Развитие особей двух видов рода Iris L. в культуре in vitro Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

УДК 502.7+558.085

Е.М. Маркова, Л.И. Конькова

РАЗВИТИЕ ОСОБЕЙ ДВУХ ВИДОВ РОДА IRIS L. В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

Представлены результаты наблюдений за начальными этапами развития растений рода Iris в культуре in vitro, выявлены условия прорастания и развития растений.

Ключевые слова: прорастание семян, тип экспланта, развитие растений in vitro, род ирис.

На территории Удмуртии в диком виде встречается два представителя рода Iris L. - ирис сибирский (Iris sibirica L.) и и. ложноаировидный (I. pseudacorus L.). В своем распространении виды приурочены преимущественно к поймам крупных рек, чаще встречаются в южных районах Удмуртии [1]. Оба вида внесены в Красную книгу Удмуртской Республики с категорией редкости 3 [2]. Наши исследования природных ценопопуляций показали, что в основном особи этих видов встречаются небольшими по численности группами, хотя имеются ценопопуляции, занимающие обширные территории, например таковые обнаружены для ириса сибирского в окрестностях д. Крымская Слудка Кизнерского района и в окрестностях биостанции «Сива» в Воткинском районе. Так как данные виды являются редкими, то они были включены в программу исследований по интродукции редких видов в Ботаническом саду Удмуртского университета. На первом этапе сотрудниками Ботанического сада проведено исследование особенностей размножения и развития растений в условиях открытого грунта [3]. При интродукции видов был отмечен ряд трудностей при семенном размножении растений, хотя это могло компенсироваться вегетативным размножением, за счет искусственного деления корневищ. Интродукция растений подразумевает не только сохранение вида на территории ботанического сада, но и возможность в дальнейшем возвратить вид в его естественное местообитание. В связи с этим весьма важным становится вопрос генетического полиморфизма создаваемой популяции, уровень которого резко снижается в случае использования только вегетативно размноженных особей, что негативно может сказаться на ее существовании. Поэтому целью нашей работы стало изучение растений рода Iris в культуре in vitro, а также поиск путей, обеспечивающих возможность развития растений из семян.

Материалы и методика исследований

Для эксперимента были взяты семена двух видов рода ирис. Они были собраны с интродуциро-ванных особей в Ботаническом саду УдГУ на стадии биологической спелости. Семена Iris sibirica были собраны во второй половине августа, семена Iris pseudacorus - во второй половине сентября 2009 года. Эксперимент заложен в январе 2010 г. в лаборатории микроклонального размножения растений кафедры ботаники и экологии растений Удмуртского государственного университета.

В качестве эксплантов нами использованы семена с разным уровнем повреждения структуры. Для семян ирисов характерно ороговение эндосперма к моменту созревания плодов, он становится плотным, стекловидным на срезе, такое состояние эндосперма существенно снижает возможность проникновения воды и растворенных в ней веществ к зародышу, кроме того, семена имеют плотную семенную оболочку. Сам зародыш имеет торпедовидную форму: вытянутый, продолговатый с невыраженными семядолями - они в виде бугорков, его размеры колеблются в пределах 2-5 мм. Перед нами стояла задача преодолеть покой семян, обусловленный особенностями его строения. Поэтому мы использовали следующие формы экспланта: цельные семена ирисов в качестве контроля, надрезанные семена без повреждения зародыша и изолированные из семян зародыши. Кроме того, нами проведена предварительная 30-дневная стратификация половины использованных в эксперименте семян для выявления необходимости температурного воздействия для преодоления покоя.

Семена перед началом работы промывали в течение 2 часов в проточной воде. Стерилизацию семян проводили по схеме: 1) обработка 70%-м этиловым спиртом - 1 мин; 2) промывание в стерильной дистиллированной воде - 10 мин; 3) обработка 0,2%-м раствором AgNO3 - 10 мин; 4) промывание семян в стерильной дистиллированной воде три раза по 10 мин.

Приготовление и стерилизация питательных сред проводилась по общепринятым методикам [4; 5]. В работе использовали питательную среду, приготовленную по прописи Мурасиге и Скуга

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О 3EMHE

(МС), рН питательных сред до автоклавирования доводили до 5,6-5,8. Учитывая условия обитания видов в природе и рекомендации М.М. Ишмуратовой [6], мы использовали полужидкую питательную среду, содержащую 0,5% агара.

В эксперименте исследовали варианты питательной среды МС, использованные для ирисов М.М. Ишмуратовой [6]:

1) МС без гормональных добавок (контрольная среда);

2) МС + 1мг/л 6-бензиламинопурин (БАП) + 1 мг/л Кинетин;

3) МС + 0,2мг/л БАП + 0,1 мг/л индолил-3-уксусную кислоту (ИУК);

4) МС + 1мг/л индолилмасляную кислоту (ИМК) + 0,5 мг/л Кинетин.

Результаты и их обсуждение

Для успешного введения в культуру in vitro семенного материала требуется предварительное выявление физических условий прорастания семян. На первом этапе работы нами были заложены соответствующие опыты [7]. Прорастание семян и их дальнейшее развитие происходит при освещении и при комнатной температуре, то есть семена являются светочувствительными и могут развиваться при постоянных показателях температурного режима. В качестве эксплантов лучше использовать надрезанные семена и изолированные зародыши. В ходе эксперимента нами фиксировалась продолжительность периода от посева экспланта до начала его прорастания, полученные результаты представлены в табл. 1. Процесс прорастания семян растянут во времени. Семена исследуемых видов прорастают в течение 5-28 дней в случае использования в качестве экспланта надрезанных семян, применение изолированных зародышей сдвигает время начала прорастания в сторону ускорения для Iris sibirica, но замедляет начало прорастания для Iris pseudacorus. Для каждого вида растений и типа экспланта нами отмечены сроки массового прорастания. Сроки совпадают для видов в случае использования в качестве экспланта надрезанных семян и составляют 6-7 и 14-15 дней с момента закладки опыта. В случае использования в качестве эксплантов изолированных зародышей имеются различия, зародыши Iris pseudacorus прорастают в те же сроки, что и семена, а зародыши Iris sibirica прорастают через месяц после закладки эксперимента. Мы выявили, что числовое и процентное соотношение проросших эксплантов семена/зародыши склоняется в сторону семян, то есть наличие даже части семени (эндосперма) обеспечивает лучшую всхожесть. Значит, уровень развития зародыша даже при биологической спелости семян таков, что требуется дополнительное внешнее воздействие.

Таблица 1

Темпы прорастания видов рода Iris в зависимости от типа экспланта

Длитель- ность, кол-во дней Тип экспланта

Iris sibirica Iris pseudacorus

Надрезанное семя Изолированный зародыш Надрезанное семя Изолированный зародыш

шт. % шт. % шт. % шт. %

4 - - 1 2,5 - - - -

5 2 5,0 - - З 7,5 - -

6 З 7,5 - - 5 12,5 2 5,0

7 9 22,5 1 2,5 7 7,5 7 17,5

12 1 2,5 З 7,5 - - - -

13 2 5,0 2 5,0 1 2,5 - -

14 4 10,0 - - 8 20,0 З 7,5

15 З 7,5 - - З 7,5 6 15,0

18 1 2,5 - - 1 2,5 - -

28 З 7,5 4 10,0 1 2,5 1 2,5

Кол-во пророс. семян 28 70,0 11 27,5 29 62,5 19 47,5

Поэтому нами проведено исследование влияния гормонального состава питательной среды на процесс прорастания семян. Результаты исследования представлены в табл. 2. Для Iris sibirica выяв-

лена необходимость присутствия гормонов в питательной среде для прорастания как надрезанных семян, так и изолированных зародышей. Для Iris pseudacorus мы отмечаем, что надрезанные семена не нуждаются в содержании в составе питательной среды гормональных веществ, для изолированных зародышей гормональная зависимость выявлена, но стоит отметить, что доля зародышей, прорастающих на безгормональной среде, достаточно велика. Таким образом, при культивировании вида Iris sibirica необходимо введение гормонов - ауксинов и цитокининов, соотношение которых подбирается экспериментально. Для культивирования растений Iris pseudacorus возможно использование безгормональной среды.

Таблица 2

Зависимость прорастания семян от гормонального состава питательной среды

Вид растений Тип экспланта Кол-во проросших эксплан-тов, шт. Cостав питательной среды

MC б/г MC БАП, ИУК MC И№К, кинетин MC БАП, кинетин

шт. % шт. % шт. % шт. %

Iris sibirica Надрезанное семя 28 6 21,42 6 21,42 10 35,74 6 21,42

Изолированный зародыш 11 1 9,09 6 54,54 4 36,36 - -

Iris pseudacorus Надрезанное семя 23 10 43,47 6 26,08 3 13,05 4 17,40

Изолированный зародыш 12 5 41,67 3 25,00 4 33,33 - -

Нами отмечено положительное влияние 30-дневной стратификации на время прорастания семян. Наблюдается ускорение прорастания семян для обоих исследуемых видов и для всех типов экс-плантов (табл. 4). Возможно, такой эффект обусловлен изменениями в состоянии эндосперма семян, который к концу периода стратификации становится мягким, то есть под действием низких положительных температур в намоченных семенах начинаются гидролитические процессы, в результате облегчается доступ питательных веществ к зародышу. Качество семян, прошедших стратификацию, отличается, они становятся мягкими, легко повреждающимися, что отрицательно отразилось на количестве проросших растений. В вариантах эксперимента со стратифицированными семенами нами отмечен более высокий уровень заражения эксплантов грибковыми болезнями и соответственно гибель проростков (табл. 3). Высокая степень инфицирования эксплантов обусловлена повышением проницаемости семенной оболочки в ходе стратификации. Проникшие под семенную оболочку споры грибов и бактерий оказались недоступными для воздействия использованных стерилизующих агентов, которые обеспечили стерильность только поверхности семян.

Таблица 3

Результаты опыта применения стратификации для семян видов рода Iris

Варианты эксперимента Iris sibirica Iris pseudacorus

Количество

проросших семян, % развивающихся растений, % погибших от плесени, % проросших семян, % развивающихся растений, % погибших от плесени, %

Контроль 56,81 26,14 17,05 77,27 32,95 2,27

Гратификация 35,42 18,75 12,50 37,50 12,50 25,00

Одной из задач нашего исследования было изучение онтогенеза, его начальных этапов, факторов среды, оказывающих влияние на темпы органогенеза. Мы уже отметили роль предварительной подготовки, состава питательной среды и типа экспланта в прорастании семян. Также важным является выявить зависимость от перечисленных факторов темпов развития растений. В табл. 4 мы представили только те варианты эксперимента, для которых отмечено развитие растений. Для Iris sibirica

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕMЛЕ

зафиксировано формирование первого листа в течение 4-14 дней с момента прорастания семени, при этом обращается внимание на влияние низких положительных температур в предварительной подготовке и наличие в составе питательной среды определенного соотношения цитокининов и ауксинов, тип экспланта не имеет значения.

Для Iris pseudacorus отмечено формирование первого листа в течение 2-13 дней с момента прорастания семени, при этом в большинстве случаев лист формировался на вторые сутки. Зависимость формирования первого листа у данного вида от стратификации и гормонального состава питательной среды не выявлена, зато большое значение имеет тип экспланта, в вариантах с использованием надрезанных семян и изолированных зародышей развитие идет быстрее.

Таблица 4

Влияние состава питательной среды на морфометрические показатели растений-регенерантов

Вид растений Питательная среда Обработка Тип экспланта Длительность этапов, дн.

прорастание 1 2 3

Iris sibirica МС б/г Без обработки Цельное семя 25 - - 1б

Надрезанное семя б 8 34 44

Стратификация Зародыш 11 - 7 -

МС БАП, Без обработки Цельное семя 29 8 21 -

кинетин Надрезанное семя 22 б 2б 48

Зародыш 7 5 - 32

Стратификация Надрезанное семя б 7 23 3б

МС БАП, Без обработки Надрезанное семя б б 15 35

ИУК Зародыш 18 7 20 -

Стратификация Цельное семя б 4 - -

Надрезанное семя б 4 11 19

Зародыш 10 7 15 -

МС ИМК, Без обработки Надрезанное семя 7 8 34 -

кинетин Зародыш 7 8 21 -

Стратификация Надрезанное семя 3 14 22 -

Iris МС б/г Без обработки Надрезанное семя б - 8 14

pseudacorus Зародыш 4 2 10 1б

МС БАП, Без обработки Надрезанное семя 8 2 б -

кинетин Зародыш 8 2 б 13

Стратификация Цельное семя 13 8 - -

Надрезанное семя 2 4 19 -

Зародыш 13 - 8 -

МС БАП, Без обработки Надрезанное семя 7 - 8 14

ИУК Зародыш 7 - - 21

МС ИМК, Без обработки Надрезанное семя 8 2 б 29

кинетин Зародыш 7 - - 14

Стратификация Цельное семя б - 19 -

Надрезанное семя 4 13 21 29

Зародыш б 4 11 19

В целом мы можем отметить, что темпы органогенеза у исследуемых видов отличаются. Для формирования побега, содержащего три развитых листа, растениям Iris sibirica требуется 30-40 дней, растения Iris pseudacorus формируют побег в течение 15-30 дней.

Выводы

1. Установлено, что введение в культуру видов рода Iris с использованием в качестве эксплан-тов семян приводит к быстрым положительным результатам. Развитие растений проходит достаточно быстро, и в течение месяца возможно получение растений, готовых к посадке в грунт.

2. В качестве эксплантов, для введения в культуру двух видов ириса, исследованных нами, лучше применять надрезанные семена.

3. Условия культивирования для двух видов ириса сходны. Для вида Iris sibirica необходимо введение в состав питательной среды гормонов в следующих сочетаниях: БАП+ИУК, ИМК+Кинетин, растения вида Iris pseudacorus можно культивировать на безгормональной среде.

4. Выявлена зависимость темпов развития растений от состава питательной среды, причем содержание гормонов положительно влияет на органогенез растений Iris sibirica, тогда как для Iris pseudacorus такой зависимости не выявлено.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Баранова О.Г. Картосхемы распространения редких растений в Вятско-Камском междуречье. Ижевск: Изд. дом «Удмуртский университет», 2000. 182 с.

2. Красная книга Удмуртской Республики: Сосудистые растения, лишайники, грибы. Ижевск: Изд. дом «Удмуртский университет», 2001. 290 с.

3. Крамарь О.А. Начальные этапы онтогенеза Iris pseudacorus L. при интродукции // Чтения памяти А.П. Хохрякова: Материалы Всерос. науч. конф. Магадан, 2008. С. 145-147.

4. Основы биотехнологии растений / сост. И.К. Сорокина, Н.И. Старичкова, Т.Б. Решетникова, Н.А. Гринь. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2002. 45 с.

5. Основы микроразмножения редких растений: учеб.-метод. пособие / сост. О.Г. Баранова и др. Ижевск: Удмуртский университет, 2009. 64 с.

6. Ишмуратова М.М. Особенности культивирования in vitro растений различных экологических групп на примере видов рода Iris L. // Растительные ресурсы. 1999. Вып. 4. С. 67-73.

7. Конькова Л.И., Маркова Е.М. Опыт клонирования видов рода Iris L. в Удмуртии // Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира : Материалы III Всерос. науч.-практ. конф. Волгоград, 2010. С. 224-229.

Поступила в редакцию 04.11.10

L.I. Kon’kova, E.M. Markova

Development of species of the genus Iris L. in culture in vitro

The article deals with the results of studies of the initial stages of the genus Iris in culture in vitro, identified the conditions of germination and plant development.

Keywords: germination of seeds, type of explants, culture in vitro, a genus of Iris.

Конькова Лидия Ивановна, студентка

Маркова Елена Михайловна, заведующая Г ербарием

ГОУВПО «Удмуртский государственный университет»

426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)

Kon’kova L.I., student Markova E.M., head of Herbarium Udmurt State University

462034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya str., 1/1