре-докс-регуляции тирозинового фосфорилирования белков растений.
Работа поддержана грантами Президиума российской академии наук по программе «Молекулярная и клеточная биология» (№ 10002-121).
Summary
N.V. Petrova, A.R. Mukhitov, F.G. Karimova. Redox-Regulation of Protein Tyrosine Phosphorylation in Adaptive Plant Cell Reaction to Different Stresses and Compounds.
In vivo application of exogenous compounds increasing intracellular hydrogen peroxide, along with a modifier of protein thiol groups caused changes in the level of polypeptide tyrosine phosphorylation in pea roots. A dynamics of changes in intracellular H2O2 contents under the action of different stress factors as well as catalase inhibitor aminotriazole and NADPH-oxidase activator phorbol ester is presented. The results obtained indicate a redox-regulation of tyrosine phosphorylation level of plant proteins.
Key words: protein tyrosine phosphorylation, redox-regulation, pea.
Литература
1. Joo J.H., Wang S., Chen J.G., Jones A.M., Fedoroff N.V. Different signaling and cell death roles of heterotrimeric G protein and В subunits in the arabidopsis oxidative stress response to ozone // Plant Cell. - 2005. - V. 17. - P. 957-970.
2. Fedoroff N. Redox regulatory mechanisms in cellular stress responses // Ann. Bot. -2006. - V. 98. - P. 289-300.
3. Stone R.M. Optimizing treatment of chronic myeloid leukemia: a rational approach // Oncologist. - 2004. - V. 9. - P. 259-270.
4. TonksN.K. PTP1B: From the sidelines to the front lines! // FEBS Lett. - 2003. - V. 546. -P. 140-148.
5. Gupta R., Luan S. Redox control of protein tyrosine phosphatases and mitogen-activated protein kinases in plants // Plant Physiol. - 2003. - V. 132. - P. 1149-1152.
6. Каримова Ф.Г., Петрова Н.В. Влияние Н2О2 на фосфорилирование по тирозину белков гороха // Физиология растений. - 2007. - Т. 54, № 3. - С. 365-372.
7. AmoryA.M., Ford L., Pammenter N.W., Cresswell C.F. The use of 3-amino-1,2,4-triazole to investigate the short-term effects of oxygen toxicity on carbon assimilation by Pisum sativum seedlings // Plant, Cell and Environment. - 1992. - V. 15. - P. 655-663.
8. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685.
9. Ruff-Jamison S., Campos-Gonzalez R., Glenney, J.R.Jr. Heavy and light chain variable region sequences and antibody properties of anti-phosphotyrosine antibodies reveal both common and distinct features // J. Biol. Chem. - 1991. - V. 266. - P. 6607-6613.
10. BradfordM.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. - 1976. - V. 72. - P. 248-254.
11. Hunter T. Protein kinases and phosphatases: the yin and yang of protein phosphorylation and signaling // Cell. - 1995. - V. 80. - P. 225-236.
12. Мухитов А.Р., Петрова Н.В., Власова О.В., Каримова Ф.Г. Метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в выявлении тирозинового фосфорилирова-ния белков растений // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. - 2008. -Т. 150, кн. 2. - С. 144-154.
13. Gechev T., Gadjev I., Van Breusegem F., Inze D., Dukiandjiev S., Toneva V., Minkov I. Hydrogen peroxide protects tobacco from oxidative stress by inducing a set of antioxi-dant enzymes // Cell. Mol. Life Sci. - 2002. - V. 59. - P. 708-714.
14. Reeves E.P., Dekker L.V., Forbes L.V., Wientjes F.B., Grogan A., Pappin D.J.C., Segal A.W. Direct interaction between p47phox and protein kinase C: evidence for targeting of protein kinase C by p47phox in neutrophils // Biochem J. - 1999. - V. 344. - P. 859866.
15. Curnutte J.T., Erickson R. W., Ding J., Badwey J.A. Reciprocal interactions between protein kinase C and components of the NADPH oxidase complex may regulate superoxide production by neutrophils stimulated with a phorbol ester // J. Biol. Chem. - 1994. -V. 269. - P. 10813-10819.
16. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е. Роль тирозинового фосфорилирования в регуляции активности ионных каналов клеточных мембран. - СПб.: Айю, 1998. - 245 с.
17. Michaelis L.,. Schubert Maxwell P The reaction of iodoacetic acid on mercaptans and amine // J. Biol. Chem. - 1934. - V. 106. - P. 331-341.
18. Polle A. Dissecting the superoxide dismutase-ascorbate peroxidase-glutathione pathway in chloroplasts by metabolic modeling. Computer simulations as a step towards flux analysis // Plant Physiol. - 2001. - V. 126. - P. 445-462.
19. Bellincampi D., Dipierro N., Salvi G., Cervone F., de Lorenzo G. Extracellular H2O2 induced by oligogalacturonides is not involved in the inhibition of the auxin-regulated rolB gene expression in tobacco leaf explants // Plant Physiol. - 2000. - V. 122. -P. 1379-1385.
20. Neill S., Desikan R., Clarke A., Hurst R.D., Hancock J.T. Hydrogen peroxide and nitric oxide as signalling molecules in plants // J. Exp. Bot. - 2002. - V. 53. - P. 1237-1247.
21. Pei Z.-M., Murata Y., Benning G., Thomine S., Klusener B., Allen G.I., Grill E., Schroe-der J.I. Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signalling in guard cells // Nature. - 2000. - V. 406. - P. 731-734.
22. Karimova F.G., Kortchouganova E.E., Tarchevsky I.A., Iagoucheva M.R. The oppositely directed Ca2+ and Na+ transmembrane transport in algal cells // Protoplasma. - 2000. -V. 213. - P. 93-98.
23. White P.J., BroadleyM.R. Calcium in plants // Ann. Botany. - 2003. - V. 92. - P. 487-511.
24. Yang T., Poovaiah B. W. Hydrogen peroxide homeostasis: Activation of plant catalase by calcium/calmodulin // PNAS. - 2002. - V. 99. - P. 4097-4102.
25. Hernandez J.A., Olmos E., Corpas F.J., Sevilla F., Rio L.A. Salt-induced oxidative stress in chloroplasts of pea plants // Plant Sci. - 1995. - V. 105. - P. 151-167.
26. Gosset D.R., Banks S.W., Millhollon E.P., Lucas M.C. Antioxidant response to NaCl stress in a control and NaCl-tolerant cotton cell line grown in the presence of paraquat, buthionine sulfoximine, and exogenous glutathione // Plant Physiol. - 1996. - V. 112. -P. 803-809.
27. Savoure A., Thorin D., Davey M., Hua X.-J., Mauro S., Van Montagu M. NaCl and CuSO4 treatments trigger distinct oxidative defense mechanisms in Nicotiana plum-baginifilia L. // Plant Cell Environ. - 1999. - V. 22. - P. 387-396.
28. Gueta-Dahan Y., Yaniv Z., Zilinskas B.A., Ben-Hayyim G. Salt and oxidative stress: similar and specific responses and their relation to salt tolerance in citrus // Planta. -1997. - V. 203. - P. 460-469.
29. Okuda T., Matsuda Y., Yamanaka A., Sagisaka S. Abrupt increase in the level of hydrogen peroxide in leaves of winter wheat is caused by cold treatment // Plant Physiol. -1991. - V. 97. - P. 1265-1267.
30. O'Kane D., Gill V., Boyd P., Burdon R. Chilling, oxidative stress and antioxidant responses in Arabidopsis thaliana callus // Planta. - 1996. - V. 198. - P. 371-377.
Поступила в редакцию 14.12.07
Петрова Наталья Валентиновна - младший научный сотрудник Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН.
E-mail: [email protected]
Мухитов Александр Ринатович - кандидат биологических наук, научный сотрудник Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН.
E-mail: [email protected]
Каримова Фатима Габдуллазяновна - доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией сигнальных систем Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН.
E-mail: [email protected]
