CC BY
67
ПЕРЕДОВАЯ СТАТЬЯ
the editorial
РЕАЛИИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКИХ ДИФФУЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПЕЧЕНИ
ЛазебникЛ. Б., Голованова Е. В., Слупская В. А., Трубицына И. Е., Гендриксон Л. Н., Князев О. В., Шапошникова Н. А.
ГУ Центральный научно-исследовательский институт гастроэнтерологии ДЗ г. Москвы
111123, Москва, ш. Энтузиастов, д. 86 E-mail: [email protected]
РЕЗЮМЕ
Хронические заболевания печени (ХЗП) ежегодно приводят к инвалидизации сотен тысяч больных во всем мире. Возникая, как правило, в молодом возрасте (20-40 лет), они всегда значительно ухудшают качество жизни больных, что делает их социально значимыми. Более того, традиционное лечение (ге-патопротекторы, противовирусные препараты, кортикостероиды, иммуносупрессоры) далеко не всегда приводит к достижению желаемого эффекта, в связи с чем постоянно ведется поиск альтернативных методов лечения. Клеточная терапия фетальными эмбриональными, мононуклеарными, мезенхималь-ными стромальными клетками - самый передовой фронт современной биотехнологии и медицины. Использование СК с лечебной целью при хронических заболеваниях печени- это возможность регуляции нарушенных межклеточных взаимодействий в печени, влияние на механизмы клеточной гибели (некроз - апоптоз) и фиброгенеза, что делает этот метод наиболее актуальным и перспективным в гепатологии. В статье представлен анализ результатов исследований, проведенных в сфере клеточных технологий ведущими отечественными и зарубежными учеными при лечении заболеваний печени. Освещены вопросы трансдифференцировки, механизмов действия стволовых клеток в гепатологии, а также возможные риски данной терапии (проонкогенное действие, усиление фиброза). Также представлен собственный опыт применения клеточных технологий в эксперименте на модели острого токсического гепатита на животных.
Ключевые слова: хронические заболевания печени, фиброз печени, стволовые клетки, мезенхималь-ные стромальные клетки, кариотипирование, онкогенная трансформация.
SUMMARY
Chronic liver disease (CLD) leads to disability annually hundreds of thousands of patients worldwide. Originating as a rule, at a young age (20-40 years), they are always significantly degrade the quality of life of patients, making them socially significant. Moreover, the conventional treatment (hepatoprotectors, antiviral drugs, corticosteroids, immunosuppressive medication) not always lead to achieving the desired effect, and therefore is constantly searching for alternative treatments. Cell therapy with embryonic fetal, mononuclear, mesenchymal stromal cells is the most advanced front of modern biotechnology and medicine. Using the SC with the purpose of treatment in chronic liver diseases is the possibility of disturbed regulation of cell-cell interactions in the liver, the impact on the mechanisms of cell death (necrosis - apoptosis) and fibrogenesis, which makes this method the most relevant and promising in hepatology.
The article presents an analysis of the results of studies conducted in the field of stem cell technologies by leading domestic and foreign scholars in the treatment of liver diseases.
Were studied questions of transdifferentiation, the mechanisms of stem cells in hepatology, as well as the possible risks of this therapy (pro-oncogene action, increased fibrosis). Also was presented our own experience of applying cellular technology in experimental models of acute toxic hepatitis in animals. Key words: chronic liver disease, liver fibrosis, stem cells, mesenchymal stromal cells, karyotyping, oncogenic transformation.
Перспективным направлением внедрения до-^ стижений клеточной биологии в клиническую
практику считается трансплантация стволовых ^ клеток (СК) с целью замещения (восстановления)
1 в организме поврежденных клеток и тканей. На се-
= годняшний день значительный прогресс клеточной
¡! трансплантологии достигнут в онкогематологии,
^ кардиологии [5], травматологии и ортопедии [4],
^ 5 фтизиатрии [1]. В последнее десятилетие проводится = § все больше экспериментальных и клинических ис-е ё следований, связанных с использованием стволовых £ ¡е клеток в гастроэнтерологии.
¡3 § Хронические заболевания печени (ХЗП) ежегод-
| но приводят к инвалидизации сотен тысяч больных * во всем мире. Возникая, как правило, в молодом возрасте (20-40 лет), они всегда значительно ухудшают качество жизни больных, что делает их соВ циально значимыми. Данные заболевания требуют ™ постоянной и дорогостоящей терапии, не лишенной
° побочных эффектов. Более того, традиционное
лечение (гепатопротекторы, противовирусные препараты, кортикостероиды, иммуносупрессоры) далеко не всегда приводит к достижению желаемого эффекта. Поэтому поиск альтернативных методов лечения ХЗП имеет огромное значение.
Клеточная терапия стволовыми клетками — самый передовой фронт современной биотехнологии и медицины. В последние годы появилось большое количество работ по изучению возможности стимуляции регенерации печени методом трансплантации СК различных популяций, как аутологичных, так и аллогенных (фетальных, гемопоэтических, мезенхимальных). Использование СК с лечебной целью при ХЗП — это возможность регуляции нарушенных межклеточных взаимодействий в печени, влияние на механизмы клеточной гибели (некроз — апоптоз) и фиброгенеза. Эти процессы определяют динамику восстановления структурно-функциональных взаимоотношений в пораженном органе. В многочисленных исследованиях продемонстрирована возможность достижения клинического эффекта трансплантации СК, а результаты эффективности клеточной терапии во многом зависят от типа стволовых клеток.
Известно, что повреждение гепатоцитов в результате воздействия различных факторов (вирусы, бактерии, алкоголь, лекарства и др.) сопровождается быстрым регенераторным ответом всех типов клеток печени, в результате чего за несколько недель происходит полноценное восстановление ее массы и функций. Новую паренхиму создают циркулирующие клетки-предшественники (вероятно, костномозгового происхождения), которые имеют хоуминг в печень в ответ на ее повреждение [32; 35; 8].
Механизм регенерации печени до конца не изучен, однако известно, что восстанавливать структуру поврежденной ткани могут несколько типов I клеток. Так, зрелые гепатоциты отвечают за вос-^ становление печеночной ткани после не очень обширных повреждений. Эти клетки многочисленны,
унипотентны и быстро активизируются после повреждения печени [16]. Исследование результатов трансплантации зрелых печеночных клеток крысам показало, что в эмбриональной и взрослой печени существует определенное количество гепатоцитов, которые могут увеличиваться в количестве клонами, доказывая этим, что сами гепатоциты (гепатобласты) являются собственными функциональными стволовыми клетками печени, при этом улучшение приживления и регенерации гепатоци-тов при их трансплантации может быть достигнуто использованием основного фактора роста фибро-бластов (ЬБОБ) [47].
Овальные клетки также можно считать стволовыми клетками печени — они активно размножаются при хроническом и / или обширном повреждении или в случае замедленной пролиферации гепатоцитов. Они менее многочисленны и бипотентны, то есть способны дифференцироваться в зрелые гепатоциты или холангиоциты (эпителиальные клетки желчных протоков) [16].
Маркером стволовых клеток печени может служить ^у-1 — эти клетки одновременно экспресси-руют белки и м-РНК, характерные для гепатоцитов и клеток желчных протоков, а это значит, что они могут дифференцироваться в оба типа клеток.
В исследованиях показано, что при моделировании повреждений печени на животных трансплантированные СК принимают участие в регенерации печеночной паренхимы. Так, экзогенные СК, происходящие из циркулирующих гемопоэтических клеток [10; 9] или из СК костного мозга [34; 22], реагируют на повреждение печени алкоголем. Они немногочисленны, мультипотентны и обладают способностью к продолжительной пролиферации. Например, при перипортальном некрозе, индуцированном аллиловым спиртом, начинается пролиферация клеток, у которых отсутствуют маркеры и гепатоцитов, и холангиоцитов [50], что можно объяснить трансдифференцировкой СК костного мозга (КМ). После резекции и / или ортотопической трансплантации печени отмечено значительное повышение в крови концентрации гемопоэтических СК и эндотелиальных предшественников, а также секретируемых ими факторов роста, что доказывает их участие в регенерации органа.
Имеются сообщения о том, что после трансплантации КМ от донора-мужчины в гепато-цитах реципиента-женщины обнаруживались У-хромосомы. Аналогичные результаты наблюдали и при трансплантации печени от женщин мужчинам. В этом случае до 40% гепатоцитов и холангиоцитов являлись потомками гемопоэтических СК реципиента, вселившихся в трансплантат, причем были найдены как диплоидные, так и полиплоидные гепатоциты с У-хромосомой [46; 8].
Механизмы, с помощью которых стволовые клетки могут вновь заселять и регенерировать печень, остаются дискуссионными. Так, согласно одной из точек зрения, превращение стволовых клеток
в клетки печени осуществляется путем их слияния с гепатоцитами [26; 47], а ряд других авторов утверждает, что это происходит с помощью транс-дифференцировки без слияния [22].
Для лечения ХЗП могут использоваться различные клеточные популяции. Это СК костного мозга или мобилизованной крови (гемопоэтиче-ские и мезенхимальные), мононуклеары костного мозга или выращенные in vitro гепатоциты. Пути введения клеток в клинической практике могут отличаться: в портальную вену, печеночную артерию или периферические вены, непосредственно в паренхиму печени.
Изучены условия трансдифференцировки взрослых клеток костного мозга в гепатоциты in vitro. При культивировании использовали специальную среду и факторы роста: гепатоцитов (HGF) и эпидермальный (EGF). После культивирования в течение двух недель появлялись гепатоцитопо-добные клетки, синтезирующие альбумин. Их количество напрямую зависело от концентрации HGF в культуральной среде [30]. В экспериментальных работах доказана возможность дифференцировки в функционирующие гепатоциты человеческих стволовых клеток пуповинной крови in vitro и после трансплантации [38; 23; 48]. Показана также возможность дифференцировки человеческих стромальных стволовых клеток жировой ткани в функционирующие гепатоциты in vitro и in vivo [40].
В эксперименте гемопоэтические СК после трансплантации заселяют поврежденную печень мышей и дифференцируются в альбумин-продуцирующие гепатоциты [38]. В ряде других экспериментальных работ показано, что инфузии СК костного мозга повышают уровень сывороточного альбумина, уменьшают степень фиброза печени и увеличивают коэффициент выживаемости мышей [45].
Впервые трансплантация аутологичных стволовых клеток CD133+ больным (n = 3) с опухолью правой доли печени была произведена в 2005 году [13]. После трансплантации СК этим пациентам потребовалось значительно меньше времени для восстановления здоровой доли печени после частичной гепатэктомии по сравнению с контрольной группой. В 2006 году группой английских ученых было проведено исследование на больных (n = 5) с хронической печеночной недостаточностью (ПН), которым трансплантировали CD34+ клетки мобилизованной крови в портальную вену или печеночную артерию. Было отмечено восстановление нормальных уровней билирубина и альбумина при отсутствии побочных эффектов. Опубликованы и отдаленные результаты клеточной терапии (трансплантация CD34+) у больных с ХЗП [21]. Сообщается, что по истечении 12-18 месяцев после трансплантации СК не обнаружено осложнений или побочных действий ни в одном случае. Вместе с тем у 4 пациентов нормализовался и оставался неизменным на протяжении 6 месяцев уровень сывороточного билирубина, у 3 из 4 больных через 12 месяцев
печени. Этими клетками была заселена импланти-^ руемая биоискусственная печень, которая взяла
S на себя часть функций разрушенной (в результате
^ токсического воздействия) печени животных. 90%
1 мышей с имплантированной «печенью» продолжали
= жить долгое время, тогда как все мыши контроль-
¡! ной группы в течение 2 дней погибли от острой
i печеночной недостаточности (ОПН).
^ j Ученые из Дюссельдорфа показали, что взрослые
i § СК костного мозга позволяют быстро восстано-s j вить здоровую ткань печени. У многих пациентов £ 2 с первичными и вторичными злокачественными ¡3 S поражениями печени невозможно выполнить ра-I дикальное хирургическое вмешательство, которое * потенциально может привести к выздоровлению пациента. Одной из основных проблем обширной хирургической резекции печени является риск В развития постоперационной ПН из-за уменьшения ™ объема функционирующей ткани печени в ранний
«о
° послеоперационный период — до начала регене-
рации паренхимы. Ученые провели сравнение эффективности стандартного метода, применяемого для ускорения регенерации печени, — эмболизации воротной вены (portal vein embolization (PVE)) — и сочетания PVE с инъекциями СК в ткань печени. В клинических испытаниях приняли участие 13 пациентов со злокачественными опухолями печени, которым хирургически удалить опухоли было невозможно, поскольку в этом случае остаточный объем органа составлял бы менее 25% от общего. СК, полученные из тазовой кости 6 пациентов, вводили в их печень и проводили PVE. Остальным 7 пациентам выполнялась только PVE. Для определения скорости роста печеночной ткани использовали метод компьютерной томографии. Через пять недель после лечения выяснилось, что использование СК сопровождалось удвоением скорости роста здоровой ткани, что позволило провести резекцию печени в среднем на 18 дней раньше, чем пациентам, которым выполнялась только PVE. Таким образом, введение аутологичных СК может использоваться для регенерации печени, поврежденной в результате различных болезней или хирургического вмешательства. В ближайшее время планируются рандомизированные контролируемые клинические испытания предложенного метода [20].
Установлено, что МСК подавляет иммунный ответ в различных моделях in vitro и на моделях заболеваний, вследствие этого они могут оказывать положительное действие у пациентов с аутоиммунными заболеваниями или отторжением трансплантата. Механизм иммуносупрессивного действия МСК в настоящее время до конца не выяснен и требует дальнейшего изучения. Однако имеется предположение, что действие МСК опосредуется через экспрессию местных факторов, таких как индол, амин-2,3-диоксигеназа, индуцибельная I синтаза оксида азота, а также через взаимодействие ^о с дендритными и / или антиген-представляющими клетками.
Имеется предположение, что паракринные функции МСК могут оказать существенный терапевтический эффект при ОПН, когда потеря большой массы клеток паренхимы сочетается с системной воспалительной реакцией. В экспериментах показано, что внутривенное введение лизатов ксено-генных МСК увеличивает выживаемость мышей с ОПН. Гистологические исследования печени таких животных показали, что в результате лечения снижается степень инфильтрации печеночной паренхимы лейкоцитами и восстанавливается структура желчевыводящих протоков [43; 7].
Интересные данные получены группой ученых из Китая. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) выделялись у мышей мужского пола C57BL/6 с токсическим поражением печени, индуцированным конканавалином А (КОН-А), культивировались и вводились в системный кровоток сразу после введения мышам КОН-А. Животным контрольной группы вводили только физиологический раствор. Результаты исследования показали, что через 24 часа после трансплантации МСК значительно уменьшалось острое повреждение печени, что проявлялось снижением уровня аланиновой (АЛТ) и аспара-гиновой (АСТ) трансаминаз в сыворотке крови. Отмечали также снижение выраженности некроза печени и апоптоза гепатоцитов in situ. Более того, после введения МСК статистически достоверно снижалась экспрессия фактора некроза опухоли-а (TNF-a) и интерферона-у (ИНФ-у) в печени. Экспрессия iNOS (индуцибельная синтаза оксида азота), интер-лейкинов (IL) — 2 и -10 существенно не изменялась (экспрессия медиаторов воспаления исследовалась методом ПЦР в реальном времени).
Имеется ряд работ, в которых для трансплантации, кроме СК костного мозга или мобилизованной крови, использовали МСК, выделенные из жировой ткани (МСК-ЖТ) или гепатоцитоподобные клетки, выращенные из МСК-ЖТ. По сравнению с эмбриональными СК или индуцированными поли-потентными СК использование МСК-ЖТ в качестве регенеративных клеток имеет ряд преимуществ с точки зрения этики и безопасности, поскольку МСК-ЖТ являются соматическими клетками и не требуют культивации in vitro. Эти аутологичные клетки являются иммунологически совместимыми и проявляют свойства контролируемой дифферен-цировки и мультипотентности. Кроме этого, они не подвержены посттрансплантационному отторжению и дифференцировке по нежелательному пути, например формированию тератомы [38]. Имеются сообщения об эффективности и безопасности мобилизации СК с помощью гранулоцитарного коло-ниестимулирующего фактора [27].
Исследователями из Китая [15] проведено изучение специфических функций гепатоцитов, инкапсулированных совместно с МСК костного мозга, in vitro. Крысам с острой ПН, индуцированной d-галактозамином, через 24 часа интраперитоне-ально вводились совместно инкапсулированные
(метод альгинат-поли-1-лизин-альгинатной микроинкапсуляции) гепатоциты и МСК (1-я группа), моноинкапсулированные гепатоциты (2-я группа) или плацебо (3-я группа). До и через 7 дней после трансплантации для оценки функций гепатоцитов использовалась иммунофлуоресцентная микроскопия. Было установлено, что функции гепатоцитов, включая секрецию альбумина и синтез мочевины, были значительно выше в группе совместно инкапсулированных клеток по сравнению с группой моноинкапсулированных гепатоцитов (p < 0,05). Интраперитонеальная трансплантация совместно инкапсулированных МСК и гепатоцитов не только увеличивала выживаемость, но и улучшала функции печени в модели острой ПН у крыс. Некоторые МСК трансдифференцировались в гепатоцитопо-добные клетки, которые экспрессировали альбумин, являющийся типичным маркером гепатоцитов.
Возможность использования мезенхимальных стволовых клеток для терапии декомпенсирован-ного ЦП показана Mohamadnejad [31]. В этой работе у четырех больных из 50 мл костного мозга выделялись МСК, которые после культивирования вводились в периферические вены в среднем в дозе 31,73 • 106 клеток. К концу контрольного периода у двух пациентов клиническая картина заболевания улучшилась на 3 и 4 балла соответственно, побочных эффектов не отмечено. Работа китайских исследователей также подтверждает дифференцировку МСК в гепатоциты [51].
В эксперименте показано, что МСК подавляют аллогенную антиген-индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов. Для модели ортотопической трансплантации печени использовали крыс линии SD и Wistar. Крысы распределялись в группы получавших МСК и контрольную. Было установлено, что в смешанной культуре лимфоцитов in vitro пролиферация Т-лимфоцитов крыс линии Wistar была статистически значимо снижена на 48,4%. У животных, получавших МСК, уровни АЛТ, АСТ, билирубина, IL-2, IL-10 были достоверно ниже по сравнению с контрольной группой. При пато-логоанатомическом исследовании печени животных выявлено, что отторжение трансплантата и апоптоз гепатоцитов в группе, получавших МСК, были менее выражены по сравнению с контрольной группой.
Имеется опыт применения СК при синдроме Криглера — Найяра (СКН) 1-го типа — аутосомно-рецессивном заболевании, связанном с мутацией гена UGT1A1, приводящей к полному отсутствию активности в печени фермента уридиндифосфат-глюкоронилтрансферазы (УДФГТ) и, как следствие, к накоплению неконъюгированного билирубина в крови (выше 200 мкмоль/л). Наиболее эффективным методом лечения СКН является ортотопиче-ская трансплантация печени. Однако ограничение количества донорских органов, их высокая стоимость делают его недоступным для большей части больных. Терапия СК появилась как альтернативное направление в лечении СКН 1-го типа и заняла
и циррозом печени. Внутрипеченочно или внутри-^ венно вводились аутологичные стволовые CD34+-
клетки. У 48,6% больных отмечался существенный ^ позитивный эффект в виде улучшения функцио-
1 нального состояния печени. Введение аутологичных
= клеток КМ не сопровождалось развитием побочных
¡! реакций.
^ Трансплантация эмбриональных клеток в России
^ 5 была осуществлена 32 больным с ЦП различной = § этиологии с хорошими результатами у половины £ ё из них, наблюдение продолжалось в течение 3 лет [2]. £ = Анализируя результаты как экспериментальных,
¡3 § такиклиническихисследований,необходимоотме-| тить ряд работ, в которых показано, что клетки КМ * играют существенную роль в патогенезе фиброзоо-бразования. Мнения ученых на этот счет неоднозначны. Например, имеются данные о том, что при заВ болеваниях легких клетки КМ мигрируют в очаг ™ повреждения, дифференцируются в миофибробла-
° сты и активно участвуют в образовании фиброзного
рубца [12]. Однако в другой работе при системном введении МСК мышам с формирующимся токсическим фиброзом легких наблюдали дифференцировку донорских клеток в легочный эпителий, уменьшение синтеза коллагена и интенсивности хронического воспаления [33]. Противоречивые данные получены и при изучении роли клеток костного мозга в развитии фиброза в печени. Так, в одной клинической работе [25] продемонстрировано прямое участие гемопоэ-тических клеток в патогенезе первичного билиарного цирроза. В Швеции группой исследователей проведена работа по изучению потенциала фиброгенности человеческих полипотентных МСК в поврежденной печени. Изучали потенциал стромальных клеток костного мозга взрослых и детей к дифференцировке в гепатоциты или миофибробласты. МСК трансплантировались в селезенку или печень мышей, которым проводилась частичная гепатэктомия. Экспрессия маркеров МСК и гепатоцитов измерялась методами ПЦР и иммуногистохимии. Показано, что после внутрипеченочного введения МСК длительно сохранялись в ткани печени, сохраняли мезенхимальную морфологию, но не экспрессировали маркеры гепа-тоцитов. Наряду с этим введение МСК сопровождалось накоплением коллагена в трансплантируемой печени. Таким образом, при трансплантации МСК в поврежденную или регенерирующую печень, вне зависимости от возраста донора, трансплантируемые клетки могут дифференцироваться в миофибробла-сты с формированием фиброзной ткани.
В противовес этому мнению группа бразильских ученых из университета Сан-Пауло продемонстрировала в своей работе, что иммуносупрессивные и ремоделирующие свойства МСК могут быть использованы для уменьшения фиброза [18]. Таким образом, эффективность лечения хронических заболеваний печени стволовыми клетками в отношении I уменьшения степени фиброза зависит от многих факторов, которые предстоит изучить и оценить в клинических исследованиях.
Общая биологическая способность МСК к онко-генетической трансформации остается дискутабель-ной. Механизмы образования раковых СК и участие нормальных стволовых и прогениторных клеток в канцерогенезе активно изучаются. Образование сарком семейства Ewing's (саркомы Юинга — СЮ) связывают с рядом хромосомных аномалий, основным сигналом к возникновению которых являются нарушения, вызванные образованием белка слияния EWS-FLI-1 — продукта мутантного гена FLI-1. Результаты эксперимента под руководством №со1о Riggi подтверждают теорию участия в канцерогенезе взрослых СК и впервые демонстрируют, что основным механизмом образования саркомы Юинга может быть ЮБ-индуцированная экспрессия в мезенхи-мальных (стромальных) клетках костного мозга [39].
Американские исследователи попытались ответить на вопрос: насколько безопасен феномен высокой пластичности (мультипотентности) МСК в контексте их клинического применения? С этой целью МСК выделяли из образцов костного мозга человека, полученных от нормальных доноров, используя высокую способность клеток к адгезии. На 3-м пассаже клетки имели типичную морфологию МСК, фенотип CD105+/CD73+/CD13+/CD90+/ CD34-/CD45-/CD133- и легко подвергались адипо-и остеогенной дифференцировке в индукционной среде. В монослойной культуре МСК одного из образцов с 3-го пассажа появлялись колонии клеток, отличающиеся морфологически и интенсивно делящиеся при дальнейшем субкультивировании. Фенотипически эти клетки характеризовали как С0133+/С034-/С038-/С0117-/С045-/С0105-/ CD13-/CD73+/CD90low/CD31-/ABCG-BCRP+/HLA-ОЯ+-тОБЯ1-тОБЯ2+/-. По сравнению с исходными эти CD133+-клетки легко клонировались, теряли способность к «контактному торможению», имели в 2 раза меньшее время удвоения и характеризовались высоким уровнем теломеразной активности. Эти клоны легко поддерживались в культуре около года без каких-либо признаков старения. Кариотипический анализ клонов (на 5-м, 7-м и 13-м пассажах) выявил множественные хромосомные аномалии, характерные для злокачественных клеток. СБ133+-клетки вызывали канцерогенез (преимущественно в легких, печени и канцероматоз брюшины) у облученных NOD/SCID мышей через 4-6 недель после интраперитонеальной и внутривенной трансплантации 2,5-10 миллионов клеток в 10 из 13 и в 3 из 12 случаев соответственно и у 100% животных — через 8 недель.
Таким образом, авторы подтвердили данные о том, что нормальные МСК человека способны к спонтанной онкогенетической трансформации в культуре: при увеличении числа пассажей в культуре МСК появляются клоны, характеризующиеся всеми признаками злокачественности. В данном исследовании такие клетки появлялись уже на 3-м пассаже и проявляли типичные признаки злокачественности с 5-7-го пассажей. Однако такие клоны
были выделены только из одного образца монону-клеарных клеток костного мозга и остается неясным, насколько они универсальны и присутствуют ли в остальных [38; 6; 41].
Что касается возможности спонтанной онкоге-нетической трансформация МСК in vitro, то этот феномен отмечается при длительном их культивировании (более двух месяцев) в 50% образцов [11]. Таким образом, длительное культивирование МСК нецелесообразно, так как оно ассоциировано с высоким риском канцерогенеза.
В заключение нашего обзора мы хотим поделиться собственным опытом. В ЦНИИ гастроэнтерологии были проведены экспериментальные исследования на 40 крысах-самцах для оценки изменений биохимических и морфологических проявлений хронической недостаточности паренхиматозных и непаренхиматозных клеток печени при введении МСК костного мозга. Токсический гепатит моделировали введением CCL4 Животным I группы однократно внутривенно вводили суспензию МСК в дозе 5 • 106 клеток в 1 мл физиологического раствора. Животным II группы МСК вводили дважды: на 3 сутки эксперимента в дозе 2,5 • 106 клеток и на 10-е сутки после последнего введения CCL 4 в той же дозе. Животным контрольной группы вводили 1 мл физиологического раствора. В течение 6 недель после введения МСК определяли уровни АЛТ и АСТ, щелочной фосфатазы (ЩФ), гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП), билирубина, IFN-y, TNF-a, IL-4 IL-10, а также проводили морфологические исследования ткани печени.
Сразу после завершения введения CCL4 уровни ферментов и билирубина были высокими и отражали степень повреждения гепатоцитов: АСТ > 225 ЕД/л, АЛТ > 200 ЕД/л, ЩФ > 3200 ЕД/л, билирубин свыше 16 мкмоль/л. В работе показано, что введение МСК приводило к снижению показателей цитолиза и билирубина уже на пятые сутки после их введения, способствуя ранней нормализации показателей. Этот эффект был получен как при однократном, так и при двукратном введении МСК (в последнем случае эффект был получен в более ранние сроки и выражен сильнее).
При изучении гистологической картины печени выявлено, что в контрольной группе на 28-е сутки увеличивается количество гепатоцитов с признаками жировой дистрофии и внутриядерными липидными включениями. Однократное введение МСК снижало дистрофические изменения в гепатоцитах, а двукратное приводило к более резкому, чем в контроле,
нарастанию дистрофических изменений в гепатоцитах. После второго введения снижалось количество гепатоцитов с признаками жировой дистрофии.
Зона соединительной ткани в печени на 14-е сутки после однократного и особенно двукратного применения МСК была больше, чем в контроле. В более поздние сроки зона соединительной ткани в контроле нарастает, а в опытных группах с однократным и особенно двукратным введением МСК уменьшается вследствие увеличения ее резорбции. При подсчете количества ложных долек в печени была получена аналогичная динамика.
На 14-е сутки после однократного и особенно двукратного введения МСК содержание в крови IFN-y достоверно нарастает, а IL-4 снижается (р < 0,05), указывая на активизацию в организме системной воспалительной реакции в этот период. В более поздние сроки (6 недель) уровни IFN-y и TNF-a снижаются, а содержание IL-4 и IL-10 возрастает. Это свидетельствует о снижении выраженности воспаления при одновременном усилении процессов репарации.
Таким образом, введение МСК при экспериментальном токсическом гепатите ускоряет темп нормализации некоторых функций печени, на ранних сроках усиливает образование соединительной ткани, а затем ускоряет ее резорбцию. Можно предположить, что МСК действуют в организме как адаптоген, мобилизующий репаративные резервы в поврежденной печени. Положительная динамика после введения МСК наблюдается в среднем через 5 недель наблюдения.
На основании вышеизложенного в полной мере можно оценить неоднозначность полученных результатов применения СК при ХЗП. Применение клеточных технологий представляется весьма перспективным в этой области медицины. Однако в биологии МСК еще очень много вопросов, ответы на которые будут найдены спустя годы кропотливых исследований. Учитывая способность МСК к онкогенной трансформации, следует помнить о недопустимости длительного их культивирования и необходимости проведения тщательного кариотипирования.
Основные задачи будущих исследований будут складываться из оценки эффективности определенных клеточных генераций, поиска оптимальных доз, кратности, способов введения, а также оценки долгосрочной безопасности.
с [□
о i5
II ш
^
и " к га о
a <
ш a ш с
ЛИТЕРАТУРА
1. Васильева И. А., Коноплянников А. Г., Ерохин В. В. и др. Лечебный эффект системной трансплантации культивируемых аутогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга у больных с резистентными формами туберкулеза легких // Клеточная транс-
плантол. — 2007. — № 1. — С. 77-80.
2. Манукян Г. В., Ерамишанцев А. К., Сухих Г. Т. и др. Трансплантация фетальных клеток в лечении больных циррозом печени
и портальной гипертензией // Гепатология. — 2004. — № 6. — С. 14-20.
3. Черных Е. П., Пальцев А. И., Старостина Н. М. и др. Аутоло-гичные клетки костного мозга в комплексном лечении пациентов хроническими гепатитами и циррозом печени // Гепатология. — 2005. — № 1. — С. 30-36.
4. Шахов В. П., Карлов А. В., Хлусов И. А. Мезенхимальные стволовые клетки и остеогенез // Гений ортопедии. — 2003. — № 2. — С. С. 116 -120.
5. Шумаков В. И., Казаков Э. Н., Онищенко Н. А. и др. Первый опыт клинического применения аутологичныхмезенхимальных стволовых клеток костного мозга для восстановления сократительной функции миокарда // Рос. кардиол. журн. — 2003. — № 5. — С. 42-50.
6. Adult stem cells and cancer // Cancer Res. — 2005. — Vol. 65. — P. 9601.
7. Aggarwal S., Pittenger M. Humanmesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses // Blood. — 2005. — Vol. 105. — P. 1815-1822.
8. Alison M. R., Poulsom R., Jeffery R. et al. Hepatocytes from non-hepatic adult stem cells // Nature. — 2000. — Vol. 406, № 6793. — P. 257.
9. Almeida-Porada G., Porada C. D., Chamberlain J. et al. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep // Blood. — 2004. — Vol. 104, № 8. — P. 2582-2590.
10. Camargo F. D., Finegold M., Goodell M. A. Hematopoietic
myelomonocytic cells are the major source of hepatocyte fusion partners // J. Clin. Invest. — 2004. — Vol. 113, № 9. — P. 1266-1270.
11. Rubio D., Garcia-Castro J., Martin M. C. et al. Spontaneous Human adult stem cell transformation // Cancer Res. — 2005. — Vol. 65. — P. 3035-3039.
12. Epperly M. W. et al. Bone marrow origin of myofibroblasts in
irradiation pulmonary fibrosis // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. — 2003. — Vol. 29, № 2. — P. 213-224.
13. Hashimoto et al. Bone marrow-derived progenitor cells in pulmonary fibrosis // J. Clin. Invest. — 2004. — Vol. 113. — P. 243-252.
14. Esch J. S., Knoefel W. T., Klein M. et al. Portal application of autologous CD133+ bone marrow cells to the liver: a novel concept to support hepatic regeneration // Stem Cells. — 2005. — Vol. 23, № 4. — P. 463-470.
15. Evans H. M., Kelly D. A., McKierman P. S., Hubscher S. Progressive histological damage in liver allografts following pediatric liver transplantation // Hepatology. — 2006. — Vol. 43. — P. 1109-1117.
16. Fang B., Shi M., Liao L. et al. Systemic infusion of FLK1 (+)
mesenchymal stem cells ameliorate carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice // Transplantation. — 2004. — Vol. 78, № 1. — P. 83-88.
17. Fausto N. Liver regeneration: from laboratory to clinic // Liver
Transpl. — 2001. — Vol. 7, № 10. — P. 835-844.
18. Fausto N., Campbell J. S. The role of hepatocytes and oval cells
in liver regeneration and repopulation // MechDev. — 2003. — Vol. 120. — P. 117-130.
19. Forbes S. et al. A significant proportion of myofibroblasts are of bone marrow origin in human liver fibrosis // Gastroenterol. — 2004. — Vol. 126. — P. 955-963.
20. Fox I. S., Chowdhury J. R., Kaufman S. S. et al. Treatment of the Crigler-Najjarsyndrom type I with hepatocyte transplantation // Engl. J. Med. — 1998. — Vol. 338. — P. 1422-1426.
21. Furst G. et al. Portal vein embolization and autologous cd133+ bone marrow stem cells for liver regeneration: Initial experience // Radiology. 2007. — Vol. 4. — P. 141-155.
22. Gordon M. Y., Levicar N., Pai M. et al. Characterization and clinical application of human CD34+ stem/progenitor cell populations mobilized into the blood by granulocyte colony-stimulating factor // Stem Cells. — 2006. — Vol. 24, № 7. — P. 1822-1830.
23. Jang Y. Y., Sharkis S. J. Metamorphosis from bone marrow derived primitive stem cells to functional liver cells // Cell Cycle. — 2004. — Vol.
3, № 8. — P. 980-982.
24. Kakinuma S., Tanaka Y., Chinzei R. et al. Human umbilical cord blood as a source of transplantable hepatic progenitor cells // Stem Cells. — 2003. — Vol. 21, № 2. — P. 217-227.
25. Kautman S. S., Wood R. P., Show P. W. jr., Markin R. S. Orthotopic liver transplantation for type I Crigler-Najjar syndrome // Hepatology. — 1986. — Vol. 6. — P. 1259-1262.
26. Kyriakou D. S. et al. Hemopoietic progenitor cells and bone marrow stromal cells in patients with autoimmune hepatitis type 1 and primary biliary cirrhosis // J. Hepatol. — 2003. — Vol. 39; 5. — P. 679-685.
27. Lagasse E., Connors H., al-Dhalimy M. et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo // Nat. Med. — 2000. — Vol. 6, № 11. — P. 1229-1234.
28. Levicar N., Pai M., Habib N. A. et al. Long-term clinical results of autologous infusion of mobilized adult bone marrow derived CD34+ cells in patients with chronic liver disease // Cell Prolif. — 2008. — Vol. 41, Suppl. 1. — P. 115-125.
29. Lyra A. C., Soares M. B., da Silva L. F. et al. Feasibility and safety of autologous bone marrow mononuclear cell transplantation in patients with advanced chronic liver disease // World J. Gastroenterol. — 2007. — Vol. 13, № 7. — P. 1067-1073.
30. Makouka L., Falk J. A., Falk R. E. Allogenicintrasplenic hepatocyte transplantation // Transplant. Proc. — 1987. — Vol. 19. — P. 1002-1003.
31. Miyazaki M., Akiyama I., Sakaguchi M. et al. Improved conditions to induce hepatocytes from rat bone marrow cells in culture // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2002. — Vol. 298, № 1. — P. 24-30.
32. Mohamadnejad M., Alimoghaddam K., Mohyeddin-Bonab M. et al. Phase 1 trial of autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in patients with decompensated liver cirrhosis // Arch. Iran Med. — 2007. — Vol. 10, № 4. — P. 459-466.
33. Neil D. Theise Adult Stem Cells in Hepatic Regeneration Beth Israel Medical Center. — Albert Einstein College of Medicine, USA, 2008. —
P. 85.
34. Ortiz L. A. et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is
enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects // PNAS. — 2003. — Vol. 100. — P. 8407.
35. Petersen B. E., Bowen W. C., Patrene K. D. et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells // Science. — 1999. — Vol. 284. — P. 1168 - 1170.
36. Quesenberry P. J., Colvin G. A., Lambert J. F. et al. The new stem cell biology // Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. — 2002. — Vol. 113. — P.
182 - 206.
37. Rubio D., Garcia-Castro J., Martin M. C. et al. Spontaneous human adult stem cell transformation // Cancer Res. — 2005. — Vol. 65. — P. 3035-3039.
38. Ruhnke M., Nussler A. K., Ungefroren H. et al. Human monocyte-derived neohepatocytes: a promising alternative to primary human hepatocytes for autologous cell therapy // Transplantation. — 2005. — Vol.
79, № 9. — P. 1097-1103.
39. Sakaida I., Terai S., Yamamoto N. et al. Transplantation of bone marrow cells reduces CCl4-induced liver fibrosis in mice // Hepatology. — 2004. — Vol. 40, № 6. — P. 1304-1311.
40. Scotlandi K., Benini S., Nanni P. et al. Blockage of insulinlike growth factor-I receptor inhibits the growth of Ewing's sarcoma in athymic mice // Cancer. Res. — 1998. — Vol. 58. — P. 4127-4131.
41. Seo M. J., Suh S. Y., Bae Y. C., Jung J. S. Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2005. — Vol. 328, № 1. — P. 258-264.
42. Serakinci N. et al. Adult human mesenchymal stem cell as a target for neoplastic transformation // Oncogene. — 2004. — Vol. 23, № 29. — P. 5095-5098.
43. Sokal E. M., Silva E. S., Hermans D. Orthotopic liver transplantation for Crigler-Najjar type I disease in six children // Traspant. — 1995. —
Vol. 60. — P. 1035-1058.
44. Strain A. J., Neuberger J. M. A bioartificial liver-state of the art // Science. — 2002. — Vol. 295. — P. 1005-1009.
45. Dazzi F., Ramasamy R, Glennie S. et al. The role of
mesenchymalstemcells in haemopoiesis // Blood Rev. — 2006. — Vol. 20. — P. 161-171.
46. Terai S. et al. Improved liver function in liver cirrhosis patients after autologous bone marrow cell infusion therapy // Stem. Cells. — 2006.
47. Terai S., Ishikawa T., Omori K. et al. Improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bone marrow cell infusion therapy // Stem. Cells. — 2006. — Vol. 24, № 10. — P. 2292-2298.
48. Theise N. D., Badve S., Saxena R. et al. Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation-induced myeloablation // Hepatology. — 2000. — Vol. 31, № 1. — P. 235-240.
49. Vassilopoulos G., Wang P. R., Russell D. W. Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion // Nature. — 2003. — Vol. 422, № 6934. — P.901 - 904.
50. Yan L., Han Y., Wang J. et al. Peripheral blood monocytes from patients with HBV related decompensated liver cirrhosis can differentiate into functional hepatocytes // Am. J. Hematol. — 2007. — Vol. 82, № 11. — P. 949 - 954.
51. Yannaki E. et al. Lasting amelioration in the clinical course of
decompensated alcoholic cirrhosis with boost infusions of mobilized peripheral blood stem cells // Exp. Hematol. — 2006. — Vol. 34, № 11. — P. 1583 -1587.
52. Yavorkovsky L., Lai E., Ilic Z., Sell S. Participation of small intraportal stem cells in the restitutive response of the liver to periportal necrosis induced by allyl alcohol // Hepatology. — 1995. — Vol. 21, № 6. — P. 1702 - 1712.
53. Zhan Y. T. et al. Differentiation of bone marrow stem cells in rat hepatic fibrogenesis environment // Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. — 2003. — Vol. 11, № 11. — P. 673-675.
