CC BY
169
Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3
Результаты и обсуждение
У всех больных после трансплантации ГСК крови развился ОМ.
У пациентов 1-й группы (см. табл. 1) преобладала 1—2-я степень тяжести ОМ, гораздо реже отмечались язвенные дефекты слизистой. Средняя длительность течения ОМ составила 10 дней. Ни у кого из них не зарегистрировано 3—4-й степени этого осложнения.
У 2 больных 2-й группы отмечена 2—3-я степень тяжести мукозита, у 1 больного — 3—4-я степень. Средняя длительность осложнения в этой группе составила 14 дней, ОМ часто сопровождался язвенными поражениями и более интенсивным болевым синдромом.
У больных множественной миеломой после трансплантации аутологичных ГСК, применявших кальция фосфат, длительность течения ОМ была в 2 раза меньше, чем у таких же больных контрольной группы. Существенных различий по длительности применения наркотических анальгетиков в этих двух группах не выявлено.
При исследовании частоты развития других инфекционных осложнений (в том числе пневмонии, некротической энтеропатии) в этих двух группах также не выявлено различий. Всем больным в этих двух группах в период агранулоцитоза проводили системную антибактериальную терапию, однако было отмечено, что в 1-й группе реже назначали антибактериальную терапию 2-й линии (у 1 из 5 больных). При этом в кон -трольной группе чаще проводили антибактериальную терапию 2-й линии (у 3 из 5 больных).
В посевах из зева у больных 1-й группы не выявлено роста патологической микрофлоры в отличие от больных 2-й группы, где у 3 из 5 больных выявляли патологические микроорганизмы (Stenotropho-monas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa).
Кроме того, при использовании кальция фосфата больные отмечали уменьшение выраженности болевого синдрома, отсутствие раздражения слизистых после
обработки полости рта. Препарат не вызывал тошноту и рвоту, не было неприятных вкусовых ощущений.
Выводы
— использование кальция фосфата влияет на степень и длительность поражения слизистой полости рта, особенно у больных множественной миеломой после трансплантации аутологичных ГСК;
— применение кальция фосфата позволяет реже назначать антибактериальную терапию второй линии, вероятно, за счет подавления патологической микрофлоры в ротовой полости;
— при применении кальция фосфата уменьшается болевой синдром, отсутствовали раздражение слизистых после обработки полости рта, неприятные вкусовые ощущения, тошнота и рвота.
ЛИТЕРАТУРА
1. Акопян О. Г. Влияние высокодозной химиотерапии на слизистую оболочку полости рта больных гемобластозами: Авто-реф. дис. ... канд. мед. наук. М.; 1997.
2. Flaitz C. Calcium phosphate solution and in vitro root surface caries. The preliminary program for IADR/AADR/CADR 87th General Session and Exhibition 2009, April 1—4, Houston, 2009. http://iadr.confex.com
3. Wasko-Grabowska А., Rzepecki Р., Oborska S. et al. Efficiency of supersaturated calcium phosphate mouth rinse treatment in patients receiving high-dose melphalan or BEAM prior to autologous blood stem cell transplantation: a single-center experience. Transplant. Proc. 2011; 43 (8): 3111—3113.
4. Papas A. S., Clark R. E., Martuscelli G. et al. A prospective, randomized trial for the prevention of mucositis in patients undergoing hematopoietic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant. 2003; 31: 705—712.
5. Skorobogatova E. et al. First experience of calcium phosphate mouth rinse usage for treatment of children with oral mucositis undergoing hematopoetic stem cell transplantation. Poster session at 37th Annual meeting of European group for blood and marrow transplantation. 2011, April 04, Paris. http://commamedica.org/ Poster_for_site.pdf
6. WHO. Handbook for reporting results of cancer treatment. Geneva, Switzerland: WHO; 1979.
Поступила 30.03.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.419-089.843-092:612.6.02.017.1
РЕАКЦИЯ СМЕШАННОЙ КУЛЬТУРЫ ЛИМФОЦИТОВ И ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ЕЕ ПРОЛИФЕРАТИВНОГО ОТВЕТА ПРИ ПОДБОРЕ HLA-ИДЕНТИЧНОГО донора-сибса для трансплантации КОСТНОГО МОЗГА (ИТОГИ 30-ЛЕТНЕЙ РАБОТЫ)
А. П. Шпакова, Т. И. Булычева, Л. Л. Головкина, Р. М. Кутьина, Т. Д. Пушкина,
Б. Б. Хасигова, Л. С. Любимова, Л. А. Кузьмина
ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития России, Москва
Резюме. Цель работы — определение информативности использования реакции MLC в комплексе с генотипированием при подборе HLA идентичного донора сибса больному для ТКМ и выяснение HLA генотипической значимости пролиферативного ответа в реакции MLC. Проведено определение совместимости в реакции MLC по включению 3Н-тимидина с 1981 по 2010 г. для трансплантации костного мозга (ТКМ) 443 пациентам с гематологическими заболеваниями — реципиентам с их 474 донорами-сибсами. Из 200 реципиентов, имеющих HLA-DRB1, DQB1 идентичных доноров, с помощью реакции MLC выявлено 2 случая ложной HLA идентичности. Установлена зависимость пролиферативного ответа в реакции MLC от генетической неидентичности пары донор — реципиент по HLA класса II. Целесообраз-
13
Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3
но включать реакцию MLC в комплекс определения HLA идентичности при подборе донора для ТКМ. Пролиферативный ответ в MLC дает возможность выявить HLA-неидентичность донора и реципиента по нетипированным генам и аллелям локусов HLA класса II.
Ключевые слова: трансплантация костного мозга, подбор HLA-идентичного донора-сибса, реакция смешанной культуры лимфоцитов—реакция MLC, HLA ПЦР-SSp генотипиро-вание, ложная HLA-идентичность, пролиферативный ответ в реакции MLC
MIXED LEUKOCYTE CULTURE REACTIVITY AND GENOTYPICAL SIGNIFICANCE OF ITS PROLIFERATIVE
RESPONSE IN SELECTION OF AN HLA-IDENTICAL SIBLING FOR BONE MARROW TRANSPLANTATION (SUMMING UP THE RESULTS OF 30-YEAR WORK)
A.PShpakova, T.I.Bulychyova, L.L.Golovkina, R.M.Kutyina, T.D.Pushkina, B.B.Khasigova, L.S.Lyubimova, L.A.Kuzmina
Hematology Research Center, Moscow
Summary. The informative value of mixed lymphocyte culture (MLC) test in complex with gene typing for selection of an HLA-identical sibling donor for bone marrow transplantation (BMT) was studied and the HLA genotypical significance of proliferative response in MLC test was evaluated. Compatibility of 443 recipients (hematological patients) with their 474 sibling donors before BMT was studied in 1981 —2010 by the MLC test, evaluated by 3H thymidine incorporation. Two cases of false HLA identity were detected by the MLC test in 200 recipients who had HLA-DRB1, DQB1 identical donors. The relationship between the proliferative response in MLC test and donor-recipient genetic non-identity by HLA class II was detected. It is useful to include the MLC test in the complex of HLA identity evaluation when selecting a donor for BMT. The proliferative response in MLC test detects the donor-recipient HLA non-identity by class II HLA nontyped genes and locus alleles.
Key words: bone marrow transplantation, selection of HLA identical sibling donor, mixed lymphocyte culture (MLC) test, HLA PCR-SSP genotyping, false HLA identity, proliferative response in MLC test
Успешное проведение трансплантации аллогенного костного мозга (ТКМ) или гемопоэтических стволовых клеток крови (ГСКК) в комплексной терапии больных гемобластозами в настоящее время является практически единственным методом лечения, позволяющим пациентам многие годы жить без последующей химиотерапии [1]. Одним из главных условий успешного проведения ТКМ является наличие HLA-совместимого донора, наилучшим из которых является HLA-генотипически идентичный сибс, имеющий с больным две одинаковые гомологичные хромосомы С6, на которых расположен весь главный комплекс гистосовместимости — система HLA [2].
Согласно требованиям действующих в настоящее время "Стандартов тестирования гистосовместимости" Европейской федерации иммуногенетиков (European Federation for Immunogenetics — eFI) 2011 г. [3], в процессе поиска HLA-идентичного донора-сибса обязательным является доказательство наследования одних и тех же родительских гапло-типов, что сделать не всегда удается из-за недоступности в некоторых случаях родителей или других братьев и сестер пациента. В этих ситуациях рекомендуется проводить поиск на основании генотипирования донора и реципиента по HLA класса I и класса II по высокому и/или низкому разрешению. Однако в результате такого тестирования в некоторых случаях может быть сделан вывод о якобы имеющейся HLA-идентичности донора-сибса с реципиентом, на самом деле являющимся неидентичным с ним, что обозначается как "ложная HLA-идентичность" [4]. Следствием этого может стать проведение ТКМ реципиенту от HLA-неидентичного (обычно гаплоидентичного) донора по протоколу, предназначенному для HLA-генотипически идентичного сибса, что грозит пациенту посттрансплантационными осложнениями: развитием реакции "трансплантат
Для корреспонденции:
Шпакова Анна Петровна — канд. мед. наук, старший научн. сотрудник, ведущий научный сотрудник научно-практической лаборатории клинической иммунологии ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития России.
Адрес: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4а.
Телефон: +7 (495)612-28-12 E-mail:[email protected]
против хозяина" (РТПХ) или неприживлением трансплантата, не только осложняющими течение заболевания, но и могущими привести к летальному исходу [5, 6].
HLA-генотипирование пары донор — реципиент для близкородственной ТКМ обычно проводят по варьирующему набору HLA-локусов, часть из которых типируют по низкому разрешению и часть — по высокому. Согласно указаниям EFI [3], при родственной ТКМ сначала проводят первый этап — типирование донора и реципиента по локусам HLA-A, HLA-B (в некоторых случаях типируют также и локус С) или DR. Если сибсы оказываются неидентичными, дальнейшее исследование гистосовместимости доноров с реципиентом прекращают. Если донор оказывается фенотипически или генотипически идентичным по HLA класса I с больным, проводят второй этап — генотипиро-вание по локусам HLA класса II. При этом доноры, идентичные с реципиентом по HLA класса I обеих гомологичных хромосом С6, предположительно рассматриваются как HLA-генотипически идентичные, т.е. идентичные по HLA класса I и класса II обеих гомологичных хромосом. Однако в некоторых случаях идентичность по HLA класса I сочетается с неидентичностью этого донора с реципиентом по всем или по отдельным HLA класса II, расположенным на одной или на обеих гомологичных хромосомах С6. Таким образом, идентичность по HLA класса I обеих хромосом возможна не только у HLA-генотипически идентичных сибсов, но может встречаться также и у некоторых гаплои-дентичных (и HLA-неидентичных) сибсов и формируется в результате двух причин:
• гомозиготности одного (или обоих) родителей по всем HLA класса I;
• кроссинговера у одного из родителей, произошедшего при созревании гаметы между гомологичными хрома-тидами хромосомы С6 на уровне между HLA класса I и II с последующим образованием двух рекомбинантных хромосом С6 (или сочетания кроссинговера у одного из родителей с гомозиготностью другого по всем HLA класса I).
В тех случаях, когда у гаплоидентичной пары донор — реципиент, имеются идентичные гены локусов всех HLA класса I на обеих гомологичных хромосомах С6, на их различающихся хромосомах имеются еще и одинаковые гены
14
Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3
некоторых локусов HLA класса II, становится возможным заключение о "ложной HLA-идентичности" на самом деле гаплоидентичного донора сибса. Основной причиной формирования таких генотипов является сочетание гомозигот-ности одного или обоих родителей сибса по генам всех локусов HLA класса I с гомозиготностью еще и по генам некоторых локусов HLA класса II на гомологичных хромосомах С6. Второй причиной является сочетание кроссинговера у одного из родителей сибсов, произошедшего между HLA класса I и II, с его гомозиготностью по генам некоторых локусов HLA класса II. При генотипировании сибсов частично по низкому и частично по высокому разрешению некоторые неидентичные гены и аллели локусов HLA класса II, расположенные на различающихся хромосомах у идентичных по HLA класса I гаплоидентичных сибсов, так и остаются негенотипированными, в том числе гены локуса HLA-DPB1. В результате этого различающиеся хромосомы гаплоидентичных сибсов ошибочно принимаются за идентичные, а донор неверно рассматривается как полностью HLA-генотипически идентичный с реципиентом.
Между тем "ложной HLA-идентичности" донора-сибса можно избежать, проводя параллельно с генотипирова-нием с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) определение пролиферативного ответа клеток донора и реципиента в реакции смешанной культуры лимфоцитов — mixed lymphocyte culture (MLC). Реакция MLC, по существу, представляет собой моделирование in vitro иммунологического взаимодействия лимфоцитов донора и реципиента и может рассматриваться как биологическая проба на HLA-гистосовместимость для пары донор—реципиент перед ТКМ. Главным, однако, является то, что по наличию пролиферативного ответа в реакции MLC можно распознать их различия по генам всех трансплантационнозначимых локусов HLA класса II: HLA-DRB1 [7], DQB1 [8], DPB1 [9—11]. Следует заметить, что до появления ПЦР-генотипирования реакция MLC была единственным методом для определения совместимости по HLA класса II. В настоящее время реакцию MLC используют наряду с генотипированием для оценки HLA-совместимости до-нора-сибса с реципиентом, что позволило E. Cecuk-Jelicic и соавт. [12] в 2005 г. на 19-й Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости рекомендовать включение реакции MLC в предлагаемый алгоритм подбора HLA-идентичных доноров-сибсов.
Цель настоящего исследования — определение информативности использования реакции MLC в комплексе с генотипированием при подборе HLA-идентичного донора-сибса больному для ТКМ, а также выяснение HLA-генотипической значимости пролиферативного ответа в реакции MLC.
Материалы и методы
Материалом исследования являлись лимфоциты периферической крови пациентов, доноров-сибсов и других членов их семей, а также неродственных доноров (в качестве контроля).
Типирование HLA класса I и II
Серологическое типирование антигенов HLA класса I (HLA-A, B, C) всех доноров и реципиентов проводили с помощью классического микролимфоцитотоксического теста с применением панели гистотипирующих сывороток ("Ги-санс", Россия; "РСПК, Минск", Республика Беларусь; "Pel Freez", США).
Генотипирование локусов HLA класса I (HLA-A, HLA-B, HLA-C) некоторых доноров и реципиентов при необходимости проводили дополнительно ПЦР методом секвенс-специ-фических праймеров (sequence specific primers — SSP) с при-
менением праймеров для низкого и высокого разрешения ("Biotest", Германия; "Dynal", США) по методикам производителей. Реакции амплификации были проведены в термальном циклере MyCycler ("BioRad", США).
Генотипирование локусов HLA класса II (HLA-DRB1 по низкому разрешению и HLA-DQB1 по высокому разрешению и при необходимости генотипирование дополнительно по HLA-DQA1 высокого разрешения) всех доноров-сибсов, реципиентов и неродственных доноров проводили совместно с ведущими научными сотрудниками лаборатории генетики гистосовместимости (д-ром мед. наук М. Н. Болдыревой) в ФГБУ Государственный научный центр Институт иммунологии ФМБА ПЦР методом мультипраймерной SSP (mixture of sequence specific primers — M-SSP) с использованием праймеров фирмы "ДНК-технология" (Россия) по методикам производителей [13]. Реакции амплификации были проведены в термальном циклере — МС-2 " ДНК-технология".
Генотипирование локусов HLA класса II (HLA-DRB1 и HLA-DPB1 по высокому разрешению и иногда HLA-DQB1) всех членов двух семей Я. и А., в которых по наличию пролиферативного ответа в MLC была выявлена "ложная HLA-идентичность" доноров с реципиентами, проводили методом ПЦР-SSP с применением праймеров фирм "Protrans", "Biotest", "BAG" (Германия) и "Dynal" (США) по методикам производителей. Реакции амплификации были проведены в термальном циклере MyCycler ("BioRad", США).
Детекцию продуктов реакций при генотипировании во всех случаях осуществляли с помощью электрофореза в агарозном геле и регистрировали результаты на трансиллюминаторе по длинам продуктов амплификации.
Реакция смешанной культуры лимфоцитов
Для определения совместимости в двунаправленной реакции MLC применяли стандартный микрометод c радиометрической оценкой результатов по включению 3Н-тимидина в ДНК пролиферирующих лимфоцитов в 6-суточной культуре в стерильных условиях [13—15].
Лимфоциты периферической крови выделяли на градиентном растворе Histopaque-1077 ("Sigma") и отмывали средой 199. Мононуклеары ресуспендировали в культуральной среде RPMI-1640 с добавлением инактивированной пуловой человеческой сыворотки от мужчин АВ (IV) группы — 10%, L-глутамина — 1% ("Gibco BRL"), буфера HEPES ("MP Biomedicals") — 1% и антибиотика гентомицина. Взвеси моно-нуклеаров от каждого участника реакции — реципиента, донора костного мозга и неродственного донора (в качестве контроля) — делили каждую на две части. Одну часть (стимулирующие клетки) облучали в дозе 2700 рад для ингибирования синтеза ДНК, другую (отвечающие клетки) оставляли интактной. В качестве дополнительного контроля использовали пул криоконсервированных лимфоцитов от нескольких неродственных доноров. Готовили смешанные культуры мононуклеаров (0,1 • 105 на лунку отвечающих и 0,1 • 105 на лунку стимулирующих клеток) и культивировали в 96-лу-ночных плоскодонных планшетах для клеточных культур во всевозможных комбинациях в 6 дублях при температуре 37оС, 5% СО2 и 100% влажности в течение 6 сут. За 18—24 ч до окончания культивирования добавляли Щ-тимидин по 1 мкКи (40 кБк) на лунку. Способность лимфоцитов реципиента, донора и неродственного донора к пролиферации определяли в 3-суточной реакции ФГА-стимуляции. Клетки собирали на стекловолокнистые фильтры Printed Fil-termat с помощью 96-трубочного клеточного харвестера Mach III ("Wallac", Финляндия). Пробы на фильтрах запаивали в твердом сцинтилляторе MeltiLex на устройстве Microsealer ("Perkin Elmer", США) при температуре 90оС. Для подсчета радиоактивности проб (в имп/мин) использовали Р-сцинтилляционный счетчик MicroBetа Plus ("Wallac", Финляндия). Результаты обрабатывали с помощью специальной компьютерной программы. (На первом этапе работы подсчет
15
Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3
Таблица 1
Пример "ложной HLA-идентичности" гаплоидентичных донора и реципиента в семье Я. вследствие гомозиготности по гену HLA-A класса I и по аллелям локусов DRB1, DQA1 и DQB1 HLA класса II гомологичных хромосом С6 отца
Отец:
Мать:
Реципиент:
Донор:
A*02:O1 Cw*12 B*18 DRB1*15:01 DQA1*01:02 DQB1*06:02 DPB1*04:01 a A*02:O6 Cw*03 B*40 DRB1*15:01 PQA1*QT^ DQB1*06:02 DPB1*09:01 b
A*02:01 Cw*02 B*27 DRB1*15:01 DQA1*01:02 DQB1*05:02 DPB1*14:01 c A*02 Cw*X B*05 DRB1*13 DQA1*01:03 DQB1*06:02 DPB1*X d (-) A*02:^ Cw*12 B*18 DRB1*15:01 DQA1*0r^ DQB1*06:02 DPB1*04:01 a A*02:01 Cw*02 B*27 DRB1*15:01 DQA1*01:02 DQB1*05:02 DPB1*14:01 c A*02:06 Cw*03 B*X(40) DRB1*1ШIDQA1*0r^ DQB1*06:02 DPB1*09:01 b A*02:01 Cw*02 B*27 DRB1*15:01 DQA1*01:02 DQB1*05:02 DPB1*14:01 c
радиоактивности проб осуществляли на жидкостном сцин-тилляционном р-счетчике макромодели DSA 1409 ("Wallac", Финляндия), который использовали в комплекте с 12-трубоч-ным клеточным харвестером (Великобритания).
Для вычисления относительного пролиферативного ответа — Relative Response (RR) отвечающих лимфоцитов реципиента (R) против (vs) стимулирующих лимфоцитов донора (D) использовали следующую формулу:
RR (%) R vs D = [(ответ R на стимуляцию лимфоцитами D в имп/мин минус ответ R на стимуляцию аутологичными лимфоцитами в имп/мин) разделенный на (ответ R на стимуляцию пулом лимфоцитов неродственных доноров в имп/мин минус ответ R на стимуляцию аутологичными лимфоцитами в имп/мин)] • 100.
Для вычисления RR (%) для отвечающих лимфоцитов донора костного мозга использовали соответствующую формулу в обратном направлении: D vs R.
Реакцию MLC считали отрицательной (отсутствие пролиферативного ответа), а пару донор—реципиент — совместимой в реакции MLC при величинах RR в обоих направлениях: R vs D и D vs R < 15% [15, 16].
Результаты и обсуждение
В Гематологическом научном центре с 1981 по 2010 г. для аллогенной близкородственной ТКМ был осуществлен подбор 474 потенциальных доноров-сибсов для 443 больных различными гематологическими заболеваниями: острый миелобластный лейкоз (ОМЛ) — 161, хронический миелолейкоз — 134, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) — 84, миелодиспластический синдром — 25, апластическая анемия — 21, лимфомы — 9, пароксизмальная ночная гемоглобинурия — 5 и множественная миелома — 4. Среди больных было 243 мужчины и 200 женщин в возрасте от 16 до 63 лет; возраст потенциальных доноров костного мозга находился в пределах 11—68 лет.
В течение первых 20 лет (с 1981 по 2000 г.) с целью проведения ТКМ от HLA-идентичных доноров-сибсов, согласно международной практике того времени, выявляли их идентичность с реципиентом по HLA-A, HLA-B, а в некоторых случаях и по HLA-C или HLA-DR серологическим методом и определяли совместимость сибсов по области HLA-D в реакции MLC. Всего за этот период совместимость в реакции MLC была определена между 250 донорами и 229 больными гематологическими заболеваниями. Для 220 больных потенциальными донорами являлись их сибсы, для 9 — оказавшиеся несовместимыми в реакции MLC родители.
Для 192 из 220 больных доноры были совместимы в реакции MLC, для 20 — доноры оказались несовместимыми, для 8 — результаты реакции MLC было трудно интерпретировать из-за низкого пролиферативного ответа в положительных контрольных тестах.
С 2001 г. в комплекс исследования наряду с реакцией MLC было включено ПЦР-генотипирование доноров-сибсов и реципиентов по HLA класса II (HLA-DRB1 по низкому разрешению и HLA-DQB1 по высокому разрешению). Обе реакции проводили параллельно с целью выявления степени их корреляции и определения степени генетической значимости пролиферативного ответа в реакции MLC. В период с 2001 по 2010 г. параллельное обследование проведено 224 доноров-сибсов и 214 больных гематологическими заболеваниями (для 2 больных потенциальными донорами были оказавшиеся неидентичными с ними по HLA класса I: для 1 больного — сестра и для другого — мать, которые были несовместимы с ними в MLC и неидентичны по HLA класса II).
Результаты исследования показали, что из 212 больных, идентичных с донорами по HLA класса I (HLA-A, HLA-B, HLA-C), 200 генотипически идентичны с донорами и по HLA класса II: по HLA-DRB1 низкого разрешения и по HLA-DQB1 высокого разрешения. Однако при параллельной постановке реакции MLC совместимыми с донорами оказались только 198 больных, а у 2 больных развился пролиферативный ответ лимфоцитов в обоих направлениях. В связи с этим было проведено расширенное и углубленное генотипирование членов этих двух семей: реципиентов, их родителей и всех остальных сибсов по высокому разрешению с исследованием возможно большего количества локусов HLA, в том числе локуса DPB1. Исследования показали, что в этих семьях на основании одного только генотипирования можно было ошибочно установить HLA-идентичность доноров сибсов (определить так называемую "ложную HLA-идентичность") [17—20]. Однако наличие пролиферативного ответа в реакциях MLC выявило HLA-неидентичность этих доноров.
В первой семье Я. причиной "ложной HLA идентичности" донора сибса оказалась гомозиготность отца по HLA класса I и класса II (табл. 1). Идентичность донора и реципиента была определена по обоим генам HLA-A2, по одному гену HLA-В27 (второй ген — HLA-В не выявлялся) HLA класса I и по обеим аллелям каждого локуса: DRB1, DQA1 и DQB1 HLA класса II обеих гомологичных хромосом при типировании по высокому разрешению. Это давало все основания рассматривать донора и реципиента в качестве HLA генотипически идентичных сибсов. Однако в реакции MLC наблюдался пролиферативный ответ, что заставило провести дополнительное генотипирование донора и реципиента по генам локуса HLA-DPB1, которое выявило у сибсов различия: DPB1*04:01 у реципиента и DPB1*09:01 — у донора, что и явились причиной развития пролиферативного ответа в MLC. Типирование локуса HLA-С выявило отличие сибсов и по одному гену HLA-С:
16
Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3
Таблица 2
Пример "ложной HLA-идентичности" гаплоидентичных доноров братьев 1, 2 и реципиента в семье А. при HLA-генотипировании
частично по высокому и частично по низкому разрешению
Реципиент: A*31:01 Cw*12:03 B*51p DRB1* 11:04 DQA1* 05:01 DQB1* 03:01 DPB1* 04:01 a
A*29:01 Си^*07:01 В*58р DRB1*13:01 DQA1*01:03 БОВ1* 06:02 DPB1*13:01 b + c
Доноры братья A*31:01 Cw*12:03 Б*51р DRB1*11:04 DQA1*05:01 DQB1*03:01 DPB1*04:01 a
1, 2: A*29:01 Си^*07:01 B*58 р DRB1*U:11 DQA1*0J:02 DQB 1*06:02 DPB1*02:01 b Доноры сестры A*31:01 Cw*12:03 Б*51р DRB1* 11:04 DQA1* 05:01 DQB1*03:01 DPB1* 04:01 a
________________________3, 4: А*2Ш1 Cw*15:02 В*07р DRB1*13:01 DQA1*01:03 DQВ1* 06:02 DPB1*13:01 c
Cw*12 у реципиента и Cw*03 у донора. Семейное обследование — генотипирование родителей с целью анализа сегрегации гаплотипов, проведенное по высокому разрешению, показало, что донор является гаплоидентичным, а идентичность сибсов по аллелям DRB1, DQA1, DQB1 класса II является следствием гомозиготности аллелей этих локусов также до 4-го знака на гомологичных хромосомах С6 отца, от которого дети и получили различающиеся хромосомы. Следует подчеркнуть, что только реакция MLC в этом случае позволила выявить имеющиеся генетические различия между сибсами всего по одному гену DPB1, отражающие их неидентичность по HLA класса II, и предотвратить трансплантацию от неидентичного донора.
Во второй семье А. (табл. 2) причиной изначально выявленной при генотипировании "ложной HLA-идентичности" оказалось сочетание кроссинговера у одного из родителей с гомозиготностью генов некоторых локусов HLA класса II на его аллельных хромосомах. Два донора — гаплоидентичные братья — были идентичны с реципиентом по всем аллелям HLA-A, HLA-B, HLA-C класса I (HLA-A*29:01, B*58p и Cw*07:01) и при этом идентичны с ним и по обоим локусам, генотипированным частично по низкому и частично по высокому разрешению HLA класса II: DRB1*13 и DQB1*06:02—*06:08. Это, как указано в стандартах гистосовместимости и иммуногенетического тестирования [3], давало основание считать обоих доноров HLA генотипически идентичными сибсами. Высокий пролиферативный ответ в реакции MLC указывал на HLA-неидентичность доноров братьев с реципиентом. Генотипи-рование доноров и реципиента по высокому разрешению локуса HLA-DRB1 и дополнительно по высокому разрешению локусов DQA1 и DPB1, а также генотипирование двух других сибсов — сестер (родителей не было в живых) по тем же локусам на уровне аллелей показало, что реципиент имел рекомбинантную в результате кроссинговера хромосому С6. Два гаплоидентичных с реципиентом брата имели общность с ним по малому фрагменту (пояснения см. далее по тексту) его рекомбинантной хромосомы (были идентичны с ним по всем HLA класса I), но различались с ним по большому фрагменту его рекомбинантной хромосомы (были неидентичны с ним по некоторым HLA класса II). В то же время две гаплоидентичные с реципиентом сестры имели общность с ним по большому фрагменту его рекомбинантной хромосомы (были идентичны с ним по всем HLA класса II), но различались с ним по малому фрагменту его рекомбинантной хромосомы (были неидентичны с ним по некоторым HLA класса I).
Таким образом, братья оказались неидентичны с реципиентом по следующим HLA класса II: по одной аллели DRB1 (*13:01 у R и *13:11 у D 1, 2), по одной аллели DQA1 (*01:03 у R и *01:02 у D 1, 2) и по одному гену DPB1 (*13:01 у R и *02:01 у D 1, 2), что и обусловило высокий пролиферативный ответ их лимфоцитов на лимфоциты ре-
ципиента в реакции MLC. Сестры оказались идентичны с реципиентом по генам всех локусов HLA класса II, в связи с чем пролиферативный ответ в их реакции MLC с реципиентом отсутствовал. По двум аллелям локуса HLA-А (А*29:01 и А*31:01) сестры также были идентичны с реципиентом вследствие гомозиготности по этим аллелям их родителя, имеющего рекомбинантную хромосому.
Следует отметить, что неидентичность обеих сестер с реципиентом по одному гену HLA-B (B*58p у R и B*07p у D3, 4) и по одному гену HLA-C (C *07:01 у R и C*15:02 у D 3, 4) HLA класса I не вызывала развития пролиферативных ответов в реакциях MLC. Известно, что при ТКМ от неродственного донора множественные неидентичности между донором и реципиентом по HLA класса I ассоциируются с отторжением трансплантата [21], что приводит к увеличению летальности [22, 23].
Доноры для 12 (5,6%) из 212 реципиентов, идентичных по HLA класса I (HLA-A, HLA-B, HLA-C) обеих гомологичных хромосом С6, оказались несовместимыми в реакции MLC и неидентичными по локусам HLA класса II DRB1 низкого разрешения и DQB1 высокого разрешения: для 11 реципиентов доноры—сибсы оказались гаплоиден-тичными и лишь для 1 реципиента донор оказался HLA-генотипически неидентичным сибсом.
В двух (М. и З.) из этих 11 семей (табл. 3) на основании генотипирования родителей у сибсов были выявлены рекомбинантные хромосомы С6, образовавшиеся вследствие кроссинговера, произошедшего на уровне HLA класса I и II. Рекомбинантная хромосома вследствие кроссинговера, произошедшего на том же уровне, была обнаружена, как указано выше, и у больного в семье А. с "ложной HLA-идентичностью" (см. табл. 2). Гаплоидентичность доно-ров-сибсов с реципиентами в остальных 9 семьях можно было только предполагать, так как родители и остальные сибсы были недоступны для генотипирования, а без определения сегрегации гаплотипов нельзя исключить простой идентичности донора и реципиента изолированно по специфичностям HLA-А, HLA-В, HLA-С и HLA-DRB1, HLA-DQB1 одной из двух гомологичных хромосом С6.
Таким образом, из 212 обследованных семей нам удалось выявить три семьи (М., З. и А.) с рекомбинантной хромосомой С6 (см. табл. 3), которая состояла из двух фрагментов: малого, включающего часть малого плеча хромосомы, на котором расположены гены всех локусов HLA класса I, и большого фрагмента, включающего как остальную часть малого плеча хромосомы, на котором расположены гены всех локусов HLA класса II, так и центромеру, и все большое плечо хромосомы С6. У больной в семье М. была диагностирована В-клеточная фолликулярная лимфома, больная в семье З. страдала ОЛЛ, больной в семье А. — ОМЛ. В семьях М. и З. каждый гаплоиден-тичный сибс имел общность с другим сибсом по малому фрагменту его рекомбинантной хромосомы, т.е. был иден-
17
Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3
Таблица 3
Образование рекомбинантных хромосом С6 (c + d) в результате кроссинговера между аллельными хромосомами у одного из родителей в семье А. и у матерей в семьях М. и З.
Семья А.
A*29:01
A*29:01
Сч-*07:01
Cw* 15:02
В*58р
B*07p
III
DRB1* 13:11/39 DRB1*13:01
DQA1*01:02 DQA1 *01:03
DQB1*06:02-08 DPB1*02:01 a DQВ1* 06:02-08 DPB1*13:01 b
(R) A*29:01 Ow*07:01 B*58р DRB1*13:01 DQA1*01:03 DQВ1* 06:02-08 DPB1*13:01 a + b
Семья М.
А*03 Ow*08 В*14 DRB1*15:01 DQB1*06:02-08 DPB1*Z a А*01 Cw*07 В*08 DRB1 *01:02 DQB1*05:01 DPB1*X b
(R) А*03 Ow*08 В*14 DRB1*01:02 DQB1*05:01 DPB1*X a + b
Семья З.
А*02 Ow*08 В*07 DRB1*17 DQB1*02:01 DPB1*Y a
А*02 Cw*07 В*13 DRB1*15:01 DQB1*06:02-08 DPB1*Z b
(D) А*02, Ow*08 В*07 DRB1*15:01 DQB1*06:02-08 DPB1*Z a + b
тичен с ним по HLA-А, HLA-В, HLA-C класса I и отличался от него по большому фрагменту рекомбинантной хромосомы, т.е. был неидентичен с ним по HLA класса II; в результате пролиферативный ответ в реакциях MLC развился в обоих направлениях. В семьях А. и М. рекомбинантную хромосому имели реципиенты, в семье З. ее имела донор-сибс — девочка 16 лет, у которой были некоторые дефекты общего развития и умственная отсталость, что иногда сочетается с кроссинговером. В семьях М. и З. сибсы получили рекомбинантные хромосомы от своих матерей, у которых кроссинговер обычно наблюдается значительно чаще, чем у отцов [4]. Оба донора в семье М. по второй гомологичной хромосоме С6 были неидентичны с
больной; в семьях З. и А. по второй гомологичной хромосоме сибсы были идентичными.
В трех других семьях (П., Ш. и О.) из этих 11 семей была выявлена асимметричная реакция MLC — пролиферативный ответ развился только в одном направлении: R vs D вследствие того, что у всех трех больных имелась го-мозиготность HLA класса II гомологичных хромосом С6. В качестве примера приводим данные семьи П., в которой гены HLA класса II больного целиком входили в состав генотипа HLA-А, HLA-В, HLA-С идентичного донора, а донор при этом дополнительно имел отсутствующие у реципиента гены: DRB1*16, DQА1*01:02 и DQB1*05:02 и, возможно, отсутствующий у реципиента ген нетипиро-ванного локуса DPB1:
Реципиент: А*02 В *44 Cw*01 DRB1*07 DQА1*02:01 DQB1*02:01 DPB1*X a
А*31 В*49 Cw*01 DRB1*07 DQА1*02:01 DQB1*02:01 DPB1*X b
Донор: А*02 В*44 Cw*01 DRB1*07
DQА1*02:01 DQB1*02:01 DPB1*X a
А*31 В*49 Cw*01 DRB1*16 DQА1*l01:02l DQB1*05:02 DPB1*Y c
В табл. 4 представлены суммированные данные зависимости величины пролиферативного ответа в реакции MLC от генетических различий донора и реципиента по HLA класса II. Так, в семье М. различия между донором и реципиентом всего по одному гену трансплантационно самого значимого, "сильного" локуса DRB1 вызвали очень высокий пролиферативный ответ — максимальное значение RR составило 76%. В противоположность этому в семье Я. различия между донором и реципиентом всего по одному гену трансплантационно менее значимого локуса DPB1 вызвали невысокий пролиферативный ответ: величина RR была 26,4 и 36,2% соответственно. В семье А. выявлено кумулятивное влияние нескольких генетических различий на величину пролиферативного ответа. Наряду с различиями по одному гену локуса DPB1 гаплоидентичный донор в этой семье отличался от реципиента еще и по одной аллели локуса DRB1 + одной аллели локуса DQA1, что вызвало в реакции MLC увеличение величины RR до 68,5%. В семье П., в которой была выявлена асимметричная реакция MLC, значительные
Таблица 4
HLA-генотипическая значимость пролиферативного ответа в реакции MLC — его зависимость от различного набора генов и аллелей HLA класса II у донора и реципиента
Семья
Доноры (D)
HLA-генетические различия
реципиент
донор
MLC (RR,%) (совместимость при RR < 15 % )
М.
А.
П.
А.
D 1, 2 Брат и сестра
D 1 (см. табл.1)
D 1, 2 Братья (см. табл. 2)
D 1
(см. в тексте)
D 3, 4 Сестры (см. табл. 2)
D1
DRB1*10
DPB1*Yr*X
DRB1*
DPB1*I],
DPB1*|04:01 DPB1*09:01|
DRB1*13 01 DRB1*13:
DQA1*01 03 DQA1*01: 02
DPB1*|13:01 DPB1*02: 01
Нет различий
DRB1*16 DQА1
PT02]
РОВ1*05:02 DPB1*H
Нет различий Нет различий
DRB1*01, *07
РОВ1*0МЛ dpb1*Y ,*X
DRB1*pl*j7|
DQВ1*0Щ
DPB1*U*Zj
R vs D1 = 57,3 R vs D2 = 48,2 D1 vs R = 76,0 D2 vs R = 63,8
R vs D = 26,4 D vs R = 36,2
R vs D1 = 65,1 R vs D2 = 68,5 D1vs R = 42,1 D2 vs R = 55,1
R vs D = 70,4 D vs R = 1,2 (асимметричная MLC)
R vs D3 = 3,7 R vs D4 = 1,9 D3 vs R = 1,3 D4 vs R = 1,2 (совместимость в MLC)
R vs D = 113 D vs R = 80 (максимальный ответ в MLC HLA-неидентичных сибсов)
Примечание. X, Y, Z, I — не генотипировали.
Я
и
18
Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3
превышающие отличия в генотипе гаплоидентичного донора: по одному гену DRB1 + одному гену DQA1 + одному гену DQB1 вызвали развитие высокого пролиферативного ответа только в одном направлении: R vs D, величина RR составила 70,4%; ответ лимфоцитов донора на стимуляцию лимфоцитами реципиента отсутствовал. В то же время при полном отсутствии генетических различий по HLA класса II между донорами сестрами и реципиентом в семье А. пролиферативный ответ вообще не развился ни в одном из двух направлений — величины RR как R vs D 3,4, так и D 3,4 vs R находились в интервале 1,2—3,7%, т. е. сестры оказались полностью совместимыми с реципиентом в реакции MLC. В противоположность этому в семье Й. при максимальных различиях HLA генотипически неидентичного донора-сибса с реципиентом по двум генам DRB1 и одному гену DQB1 в реакции MLC наблюдался и максимально высокий пролиферативный ответ: величина RR в направлении R vs D составила 113% и D vs R 80%.
Не выявлено ни одного случая ложноотрицательного или ложноположительного результата при определении совместимости в реакции MLC между донорами сибсами и больными, находящимися в состоянии ремиссии.
Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что пролиферативный ответ в реакции MLC коррелирует с HLA-генотипом и является генетически зависимым, позволяющим исключить "ложную HLA-идентичность" сибсов. Поэтому пролиферативный ответ в реакции MLC всегда отразит несовместимость сибсов по генам тех из трансплантационно-значимых локусов области HLA-D, которые не были генотипированы в ПЦР.
Необходимость проведения параллельного исследования совместимости доноров—сибсов и реципиентов в реакции MLC и их идентичности при генотипировании HLA класса II в ПЦР была вызвана еще и тем, что в 1990-х годах появились работы [24, 25], в которых сообщалось, что пролиферативный ответ в реакции MLC не всегда прогнозирует неидентичность донора и реципиента по локусу HLA-DRB1. Между тем, как показали наши исследования, пролиферативный ответ в реакции MLC четко обусловлен генетически. Генотипическая значимость пролиферативного ответа заключается в зависимости его развития от неидентичности донора-сибса и реципиента по генам локусов HLA класса II. При этом было показано, что большая часть пролиферативного ответа отражает неидентичность донора и реципиента по локусу HLA-DRE1, а меньшая его часть — неидентичность по локусам DQВ1 и DРВ1, что согласуется с данными других авторов [9]. Помимо этого, было показано [4], что различия донора и реципиента даже по аллелям DRB1 и DQB1 существенно влияли на риск развития РТПХ. Имеются сообщения [5] о том, что несовместимость по одному гену DPB1 отрицательно влияла на результаты ТКМ у больных, а по двум DPB1 генам являлась причиной смерти от РТПХ больных, идентичных с неродственным донором по 10/10 (2 А, 2В, 2 С, 2DPB1 и 2DQВ1) HLA. G. Fischer и соавт. [6] приводят данные о неблагоприятном влиянии неидентичности донора с реципиентом даже по одной аллели HLA-DPB1 на исход ТКМ.
В настоящее время появляются работы, в которых говорится о необходимости генотипирования не только неродственных, но и родственных доноров—сибсов для ТКМ и ГСКК еще и по локусу HLA-DPB1, т.е. по 12/12 HLA, о чем сообщали еще в 2002 г. M. Muro и соавт. [4], а позже в 2007 г., M. Fernandez-Vina и соавт. [26], последние включали в рутинное ПЦР-генотипирование доноров-сибсов помимо локусов DRB1 и DQB1 еще и локусы DRB 3/4/5.
С помощью реакции MLC в эксперименте [27, 28] было доказано, что не все, а лишь некоторые сочетания между донором и реципиентом неидентичных аллелей DPB1 являются функционально, а значит и трансплантационнозначимыми. Эти данные позволяют расширить контингент доноров при рекомендуемом генотипировании пар донор— реципиент по 12/12 HLA для проведения ТКМ [29, 30].
В рекомендациях EFI 2011 г. "Стандарты гистосовместимости и иммуногенетического тестирования" [3], в которых приводятся необходимые требования для поиска HLA-идентичных доноров сибсов при ТКМ и ГСКК, нет точного перечня HLA генов и аллелей, типирование которых необходимо. Согласно этим рекомендациям:
1. В качестве 1-го этапа предлагается типирование HLA-A, HLA-B или HLA-DR доступных членов семьи пробанда.
2. В качестве 2-го этапа предлагается установление генотипической идентичности между донором и реципиентом на основании определения сегрегации четырех гапло-типов. В случае невозможности выполнить это требование в связи с недоступностью для типирования родителей или других сибсов семьи рекомендуется использование ДНК-генотипирования высокого разрешения HLA класса I и/или класса II (4-значное обозначение аллели).
3. Перед ТКМ от родственного донора считается необходимым как минимальное требование повторение типи-рования HLA-А, HLA-В и HLA-DRB1 донора и реципиента с использованием вновь взятых от них образцов крови для типирования в качестве подтверждающего исследования ранее проведенного HLA-типирования 2-го этапа. Другими словами, в случае недоступности родителей или других сибсов для типирования предлагается три варианта тестирования гистосовместимости сибсов:
— использование генотипирования высокого разрешения HLA класса I и высокого разрешения HLA класса II (а);
— использование генотипирования высокого разрешения HLA класса I (подразумевается: и низкого разрешения HLA класса II) (б);
— использование генотипирования высокого разрешения HLA класса II (подразумевается: и низкого разрешения HLA класса I) (в)
Однако при использовании варианта (а) не указывается точный перечень необходимых для типирования локусов, в том числе локус DPB1, различия по которому нередко могут быть единственным признаком "ложной HLA-идентичности" сибсов. При использовании же вариантов (б) и (в) не учитываются возможные случаи "ложной HLA-идентичности" сибсов по причинам или гомозиготности родителей сибсов по генам или аллелям HLA, или сочетания кроссинговера у родителей с их го-мозиготностью по генам HLA. Следует заметить, что в ряде случаев при подборе донора-сибса для реципиента при ТКМ не проводится подтверждающее генотипирова-ние ^А-А, HLA-В, HLA-DRB1 донора и реципиента, как это предусмотрено в стандартах в качестве минимального требования. Между тем определение совместимости HLA генотипически идентичных донора и реципиента в реакции MLC фактически одновременно является и подтверждающим исследованием на их совместимость по HLA класса II наряду с подтверждающим типированием локуса DRB1, как рекомендовано EFI [3].
Наши данные о генетической значимости пролиферативного ответа в реакции MLC и кумулятивном действии на него неидентичностей между донором и реципиентом по нескольким локусам HLA хорошо согласуются с данными M. Muro и соавт. [4], сообщившими о двух семьях, в которых
19
Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3
доноры костного мозга и реципиенты были HLA-A, HLA-B, HLA-C идентичными, но отличались по HLA класса II: в одной семье — по одной аллели HLA-DRB1, в другой семье — по одной аллели HLA-DRB1 + по одному гену DPB1, что стимулировало пролиферативные ответы в реакциях MLC в обеих семьях. Авторы подчеркивают высокую чувствительность и специфичность реакции MLC вследствие генетической зависимости ее пролиферативного ответа.
На основании анализа данных проведенных исследований мы пришли к выводам:
1. Использование реакции MLC позволяет выявлять изначально определенную при ПЦР-генотипировании "ложную HLA-идентичность" на самом деле гаплоиден-тичных сибсов, если генотипирование HLA класса I и II проводилось частично по низкому и частично по высокому разрешению. Причинами являются: гомозиготность HLA генов класса I и II на гомологичных хромосомах С6 одного из родителей сибсов или сочетание у него произошедшего кроссинговера с указанной гомозиготностью. Использование реакции MLC позволяет предотвратить ТКМ и ГСКК от HLA-гаплоидентичных (неидентичных) сибсов по протоколу, предназначенному для HLA генотипически идентичных сибсов, благодаря чему избежать развития у реципиента смертельно опасных осложнений: острой РТПХ или неприживления трансплантата.
2. Пролиферативный ответ в реакции MLC обладает HLA-генотипической зависимостью и отражает неидентичность донора и реципиента по HLA класса II. Большая его часть отражает неидентичность донора и реципиента по локусу DRB1, меньшая — неидентичность по локусу DPB1. Пролиферативный ответ в реакции MLC у гапло-идентичных сибсов, идентичных по каждому из трех локусов HLA класса II: DRB1, DQА1 и DQB1 обеих гомологичных хромосом на уровне аллелей, позволил выявить неидентичность этих сибсов всего лишь по одному гену локуса DРB1, что подтверждает высокую специфичность и чувствительность реакции MLC.
3. Генотипическая значимость пролиферативного ответа в реакции MLC заключается и в зависимости развития пролиферативного ответа от набора генов HLA класса II у реципиента и донора. Неидентичность донора с реципиентом по одному или двум генам локусов HLA класса II вызывала двунаправленный пролиферативный ответ в реакции MLC. При нескольких генетических различиях доноров сибсов по HLA класса II — по одной аллели локуса HLA-DRB1 + одной аллели локуса DQA1 + одному гену DPB1, проявился кумулятивный эффект — в реакции MLC развился высокий пролиферативный ответ. Когда один из двух гаплоидентичных сибсов имел гены HLA класса II, отсутствующие у другого, развивался однонаправленный пролиферативный ответ — асимметричная реакция MLC. При идентичности доноров с реципиентом по всем HLA класса II (при их общности по большому фрагменту рекомбинантной хромосомы) пролиферативный ответ в MLC отсутствовал в обоих направлениях; неидентичность этих сибсов по двум генам локусов HLA класса I не смогла вызвать пролиферативный ответ в MLC. При отличии HLA-неидентичного донора-сибса от реципиента по двум генам локуса DRB1 и одному гену локуса DQB1 в реакции MLC наблюдался максимально высокий пролиферативный ответ. Эти данные свидетельствуют о том, что пролиферативный ответ в реакции MLC избирательно отражает генетическую неидентичность донора и реципиента именно по HLA класса II.
4. У 12 (5,6%) из 212 пар сибсов донор — реципиент, идентичных по HLA-А, HLA-В, HLA-С класса I обеих гомологичных хромосом, была выявлена несовместимость в реакции MLC и неидентичность по HLA-DRB1 низкого разрешения и DQB1 высокого разрешения класса II, что встретилось в 10 раз чаще у предположительно гаплои-дентичных сибсов (у 11 пар донор — реципиент), чем у HLA-генотипически неидентичных сибсов (у одной пары донор — реципиент).
5. Определение совместимости в реакции MLC генотипически HLA-идентичных донора и реципиента является подтверждающим исследованием ранее проведенного генотипирования HLA класса II (2-го этапа типирования согласно рекомендациям EFI) перед ТКМ и ГСКК.
Таким образом, при проведении только ПЦР HLA-ге-нотипирования по ограниченному набору HLA-локусов частично по низкому и частично по высокому разрешению неизбежны ошибки в определении HLA-генотипической идентичности доноров-сибсов. Поэтому, основываясь на приведенных данных, для гарантированного идентифицирования донора сибса в качестве HLA-генотипически идентичного (имеющего с больным две одинаковые хромосомы С6) считаем целесообразным рекомендовать использовать надежный комплекс обследования пары донор — реципиент, включающий как конкретный перечень минимально необходимых HLA-локусов для ПЦР-SSP генотипирования с указанием уровня разрешения генотипирования, так и параллельное определение совместимости пары донор—реципиент в реакции MLC, т.е. проведение биологического тестирования на их совместимость in vitro.
Считаем целесообразным рекомендовать следующий алгоритм подбора HLA-фенотипически идентичных до-норов-сибсов для ТКМ:
• по HLA класса I: ПЦР-генотипирование донора сибса и реципиента по HLA-А, HLA-В и HLA-С высокого разрешения;
• по HLA класса II: сочетание ПЦР генотипирования донора-сибса и реципиента по HLA-DRB1 низкого (или высокого) разрешения, по DQB1 высокого разрешения с параллельным определением совместимости донора и реципиента в реакции смешанной культуры лимфоцитов — MLC.
В противном случае при поиске HLA-генотипически идентичного донора сибса для ТКМ необходимо проведение ПЦР-генотипирования доноров-сибсов и реципиента только по высокому разрешению всех трансплантационно значимых локусов HLA класса I и класса II, включая локусы DRB 3/4/5, DPB1 и т.д., что, однако, значительно удорожает и усложняет подбор доноров сибсов, являясь мало доступным в практической работе.
Работа выполнена по теме НИР "Изучить эффективность трансплантации аллогенных и аутогенных гемопоэтических клеток в комплексной терапии острых лейкозов и хронического миелолейкоза" (№ гос. регистр.: 012000602115, сроки выполнения: 2006—2010 гг.).
Авторы выражают благодарность руководителю темы акад. РАМН В. Г. Савченко за содействие и помощь в проведении исследований.
ЛИТЕРАТУРА
1. Савченко В. Г., Любимова Л. С., Паровичникова Е. Н. и др.
Трансплантация аллогенных и аутологичных гемопоэтических стволовых клеток при острых лейкозах (итоги 20-летнего опыта). Тер. арх. 2007; 79 (7): 30—35.
2. Зотиков Е. А. Антигенные системы человека и гомеостаз.
М.: Наука; 1982: 127—129.
20
Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3
3. European Federation for Immunogenetics. Standards for histocompatibility & immunogenetics testing. Version 5.6.2. (Accepted by the Standards and Quality Assurance Committee on 3 May 2011. Accepted by the EFI Executive Committee on 31 August 2011. Effective from 1 October 2011): 8; 13—14.
4. Muro M., Moya-Quiles M. R., Marin L. et al. Report of recombinations between HLA loci within two families: utility of high resolution typing. Clin. Transplant. 2002; 16: 329—333.
5. Fernandez-Vina M., Cano P., Parmar S. et al. A dose effect of DPB1 mismatches may increase the risk for graft versus host disease in bone marrow transplants from unrelated donors of patients with high risk myeloid leukemia’s. Tiss. Antigens 2007; 69 (5): 520—521.
6. Fischer G. F., LudajicK., Balavarca Y. et al. Impact ofHLA-DPB1 allelic and single amino acid mismatches on haematopoietic stem cell transplantation outcomes. Bone Marrow Transplant. 2008; 41 (suppl. 1): 78.
7. Glay T. M., Jones H. P., Bidwell J. L. et al. A comparison of DNA — RFLP typing with serology and mixed lymphocyte reaction in the selection of matched unrelated bone marrow donors. Bone Marrow Transplant. 1989; 4: 493—497.
8. Petersdorf E. W., Longton G. M., Anasetti C. et al. Definition of HLA-DQ as a transplantation antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 15 358—15 363.
9. Olerup O., Moller E., Persson U. HLA-DP incompatibilities induce significant proliferation in primary mixed lymphocyte cultures in HLA-A, -B, -DR and -DQ compatible individuals: implications for allogeneic bone marrow transplantation. Tiss. Antigens 1990; 36 (5): 194—202.
10. Cesbron A., Moreau P., Milpied N. et al. Influence of HLA-DP mismatches on primary MLR responses in unrelated HLA-A, -B, -DR, -DQ, -Dw identical pairs in allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 1990; 6: 337—340.
11. Bodmer W. HLA polymorphism: Origin and maintenance. In: Terasaki P., Gjertson D. W., eds. HLA 1997. Los Angeles; 1997: 135—170.
12. Cecuk-Jelicic E., Grubic Z., Zunec R. et al. Bone marrow transplantation — searching for HLA compatible donor. Genes and Immunity 2005; 6 (suppl. 1): 75.
13. Шпакова А. П., Булычёва Т. И., Любимова Л. С. и др. Результаты HLA-DRB1, -DQB1 ПЦР-типирования и определения совместимости в реакции смешанной культуры лимфоцитов — MLC при трансплантации аллогенного костного мозга от сибсов. Гематол. и трансфузиол. 2005; 50 (3): 29—36.
14. Layrisse Z., Heinen Н. D., Simonney N. HLA-D typing with homozygous cells identified in an american indigenous isolate. II Family studies and D/DR relationship. Tiss. Antigens 1982; 20 (2): 86—99.
15. Шпакова А. П., Булычева Т. И., Любимова Л. С. и др. Значение и особенности реакции смешанной культуры лимфоцитов в определении гистосовместимости донора и реципиента при трансплантации аллогенного костного мозга у больных гемобластозами. Тер. арх. 2000; 72 (11): 62—67.
16. McGlave P. B., Beatty P., Ash R. et al. Therapy for chronic myelogenous leukemia with unrelated donor bone marrow transplantation: results in 102 cases. Blood 1990; 75 (8): 1728—1732.
17. Shpakova A. P., Golovkina L. L., Kutjina R. M. et al. The proliferation response in MLC of HLA-A, -B, -DPB1-mismatched, but HLA-DRB1, -DQA1, -DQB1 identical lymphocytes of sibling pair. EFI. 22nd European immunogenetics and histocompatibility conference, Toulouse, France, 2—5 April 2008. Tiss. Antigens 2008; 71 (4): 324.
18. Shpakova A. P., Golovkina L. L., Kutjina R. M. Detection of HLA incompatibility in a presumably HLA identical related donor by high resolution genotyping and MLC reaction. EFI. 24th European immunogenetics and histocompatibility conference & 17th Italian society for immunogenetics and transplantation biology meeting, 15—18 May 2010, Florence, Italy. Tiss. Antigens 2010; 75 (5): 560.
19. Шпакова А. П., Кутьина Р. М., Пушкина Т. Д. и др. Подбор HLA идентичного донора сибса в многодетной семье с крос-синговером при использовании ПЦР генотипирования высокого разрешения и реакции MLC. Материалы Всероссийской конференции с международным участием "Главный комплекс HLA — к 50-летию открытия". С-Петербург, 16—17 декабря 2009 г. Вестн. гематол. 2009; 5 (4): 66—68.
20. Шпакова А. П., Булычева Т. И., Кутьина Р. М. и др. Значение реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLC) в комплексном определении HLA-идентичности родственного донора и реципиента при трансплантации костного мозга. Матерiали науково-практичноi конференци за уча-стю мiжнародних спещалисыв, присвяченоi 75^ччю ДУ йститут гематологи та трансфузюлогп НАМН Украши, м. Кшв, 27—28 жовтня 2011 р. В кн.: Актуальш питан-ня гематологи та трансфузиолопг Кшв: АНка-Н; 2011: 162—164.
21. Pollack M. C. The history of allogeneic bone marrow/stem cell transplantation: the last five years. In: Terasaki P., Gjertson D. W., eds. HLA 1997. Los Angeles; 1997: 44—69.
22. Hansen J. A., Petersdorf E., Martin P. J. et al. Hemapoietic stem cell transplants from unrelated donors. Immunol. Rev. 1997; 157: 141—159.
23. Зарецкая Ю. М., Леднев Ю. А. HLA 50 лет: 1958—2008. Тверь: Триада; 2008: 146.
24. De Gast G. C., Mickelson E. M., Beatty P. G. et al. Mixed leukocyte culture reactivity and graft-versus-host disease in HLA-identical marrow transplantation for leukemia. Bone Marrow Transplant. 1992; 9: 87—90.
25. Mickelson E. M., Longton G., Anasetti C. et al. Evaluation of the Mixed Lymphocyte Culture (MLC) assay as a method for selecting unrelated donors for marrow transplantation. Tiss. Antigens 1996; 47 (1): 27—36.
26. Fernandez-Vina M., Guerrero E., Zhao W. et al. DPB1 typing in related-donor allogeneic bone-marrow transplantation. Tiss. Antigens 2007; 69 (5): 512.
27. Sizzano F., Zito L., Crivello R. et al. Preferential in vitro CD4+ T cell expansion in response to HLA-DP alloantigens carrying a T cell epitope disparity. Tiss. Antigens 2010; 75 (5): 554.
28. Sizzano F., Zito L., Crivello P. et al. In vitro evidence for an innovative, clinically relevant T cell epitope matching strategy for HLA-DPB1 in unrelated hematopoietic stem cell transplantation. Tiss. Antigens 2011; 77 (5): 373—374.
29. Crocchiollo R., Zito E., Vago Luc et al. Nonpermissive HLA-DPB1 disparity is a significant independent risk factor for mortality after unrelated hematopoietic stem cell transplantation. Blood 2009; 114 (7): 1437—1444.
30. Fleischhauer K., Shaw B., Malkki M. et al. Significant correlation between donor-recipient HLA-DPB1 T cell epitope matching and survival in 4490 unrelated 10/10 matched hematopoietic stem cell transplants analyzed within the 15th International Histocompatibility Workshop on behalf of the International Histocompatibility Working Group (IHWG) in hematopoietic cell transplantation. Tiss. Antigens 2010; 75 (5): 469—470.
Поступила 19.01.12
21
