CC BY
82
УДК 543.07+53.087+621.389
Т. М. Зимина, А. В. Соловьев, Ю. А. Гвоздев, А. Ю. Болтенков, И. Р. Ишбердин, Н. Н. Ковалев, В. Е. Лемозерский, А. И. Семенов, Н. О. Ситков, В. С. Соколов, К. А. Титенко, П. А. Хабаров, Т. В. Ширинян, Л. А. Краева, Г. Н. Хамдулаева
Разработки СПбГЭТУ в области технологии лабораторий-на-чипе
Ключевые слова: лаборатории-на-чипе, биосенсоры, портативные диагностические приборы, микрофлюидика, спектрофлюориметрия-на-чипе, динамическая турбидиметрия-на-чипе, клеточные технологии. Keywords: laboratory-on-a-chip, biosensor, portable diagnostic devices, microfluidics, spectrofluorimetry-on-a-chip, dynamic turbidimetry-on-a-chip, cell technologies.
Приводится обзор разработок по теме «лабо-ратории-на-чипе», выполненных в СПбГЭТУ за период 2014-2015 г.
Введение
Лаборатории-на-чипе (ЛНЧ) [1] — это интенсивно развивающееся мультидисциплинарное научно-техническое направление, связанное с миниатюризацией и интегрированием устройств и узлов инструментальной аналитической химии, диагностических систем и приборов на основе использования нанотех-нологий, принципов и технологий микро- и наноэ-лектроники и микросистемной техники. Направление ЛНЧ развивается начиная с 90-х годов ХХ века, причем интенсивность исследований и разработок только возрастает. Первое десятилетие развития этого класса миниатюрных аналитических приборов посвящено разработке техники управления жидкой средой в системе капилляров. Появился термин «микрофлюидика». В первой декаде XXI века потре-
бовалось создать функциональные элементы ЛНЧ и интегрировать их в сложные гибридные приборы. В настоящее время наиболее актуальна проблема гетерогенного интегрирования функциональных компонентов в большие интеллектуальные ЛНЧ. В СПбГЭТУ (Санкт-Петербург) работы в этом направлении ведутся с 1990-х годов, разработан и испытан ряд функциональных элементов [2—4]. Сейчас особое внимание уделяется созданию научно-технических основ конструирования мобильных диагностических приборов нового поколения для медицинского применения с использованием аналитических технологий ЛНЧ. Такие приборы востребованы во всех отраслях медицины, а их внедрение в промышленность позволяет выпустить конкурентоспособные импортозамещающие образцы продукции.
В то же время подобные разработки требуют решения большого количества технических задач, включая создание разнообразных интегрируемых сен-сорно-актюаторных элементов, например, для манипулирования и регистрации клеток и клеточных кластеров в микробиологическом анализе (табл. 1).
Таблица 1 |Функциональные элементы и модули ЛНЧ для микробиологического анализа
Элементы или модули Функция Принцип работы, технология
Пассивные элементы Актюап Сепаратор горные элементы Микрофлюидика, ситовой эффект; лазерная резка
Система каналов Топология, булева логика; толстопленочная технология
Активные элементы Оптические сенсоры ПАВ-актюатор Сенсор Спектрофлюориметр Сила Стокса, акустические волны; встречно-штырьевые преобразователи, ниобат лития тые элементы Микродифракционная вогнутая решетка; лазерная резка, термоформирование
Видеосенсор Микролинзы, КМОП-сенсор
Спекл-анализ с микроколлиматором Микроколлиматор на основе анодного окисла алюминия
Электромагнитные сенсоры Импедиметрический динамический Микроканал, электроды, радиочастотное ЭМ-излучение
Емкостной Микроканал, электроды, то же
биотехносфера
| № 5(41)/2015
5 6
а)
14
Рис. 1 Слои микробиологической ЛНЧ, содержащей капиллярную систему для транспорта компонентов анализа и навесные функциональные элементы:
1 — база; 2 — слой ЛНЧ, содержащий рельеф капиллярной системы; 3 — порт для загрузки пробы; 4 — втулка для присоединения насоса; 5 — канал для реализации гидроудара; 6 — видеосенсор; 7- ростовая камера;
8 — канал для транспорта микроколоний;
9 — видеосенсор для распознавания колоний;
10 — флюориметрический сенсор; 11- импедиметрический сенсор; 12 — акустический сенсор; 13 — ростовые камеры для тестирования антибиотикорезистентности; 14 -ростовая камера для патогенных бактерий; 15, 16 — датчики для счета колоний; 17 — жидкостный ключ; 18 — Т-разветвление; 19 — микрозаслонка для остановки потока; 20 — слив незначимой бактерильной фракции
Из рис. 1 видно, что работа многофункциональной ЛНЧ основана на взаимодействии значительного количества функциональных элементов (см. табл. 1), интегрированных в миниатюрном гибридном приборе.
Рассмотрим более подробно результаты работ по созданию элементов, перечисленных в табл. 1
1. Актюаторные элементы ЛНЧ
1.1. Микрофлюидный модуль предочистки
Микрофлюидный модуль для первичной сортировки ювенильных бактериальных колоний предназначен для удаления миниатюрных неидентифици-руемых фрагментов ростовой массы. Для расчета параметров такого модуля исследовали распределение по размерам модельных ювенильных колоний, выращенных на поверхности высокопитательного агара (рис. 2). Рост колоний длился 3,5 ч. Выращенные колонии визуализированы с помощью микроскопа Axio Scope А1 (производства Zeiss) при увеличении 630. Построены частотные гистограммы распределения бактериальных колоний по размерам и на основе полученных данных разработана топология сепа-рационного микрофлюидного модуля. Размер юве-нильных колоний бактерий измеряли с помощью инструмента «линейка» в программе Zen микроскопа, мкм:
Рис. 2 Вид бактериальной массы (t = 3,5 ч): а — ювенильные колонии на агаре; 1 — E. coli; 2 — K. pneumoniae; б — коккобактериальная масса в потоке
Escherichia coli................................................30-40
Staphylococcus aureus........................................8-10
Staphylococcus epidermidis................................7-12
Staphylococcus saprophyticus ............................8-16
Klebsiella pneumoniae......................................28-49
Proteus vulgaris..............................................30-60
Размеры микроколоний различных бактерий приведены на рис. 3.
Из полученных данных видно, что средний размер ювенильной колонии на стадии роста 3,5 ч является информационным фактором, позволяющим оценить вид бактерий.
На основе полученных данных о размерах юве-нильных колоний сделана оценка размеров боковых микрофлюидных каналов. Топология изготовлена с помощью кода Auto-CAD (рис. 4): размеры пластины 48 х 30 мм, ширина основного канала 300 мкм, диаметр входного и выходного отверстий 2 мм, расстояние между боковыми каналами 570 мкм, ширина бокового канала 50 мкм, длина
2
Рис. 3
Распределение по размеру выращенных колонии (3,5 ч): 1 — S. epidermidis; 2 — S. aureus;
3 — S. saprophyticus;
4 — K. pneumoniae;
5 — E. coli; 6 — P. vulgaris
70
60
50
40
30
20
10
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90
а)
Рис. 4
Микрофлюидный модуль для предварительной сортировки микробной массы: а — топология; б — фрагмент слоя модуля с суспензией вода/
масло
бокового канала 2 мм, количество боковых каналов по 40 с каждой стороны.
Для изготовления устройства в целях первичной сортировки бактериальных колоний использованы пленка из ПВХ с липким слоем и подложка из ПЭТФ. Рисунок выполнен методом лазерной резки. Сборка произведена с применением липкого слоя.
Микрофлюидный модуль работает на основе принципа хроматографии, т. е. удерживания фракций частиц меньшего размера с более высоким значением коэффициента поперечной диффузии в порах (боковых каналах).
Модуль испытывали в потоке при гидростатическом давлении 150 Па. Скорость потока 70— 100 мкм • с-1. Наблюдали миграцию единичных клеток в боковые каналы. Колонии перемещались по центральному каналу.
1.2. Элементы микрофлюидной логики
МЕМС-технологии вносят революционные изменения во многие области благодаря интегрированию кремниевой микроэлектроники и микромеханических технологий, реализуя сложные системы на одном кристалле БоС (Systems-on-a-Chip). Что касается ЛНЧ (1аЬога^гу-оп-а-сЫр), то следует отметить, что вследствие гетерогенности применяемых сред, эти устройства еще не достигли такой же степени интеграции, как БоС, но сейчас интенсивно разрабатываются технологии гетерогенного интегрирования таких систем.
Важными проблемами интегрировании ЛНЧ являются формирование и герметизация жидкостной подсистемы. В области МЕМС уже известны технологии интегрирования всевозможных твердотельных элементов. Это технологии изготовления
биотехносфера
I № 5(413/2015
а)
в)
Рис. 5
Установка для микрофлюидных исследований (а), микрофлюидный чип для сортировки бактериальной смеси на пять фракций на основе булевой логики и пяти датчиков, выполненный с помощью технологии ламинирования (б), изображение, полученное под микроскопом (в)
MEMC-устройств для СВЧ-применений (катушки индуктивности, варакторы, коммутаторы, резонаторы), традиционные технологические циклы изготовления интегральных схем, адаптированные для создания трехмерных механических структур (объемная микрообработка, поверхностная микрообработка и так называемая технология LIGA). Кремниевая объемная микрообработка включает технологию глубинного объемного травления. Объемную структуру можно получить и методом наращивания, когда несколько подложек сплавляются и образуют вертикальные связи на атомарном уровне. При поверхностной микромеханической обработке трехмерная структура образуется за счет последовательного наложения основных тонких пленок и удаления вспомогательных слоев в соответствии с требуемой топологией. Преимущество такой технологии — возможность многократного удаления (растворения) вспомогательных слоев без повреждения взаимосвязей базовых слоев. А главная ее особенность состоит в том, что она совместима с полупроводниковой технологией, поскольку для микрообработки используется обычная КМОП-технология.
Из приведенного арсенала технологий для реализации жидкостной системы можно использовать лишь немногие. Это современные технологии гибкой электроники, традиционное травление, «мягкая литография», а для герметизации — клеевые технологии, спекание, ламинирование.
В настоящее время известны образцы микрофлюидных ЛНЧ с высокой степенью интеграции. Например, устройства, разработанные фирмой Fluidigm (США) [5], в которых применяется технология BioMark HD, позволяющая управлять системой из тысяч «переплетающихся» клапанов и каналов, выполненных на кремниевом чипе.
Для реализации управления жидкостью в капиллярной системе нужно учитывать многие свойства жидкой среды (вязкость, плотность). Непрерывным течением жидкости внутри каналов можно манипулировать, применяя системы запирающих
клапанов. Эта задача решается путем введения набора автоматических электронных сигналов, которые поступают с датчиков, расположенных по ходу течения жидкости. Определенная последовательность выходящих сигналов может быть воспринята клапаном как команда отпирания или, наоборот, запирания одной из ветвей капиллярной системы. Для того чтобы система функционировала заданным образом, к ней могут быть применены принципы булевой логики [6]. То есть в сложной аналитической микрофлюидной системе (рис. 5) должна содержаться не только конструкция, но и аппарат управления анализом. Для анализа множества объектов необходимы их сортировка, адресная доставка и другие операции, которые требуют выполнения логических операций. В этом заключается необходимость рассмотрения элементов булевской логики, основанной на законе исключения третьего, согласно которому логические переменные, в отличие от переменных обычной алгебры, могут принимать только два значения {да, нет}, {истинно, ложно} и т. д. [6].
Для прецизионного направления потоков нужна строгая система управления. При загрузке образца в систему капилляров для дальнейшего анализа необходимо разделить поток клеток в разные сливные емкости. Для этого требуется актюация клапанов, которые должны будут отвечать за создание разности давлений путем их отпирания.
1.3. Цифровая микрофлюидика
В последние годы большой интерес вызывают проблемы так называемой цифровой микрофлю-идики (ЦМФ). Это направление стало одним из самых перспективных с точки зрения создания микрофлюидных систем высокой степени интеграции. Принцип ЦМФ основан на электрической актюа-ции пико- и нанообъемных капель жидкости на гидрофобной поверхности с системой электродов с помощью приложения к электродам электриче-
а)
б)
Рис. 6 \ Подложка для манипулирования каплями. Топология (а) и лабораторный образец (б) [6]
ских потенциалов, изменяющих угол смачивания капель [7-9]. На рис. 6 показана топология базового устройства для манипулирования каплями.
Схема устройства для управления движением капель разработана с использованием программируемого контроллера Ardui.no. Подложка для ЦМФ изготовлена на основе платы путем травления однослойного текстолита в растворе Н2О2 : СбИд07 : МаС1 в пропорции 2 : 1 : 1 в течение 2 ч.
Недостатком метода является необходимость использования электрических потенциалов высоких значений, что более применимо в стационарных приборах, нежели в мобильных. Тем не менее метод имеет перспективу развития в сложную систему дискретного анализа без применения капиллярных систем.
1.4. Микроманипулирование объектами в канале ЛНЧ с помощью ПАВ
Актюатор на основе поверхностных акустических волн (ПАВ) представляет собой акустоэлек-тронное устройство (АЭУ), состоящее из пьезоэлектрической подложки и встречно-штырьевых преобразователей (ВШП) для генерирования ПАВ (рис. 7) [10, 11].
ПАВ-актюатор можно изготовить на основе двух параметров пьзоэлектрических материалов: фазовой скорости ПАВ и коэффициента электромеханической связи (КЭМС). Со скоростью ПАВ V связаны габаритные размеры устройств. Она рассчитывается по формуле
V = If,
где I — расстояние между электродами; f — рабочая частота.
Для количественного описания пьезоэффекта используется КЭМС к, определяющий соотношение между электрической и механической энергиями в пьезоэлектрике:
к2 = W212 / (^1^2),
где Wl, ^2, ^12 — энергия механических и электрических колебаний и их взаимодействия соответственно.
Промышленно выпускаемые материалы для АЭУ можно разделить на три группы. Первую группу образуют монокристаллы. В нее входят такие распространенные материалы, как кварц, ниобат и танталат лития, которые являются псевдоильме-нитами и относятся к группе перовскитоподобных кристаллов. Для этих материалов величина V составляет порядка 3000 м • с-1. По значению КЭМС ниобата лития — 4-5 % — существенно превосходит другие материалы, например, кварца и тан-талата лития — 0,2-0,5 %. Поэтому в качестве подложки выбран ниобат лития в виде пластины с УХ-срезом 128°, толщиной 0,35 мм и с нанесенным слоем алюминия толщиной порядка 1000 А (пластина любезно предоставлена А. С. Койгеровым). Параметры ВШП определены на основе табличных значений параметров ниобата лития, рассчитана рабочая частота прибора — 14 МГц. Макет АЭУ состоит из четырех трехпарных ВШП, между которыми располагается акустическая ячейка площадью 25 мм2. Корпус макета устройства закреплен на пластине полиметилметакрилата (ПММА) толщиной 5 мм в рамке из ПММА толщиной 1 мм. Навесные контакты на металлизированную поверхность ниобата лития выполнены с помощью проводящего клея.
Рассеиваюмую мощность устройства при напряжении 6 В оценили как 6 • 10-3 Вт в апертуре одного ВШП на площади 2,5 щение объекта площадью 4 10-7 Вт. Согласно данным статьи [10] требуемая общая мощность устройства должна составлять не менее 12 мВт. Таким образом, для разрабатываемой системы амплитуда приложенного напряжения должна быть более 12 В.
В эксперименте наблюдали поведение эмульсии водного красителя в масле. Размеры микрокапель водной фазы эмульсии — 20-100 мкм. При включении сигнала частотой 14 МГц наблюдали круговое движение мелких капель с линейной скоростью порядка 10 мкм • с-1. При использовании высоко-
10 5 м2. На переме-
10-10 м2 приходится
Рис. 7
ПАВ-актюатор: а — принцип конструкции; б — общий вид ПАВ-актюатора; в — экспериментальная установка; г — капля эмульсии водного красителя в масле
вольтного генератора с напряжением 10—50 В наблюдали интенсивную ажитацию частиц.
Применение ПАВ-актюатора для манипулирования биологическими объектами, например бактериальными кластерами, в ЛНЧ обладает рядом преимуществ. Прежде всего — это удобный бесконтактный метод фиксации исследуемого объекта, демонстрирующий высокие быстродействие, надежность, воспроизводимость и точность результата. С другой стороны, следует учитывать, что материалы для создания АЭУ дорогие и требуется поиск эффективных способов их применения в одноразовых ЛНЧ.
2. Сенсоры
2.1. Видеосенсор
Для идентификации колоний бактерий в канале важным элементом является видеосенсор. Его применение в мобильном устройстве имеет два ограничения: размер элемента и «увеличение». Исследована возможность создания миниатюрной системы регистрации образов микроколоний размером 10—50 мкм в сенсорном режиме с фиксированным фокусным расстоянием, которая обладала бы жесткостью конструкции (рис. 8, а). Размеры устрой-
ства, созданного на основе камеры ОБИ (Корея), составляют 25 х 60 мм (рис. 8, б), что позволяет интегрировать его в мобильный аналитический прибор.
Механическая модификация камеры позволила применить ее в режиме микроскопа и достичь увеличения х650, что достаточно для визуализации микроколоний бактерий размером 10—20 мкм и их идентификации. Имеются резервы дальнейшего повышения разрешения и снижения аберраций в системе.
2.2. Сенсоры на основе радиочастотного
электромагнитного излучения
2.2.1. Импедиметрический сенсор
Импедиметрические сенсоры (ИДС) близки по конструктивной реализации к более известным электрохимическим сенсорам. ИДС получили распространение в последние годы и применяются в анализе биологических жидкостей, тканей и клеток [12].
Импедиметрия — очень перспективный метод для микробиологических исследований [13]. ИДС по сравнению с другими сенсорными системами обладают целым рядом преимуществ: безопасность, низкая стоимость, быстрота анализа и возможность исключения влияния на исследуемый образец сто-
№ 5(41)/2015~|
биотехносфера
а)
б)
Рис. 8 \ Миниатюрный видеосенор: а — общий вид; б — микроколонии S. aureus; увеличение х650
ронних веществ и красителеи, а также простота миниатюризации — все это способствует развитию интеграции таких сенсоров в ЛНЧ.
Импедиметрический анализ хорошо подходит для исследования биологических тканей, клеток, бактерий, вирусов, биологических макромолекул и других микробиологических объектов, для которых характерно наличие двойного электрического слоя (рис. 9).
Интересен ИДС, позволяющий выполнять идентификацию микробиологических объектов. Данные, получаемые с его помощью и других сенсоров, интегрируемых в ЛНЧ, будут использоваться для последующей сепарации бактерий и их перемещения в лунки в целях тестирования на антибио-тикорезистентность. Электроды разрабатываемого сенсора целесообразно расположить непосредственно после платформы для роста бактерий. Один из вариантов эскизного проектирования датчика, выполненного при помощи ЭБ-печати, представлен на рис. 10, а. Такой сенсор является важной частью ЛНЧ для экспресс-микробиологического анализа.
а)
б)
E
С5>
8-
Рис. 9
Схема деформации ДЭС (а) и вынужденной поляризации (б) под действием внешнего электрического поля
Электролитный характер цитозоля и межклеточной среды, наличие двойных электрических слоев на границах раздела клеток и клеточных органелл внешней среды определяет их чувствительность к воздействиям электрических и электромагнитных полей. Изменение параметров электролита и двойных слоев сопровождается изменением частотных зависимостей импеданса. Полное разрушение клеточных мембран может приводить к исчезновению ранее существовавшей зависимости импеданса от частоты. Поэтому измерение электропроводности может применяться для мониторинга процессов жизнедеятельности клеток и анализа антибиотикорезистентности бактерий.
Исследованы зависимости модуля импеданса |Z| от частоты f для суспензий микроорганизмов (рис. 10, б): Lactobacillus fermentum 90T-C4, Bifidobacterium bifidum 791, E. coli M-17 и Saccha-romyces serevisiae при концентрации 125 мг • мл-1. На полученных зависимостях для каждого из образцов наблюдается уменьшение модуля импеданса с ростом частоты с постепенным выходом зависимости при высоких частотах на постоянное значение модуля электрического импеданса. Можно заметить, что выход на постоянное значение модуля импеданса у лактобактерий и бифидобактерий происходит при более высоких частотах, чем у пекарских дрожжей и кишечной палочки. Сохранение общей картины частотной зависимости модуля импеданса обусловлено единством химического состава и структуры исследуемых микроорганизмов. Однако в каждом конкретном случае индивидуальные особенности исследуемых объектов обусловливают характер рассматриваемой частотной зависимости. К таким особенностям можно отнести размер и форму бактерий и их кластеров, соотношение между их объемом и межклеточным пространством, содержание в них свободных ионов и т. д.
E
Приборостроение, метрология и информационно-измерительные приборы и системы
а)
б)
\Z\, кОм 4,5'
4,03,5" 3,02,52,01,51,00,5
* ж.
А.ААЛАА.-
******—*—*-* ******
■ ш 1>Ма
* »»»«.«... 1
1 '""I 101
I ГТТТТ]-1-1 I Т I III]-1-1—I Т Г ГП]
102 103 104
t Т 1 f I IЦ-1-\ I I Т ПГ[
105 106
f, Гц
Рис. 10
Планарный импедиметрический сенсор, вид макета с открытой крышкой (а): 1 — канал для пробы; 2 — расположение электродов; зависимость модуля импеданса от частоты (б):
1 — Lactobacillus fermentum 90T-C4; 2 — Bifidobacterium bifidum 791; 3 — Saccharomyces cerevisiae; 4 — E. coli M-17
Для описания спектров импеданса биологических объектов часто применяется метод эквивалентных схем. На рис. 11 изображена пятипара-метрическая эквивалентная схема, где ^ соответствует сопротивлению межклеточной жидкости, ^2 — сопротивлению клеточной цитоплазмы, С2 — емкости конденсатора с обкладками из клеточной оболочки, а Я0 и с0 — сопротивлению и емкости приэлектродного двойного электрического слоя. Используя эту аппроксимацию (сплошная линия), можно определить параметры эквивалентной схемы замещения для их возможного применения при идентификации микробиологических объектов, сравнивая результаты экспериментальных исследований с характерными для каждого вида микроорганизмов параметрами. По результатам
и, кОм 4,5
аппроксимации можно сделать вывод, что она позволяет точно описать ход экспериментальных зависимостей.
Помимо метода эквивалентных схем, полученные экспериментальные данные можно аппроксимировать с помощью эмпирической зависимости, например имеющей следующий вид:
Z =
A
ln( А3Ш)
A
2
(1)
где А1, А2 — эффективные параметры, кОм; А3 — эффективный параметр, с.
Функция (1) также содержит три параметра, которые в отличие от аппроксимации методом эквивалентных схем не несут информации об электрических свойствах объекта, но, тем не менее,
Рис. 11
1Н| I I чшц
104 105
Т
106 f, Гц
Экспериментальная зависимость модуля импеданса от частоты электромагнитного поля для Басскаготусеэ сегеи1э1ае и их аппроксимация (точки — экспериментальные данные, сплошная кривая — метод эквивалентных схем, штрихпунктирная кривая — эмпирический метод). Пятипараметрическая эквивалентная схема замещения биологических объектов
3
4
б) 350
300
250
2 200
3
150 100
50
/А 2
23
Ч / X
1 1 / \\
/V . /
0
2000
4000
6000 f, Гц
Рис. 12
Акустический сенсор (а) и схема установки для измерения акустических спектров микробиологических проб (б); акустические спектры:
1 — вода; 2 — суспензия грамположительных бактерий Lactobacillus spp.; 3 — суспензия грамотрицательных бактерий E. coli.
хорошо описывают ход зависимости модуля импеданса (штрихпунктирная кривая на рис. 11). Ее преимуществами являются меньшее число параметров и, следовательно, их большая точность и устойчивость. С другой стороны, пятипараметриче-ская эквивалентная схема лучше описывает выход на плато зависимости \Z(f)\ при высоких частотах. В зависимости от задачи и свойств объекта могут быть использованы одна или обе из вышеописанных аппроксимаций.
2.2.2. Акустический сенсор
В микробиологии для систематики бактерий и диагностики инфекционных заболеваний используют метод дифференциации по Граму, основанный на различии биохимических свойств клеточной стенки. Так, грамположительные (G+) бактерии в отличие от грамотрицательных (G—) содержат клеточную стенку из пептидогликана, выполняющую в числе других функций и механическую, что предполагает повышенную жексткость стенки таких бактерий. Поэтому для дифференциации может оказаться интересным акустический метод, позволяющий различать жесткость пленок. С помощью макета акустического сенсора (рис. 12, а) исследованы суспензии микроорганизмов Lactobacillus spp. (G+) и E. coli (G-). На рис. 12, б показаны акустические спектры воды (1) и двух видов бактерий (2, 3). Из графиков видно, что наряду с аппаратными полосами, характерными для всех проб, имеются суще-ственые различия спектров бактерий G+ (2) и G— (3).
2.2.3. Емкостной сенсор
Другим вариантом импедиметрии является измерение резонансной частоты датчика, выполненного в виде конденсатора. При изменении среды
между обкладками конденсатора изменяются резонансная частота и ход амплитудно-частотной характеристики в целом.
Для измерения резонансной частоты в электромагнитном датчике в присутствии биологических объектов создан измерительный макет, состоящий из резистора, конденсатора и индуктивности, которые соединены последовательно. Номиналы резистора и индуктивности равны соответственно 330 Ом и 270 мкГн. Емкость представляет собой капилляр, на гранях которого закреплены металлические электроды. Через отверстие ввода и вывода рабочий объем полученного конденсатора заполняется исследуемым веществом.
Основой проведения измерений с помощью предложенного метода является переменный конденсатор, емкость которого меняется в зависимости от природы жидкой среды, находящейся между обкладками. В целях увеличения рабочей емкости конденсатор выполнен в виде двух каналов c размерами: 100 мкм (высота), 1 мм (ширина), 20 мм (длина). Сравнительные измерения проводили в RC- и LC-контурах. Результаты приведены в табл. 2.
В качестве объектов исследования использовали культуры Saccharomyces cerevisiae, Bifidobacterium bifidum и суспензию частиц полистирольно-го латекса диаметром 46 нм. Определены значения резонансной частоты ю0 и диэлектрической проницаемости £i исследуемых веществ: £i = (С — Cp)C0.
Таблица 2 | Параметры измерительной ячейки
Параметр RC-фильтр LC-контур
Емкость пустого конденсатора С0, Ф X 1013 1,12 1,45
Паразитная емкость Сп, Ф X 10 13 1290 8,9
I
Таблица 3 | Расчет диэлектрической проницаемости образцов для RC-фильтра
Вещество Частота w0 x 106, с-1 Расчетная емкость С x 10-10, Ф Емкость без учета паразитной (С - Cp) x 10-11, Ф Диэлектрическая проницаемость
ПС-латекс 21,8 1,39 1,01 90
Saccharomyces cerevisiae 20,1 1,5 2,11 188
Bifidobacterium bifidum 21,8 1,39 1,01 90
Результаты приведены в табл. 3. Данные расчетов показывают, что растворение в дистиллированной воде микроорганизмов увеличивает суммарную диэлектрическую проницаемость по сравнению с водой без примесей.
На рис. 13 представлены зависимости коэффициента передачи К от частоты для образцов по табл. 3, полученные при измерении с помощью последовательного ЪС-контура.
С помощью этого метода измерений, как и с помощью предыдущего, можно определить диэлектрическую проницаемость раствора. Все расчеты аналогичны выполненным выше и по тем же формулам. Исключением является связь между резонансной частотой и параметрами схемы. Результаты расчетов даны в табл. 4.
Таким образом, вычисления показали, что для повышения динамического диапазона метода необходимо проводить дальнейшую миниатюризацию и оптимизацию конструкции сенсора в целях снижения паразитной емкости. Показана селективность метода относительно видов бактерий, которая может быть использована при создании сенсора для
К 0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
т X 106, с-1
Рис. 13
Зависимость коэффициента передачи от частоты для LC-контура:
1 — полистирольный латекс; 2 — Saccharomyces cerevisiae; 3 — Bifidobacterium bifidum
идентификации микроорганизмов. В дальнейшем планируется использование электромагнитных излучателей.
2.3. Оптические сенсоры
2.3.1. Спектрофлюориметрический сенсор
Оптическая регистрация — фотометрия, флюо-риметрия, двумерная визуализация — остается основным средством регистрации аналитов. Развитие элементной базы микроэлектроники открыло возможности применения микропланшетов для биомедицинского анализа в составе компактных портативных анализаторов. Для их реализации представляет интерес флюориметрия, обладающая высоким квантовым выходом излучения [14]. Детектирование сверхмалых количеств флюорофора (10-18 моля и менее) требует оптимизации оптической схемы. Одним из приемов, позволяющих повысить интенсивность вторичного сигнала флюоресценции на один-два порядка, является повышение светосилы оптической схемы.
В спектрографах высокой точности решетку наносят на поверхность вогнутого сферического зеркала большого радиуса кривизны. Преимущество такого устройства заключается в одновременном выполнении сферическим зеркалом двух функций: фокусирования и требуемой дисперсии. В основу конструкции спектрографов с такими вогнутыми решетками положено важное геометрическое свойство, открытое Роуландом в 1882 г. В данной работе прототипируется миниатюрный модуль для спектрофлюориметрического анализа, интегрируемый в ЛНЧ, включая возможность интегрирования в одноразовый чип.
В качестве материала для изготовления лабораторного образца использовали СБ-К-диск, являющийся отражательной дифракционной решеткой с периодом 1,6 мкм, в которой дифракционные
Таблица 4 | Расчет диэлектрической проницаемости образцов для контура
Вещество Частота w0 x 106, с-1 Расчетная емкость С x 10-10, Ф Емкость без учета паразитной (С - Cp) x 10-11, Ф Диэлектрическая проницаемость
ПС-латекс 16 1,5 1,41 97
Saccharomyces cerevisiae 16,5 1,4 1,3 89
Bifidobacterium bifidum 17 1,36 1,27 87
штрихи выполнены в виде углублений, выжженных лазером в поликарбонатной основе.
Вогнутость решетки имеет важное значение для реализации принципа кругов Роуланда. При формировании вогнутости решетки следует учитывать такие параметры, как размер первичной пластины радиус кривизны, равномерность. Размер первичной пластины при неизменном радиусе кривизны влияет на угловую апертуру для отраженного вторичного излучения и, как следствие, на светосилу для фотоприемного устройства. Радиус кривизны вогнутой решетки непосредственно определяет размеры всей оптической системы (исходя из принципа кругов Роуланда). Также радиус кривизны при неизменном размере первоначальной пластины влияет на угловую апертуру для отраженного вторичного излучения и светосилу фотоприемного устройства. Равномерность вогнутости необходима для формирования равномерного отражения, ко-
торое можно рассчитать и зарегистрировать фотоприемным устройством.
Для формирования вогнутости решетки проводили термообработку. Температура вязкотекучести поликарбоната — 150-170 °С. При температурной обработке важно учитывать скорость нагрева и охлаждения. Максимальная температура — 160-165 °С. При использовании режима медленного нагрева и охлаждения дифракционные решетки сохраняют идеальную форму поверхности, близкую к сферической, у них отсутствуют дефекты, такие как складки, отсоединение слоя металлизации, искривление.
Изготовлено несколько серий зеркал, наиболее интересны зеркала диаметром 10 мм и с радиусом кривизны 30 мм. Идеальная форма сферичности наилучшим образом обеспечивается ровной формой пуансона и силой земного притяжения.
При температурной обработке дифракционная решетка в виде СБ- или БУБ-диска не теряет сво-
Рис. 14
Оптическая схема регистрации флюоресценции (а):
1 — вогнутая дифракционная решетка (ВДР); 2 — круг Роуланда; 3 — ПЗС-сенсор; 4 — шторка; 5 — источник УФ-излучения, светодиод; 6 — направление потока первичного излучения; 7 — флюоресцирующий объект; 8 — поток вторичного излучения в апретуре ВДР; 9 — спектр флюоресценции, сфокусированный на поверхности видеосенсора;
спектр флюоресценции родамина 6ж (б); оптический узел на основе схемы кругов Роуланда (в):
1 — полупроводниковый источник излучения; 2 — ВДР; 3 — спектр;
эскиз варианта оптического узла ЛНЧ со спектрофлюориметрическим элементом на основе принципа кругов Роуланда (г)
их основных свойств, так как штрихи в них выжжены и при размягчении полимера их структура не нарушается.
Исследование показало, что принцип кругов Роуланда работает на изготовленных образцах. На рис. 14 показан вид полос спектра излучения белого светодиода, полученного на зеркале с радиусом кривизны 60 мм без применения собирающей линзы. Фотоприемное устройство в данной схеме расположено на расстоянии 50 мм от дифракционной решетки.
Исследована возможность записи спектров биологических флюорофоров. Для этого использована схема, приведенная на рис. 14.
Применительно к ЛНЧ для микробиологического анализа такая схема обладает рядом существенных преимуществ:
1) наличие характерных спектров флюоресценции у микроорганизмов;
2) жесткость оптической системы, в которой ми-нимизаровано количество элементов;
3) низкая стоимость при использовании технологии СБ для формирования решетки с возможностью формования профиля вогнутого зеркала за счет термопластичности;
4) потенциал миниатюризации вплоть до интегрирования в одноразовые ЛНЧ.
Эскиз ЛНЧ с применением вогнутой дифракционной решетки показан на рис. 14. Оптические схемы этого типа могут применяться при создании одноразовых ЛНЧ.
Перспективными технологиями формирования микроэлементов для спектрофлюориметрического анализа являются полимерные технологии, включая лазерную резку и микроимпринтинг. В настоящей работе показано, что дифракционные решетки, сформированные методом лазерной резки, могут подвергаться термообработке с сохранением свойств.
На основе предложенной технологии можно рассмотреть эскизный проект оптического узла ЛНЧ с функцией спектрофлюориметрического анализа (в сенсорном режиме).
Таким образом, показана возможность применения полимерных толстопленочных технологий для создания вогнутой дифракционной решетки высокого разрешения, применяемой в миниатюрной спектрофлюориметрической системе для микробиологического анализа. Показано, что дифракционные решетки, сформированные методом лазерной абляции, сохраняют свои свойства при термообработке в условиях температуры размягчения поликарбоната. Эти решетки могут применяться в оптических схемах кругов Роуланда в интегрированном варианте в одноразовой ЛНЧ. Дешевизна материалов и простота выполнения позволят сделать такие модули частью портативных приборов для экспресс-диагностики. Оптический модуль станет одним из важнейших этапов идентификации
биообъектов в ЛНЧ, что обеспечит более достоверное медицинское заключение.
2.3.2. Ближнепольный спекл-анализ
Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам — важная проблема, определяющая правильный выбор того или иного препарата для лечения больного. В первые годы после открытия пенициллина около 99 % патогенных стафилококков были чувствительны к этому антибиотику; в 1960-е годы к пенициллину остались чувствительны уже не более 20-30 %. Рост устойчивых форм связан с тем, что в популяциях бактерий постоянно появляются устойчивые к антибиотикам мутанты, обладающие вирулентностью и получающие распространение преимущественно в тех случаях, когда чувствительные формы подавлены антибиотиком.
Для определения жизнеспособности выделенных в ЛНЧ патогенных бактерий при воздействии антибактериальных препаратов как нельзя лучше подойдет метод динамической турбидиметрии. Выступая в виде дисперсионной фазы, взвешенной в антибиотике, бактерии будут рассеивать направленное когерентное излучение. Регистрируя флуктуацию спеклов от рассеяния на бактериях и их кластерах в среде различных антибиотиков, можно судить об их жизнеспособности. Таким образом, становится возможным определять антибиотико-резистентность на чипе.
Дифракционная решетка — оптический прибор, который представляет собой совокупность большого числа параллельных, равноотстоящих друг от друга штрихов одинаковой формы, нанесенных на плоскую или вогнутую оптическую поверхность. Таким образом, дифракционная решетка — периодическая структура: штрихи с определенным и постоянным для нее профилем повторяются через строго одинаковый промежуток й, называемый периодом дифракционной решетки, в которой происходит дифракция света. К особому классу решеток можно отнести дифракционный матричный коллиматор — это оптический элемент, функцией которого является разделение падающего луча на N выходящих пучков. Каждый выходной луч сохраняет оптические характеристики входного пучка, такие как размер, поляризация и фаза. Дифракционный матричный коллиматор используется с монохроматическим светом, например лазерным излучением, и изготавливается для определенных длины волны и угла расхождения между выходящими пучками. В нашей работе наилучшие результаты получены с использованием пластины из у-анодного оксида алюминия с отверстиями диаметром 10 мкм.
Для коллоидных растворов характерно светорассеяние, отличающее их от молекулярных и ионных растворов. Лазерное когерентное излучение при взаимодействии с динамическим гетерогенным объектом, каким является суспензия бактерий, пре-
терпевает случайную модуляцию, и в плоскости наблюдения образуются световые пятна — спеклы (от англ. speckle — пятнышко), расположение, размер и форма которых меняются со временем случайным образом. Совокупность спеклов называют спекл-полем. Оно несет в себе информацию о состоянии частиц суспензии и, в частности, позволяет судить об их агглютинации уже на ранней стадии этого процесса.
В лаборатории-на-чипе спекл-оптический подход к определению жизнеспособности клеток в присутствии антибиотика можно реализовать многоканальным способом, используя интегрированный коллиматор. Для этого используют топологию модуля, как показано на рис. 15, а. Дифракционная картина прошедшего через решетку излучения представлена на рис. 15, б.
Испытания системы с коллиматором, проведенные с использованием суспензии бактерии Bifi-dobacterium bifidum (ББ), показали возможность применения многоканального детектирования
спекл-рассеяния при использовании одного лазера. Картина прошедших через кювету девяти пучков лазерного излучения показана на рис. 15, б. Вид ближнего спекл-поля показан на рис. 15, в.
Таким образом, можно заключить, что метод динамической турбидиметрии является отличным инструментом для детектирования суспензии бактерий в многоканальной системе с микроколлиматором.
3. Обработка, хранение и передача данных портативных приборов на основе ЛНЧ
Создание многофункциональных приборов, объединяющих различные элементы технологий ЛНЧ, требует вложения как значительных материальных средств, так и коллективных усилий ученых и специалистов — не только для создания сложных функциональных элементов ЛНЧ, но и для их гетерогенного интегрирования. Этим занимаются
а)
б)
в)
'6
Рис. 15
Топология узла ЛНЧ для анализа антибиотикорезистентности (АБР) (а):
1 — кювета с суспензией бактерий в антибиотике; 2 — сквозное отверстие для выхода воздуха; 3 — капилляр
с суспензией; 4 — капилляр с антибиотиком; 5 — капилляр с суспензией
патогенного микроорганизма; 6 — воронка для ввода антибиотика; 7 — воронка для ввода
патогена;
коллимирующее действие оптического элемента на проходящее когерентное излучение 645 нм (б); спекл-поле после прохождения пучка когерентного излучения через кювету с образцом (в)
Приборостроение, метрология и информационно-измерительные приборы и системы
лаборатории во многих ведущих учебных заведениях мира, таких как Harvard Medical School, UCLA, University of Tokyo, Institute for Bioengeneering of Catalonia (IBEC), а также научно-исследовательские центры при различных корпорациях, в том числе Samsung, Autodesk, STM. Например, в компании Samsung разработан прибор для полного иммунологического и биохимического анализа крови. Принцип работы устройства основан на использовании CD-диска диаметром 12 см, который помещается в портативный ридер размерами 25 х 35 х 25 см. Процессы пробоподготовки (отделение плазмы, инкубация, смешивание), измерений, промывки и регистрации полностью автоматизированы. До настоящего времени неизвестны портативные приборы для экспресс-микробиологического анализа, за исключением миниатюрного настольного прибора InCheck, разработанного фирмой STM, в котором
применен метод ПЦР-анализа на чипе для выявления генов устойчивости ограниченного ряда патогенов. Все это указывает не только на сложность поставленнной задачи, но и на перспективность создания приоритетных отечественных конкурентоспособных разработок.
Одним из ключевых модулей такой системы является система идентификации объектов для их изолирования, подразумевающая использование датчиков и экспертной системы.
3.1. Распознавание образов
Важнейшим параметром функционирования системы является надежность идентификации микроколоний бактерий до вида. Для реализации этой функции выбраны методы регистрации микроколоний, основным из которых считается видео-
Таблица 5 | Фотографии микроколоний при различных стадиях роста"
Микроорганизм
Время роста, ч
4
E. coli
K. pneumoniae
S. aureus
ШШ
■KS&ä
C. albicans
/'•vJL-H
(эт&хэ
5
3
№ 5(41)/2015~|
биотехносфера
регистрация как наиболее информативная [16, 17]. В табл. 5 представлены изображения, полученные с помощью оптического микроскопа при увеличении х630 на специально изготовленных подложках на стекле, покрытом слоем высокопитательного прозрачного агара толщиной 1 мм. Культуры микроорганизмов высевали путем растекания капли суспензии заданной концентрации. В табл. 5 представлены фотографии микроколоний бактерий четырех видов (Escherichia coli, Klebsiella pneunoniae, Candida albicans, Staphylococcus aureus) через 3, 4 и 5 ч роста.
На фотографиях, представленных в табл. 5, видно, что микроколонии имеют характерные признаки, присущие видам. Но эти признаки не ярко выражены, поэтому для их учета требуется использование компьютерных методов идентификации путем применения всевозможных алгоритмов распознавания образов.
В настоящее время не существует единого эффективного алгоритма распознавания образов, так как данная задача всякий раз уникальна в каждой области применения. Обработка и распознавание бактерий, образующих колонии, более сложная задача, чем распознавание отдельных бактерий. Дело в том, что для различных бактерий формы колоний обычно похожи. Они растут, образуя более или менее правильный круг. Однако внутренняя структура и структура границы колоний имеют свои особенности. Также обычно различаются и их цвета.
Для цели распознавания и идентификации микроколоний бактерий можно рассмотреть три раз-
личных способа. Первый — это контурный анализ, который хорош в теории, но на практике мало эффективен из-за шумов и схожести контуров большинства колоний. Второй способ — гистограмма направленных градиентов (Histogram of Oriented Gradient — HOG). Эта техника основана на подсчете количества направлений градиента в локальных областях изображения. Она эффективно применяется для идентификации людей. Схожесть объектов определяется специальным классификатором. Попытка применения метода для идентификации колоний не дала хороших результатов. Не удалось однозначно дискриминировать виды колоний, так как единичные бактерии и их кластеры оказались похожими.
Поэтому применен третий подход, включающий следующие стадии:
1) запись исходного изображения;
2) поиск и выделение колонии;
3) упрощение изображения, переход к локальным градиентам серого;
4) обработка пороговым фильтром шума;
5) Фурье-преобразование локальных градиентов серого;
6) создание классификатора путем обучения экспертной системы с помощью сравнения с эталонами.
На рис. 16 и 17 показаны результаты обработки этим методом изображений микроколоний бактерий E. Coli и Moraxella catarrhalis при времени роста 3,5 ч.
Из рис. 16 и 17 видно, что разработанный метод имеет хорошие перспективы применения в микро-
а)
в)
б)
Figure 1
Spectrum
Magnitude Spectrum
fr О о + ©
х 109.266 у-3.82661
Рис. 16
Идентификация микроколонии E. сбИ, время роста 3,5 ч: а — монохромное изображение микроколонии; б — сформированное контурное изображение микроколонии и составляющих ее бактерий; в — спектры поля векторов градиента интенсивности
fr о о +
Рис. 17 \ Идентификация микроколонии Moraxella catarrhalis: а, б, в — как на рис. 16
биологической ЛНЧ. Исследования показали, что его использование позволяет осуществлять и более тонкую дискриминацию микроколоний — до вида микроорганизма. Например, удается различать виды Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, а также и другие виды стафилококка.
3.2. Связь и обмен информацией
в формате телемедицинской системы
Для эффективного функционирования портативных медицинских приборов (в частности, микробиологической ЛНЧ) необходимы модули получения, обработки и агрегации обезличенных данных, а также системы, обеспечивающие хранение данных и доступ медицинских работников к данным для определения диагноза, оповещения пациента, консультации и т. п. В этих целях разрабатывается программно-аппаратный комплекс для мониторинга, управления и автоматизации мобильных медицинских приборов.
В основе создания модуля беспроводной связи могут лежать технологические стандарты 802.11b и 802.11g, принципы организации облачных сервисов. Протоколом передачи данных служит стандартный протокол TCP/IP.
Разработан следующий алгоритм работы программы для микропроцессорного блока прибора:
1) загрузка и инициализация беспроводных интерфейсов, проверка подключения периферии;
2) подключение к CMOS-сенсору и захват кадра (видеоряда);
3) подключение к сенсорам;
4) обработка полученных данных, запись на внутреннюю карту памяти;
5) обработка и вывод на экран полученной информации;
6) подключение к серверу БД и передача результатов анализа на сервер БД;
7) получение ответа от сервера;
8) вывод данных на экран для пользователя. Создан алгоритм работы серверного программного обеспечения для сети биомедицинского контроля, содержащий функциональные модули:
• инициализация подключенной базы данных;
• ожидание подключения клиентов, синхронизация БД;
• отправка уведомления на ПК врача или специалиста по расшифровке результатов анализа;
• получение ответа от ПК врача и отправка ответа на микропроцессорный блок прибора.
Ниже приведен пример формата данных, передаваемых с анализатора:
Уникальный ГО пробы..............20131022165
Дата и время........................2013-10-22 10-01
СРВ-координаты.......... 55.399391,38.155518
ГО оператора........................1023
ФИО пациента........... Иванов Иван Иванович
Результат анализа......... Обнаружена инфекция
ххх, вероятность 99 %. Обнаружена инфекция ууу, вероятность 99 %. Прочие инфекции не обнаружены
Рекомендуемый метод
лечения по инфекции ххх...... Антибиотики А, Б, В.
Нечувствителен к Г, Д, Е
С помощью такой диагностической системы можно будет получить оперативные предварительные данные о диагнозе, определить адрес учреждения для госпитализации, подготовить место в стационаре. На данном этапе разработаны модули системы, не зависящие от иностранной элементной базы. Структурная схема захвата, обработки, хранения и передачи данных содержит следующие компоненты: CMOS-сенсор, 3,2 млн пикс — для захвата изображений, Qualcomm MSM7225A, 800 МГц — для получения и обработки данных сенсора, работы с памятью, обмена данными с модемом и GPS-приемником, GPRS, EDGE, HSDPA-модем — для передачи данных через сотовые сети, GSM 900/1800/1900 антенна, карта памяти microSD 2 GB — для локального хранения всех полученных данных, GPS-модуль — для получения данных о местоположении.
Заключение
Разработка мобильных диагностических приборов на основе технологий ЛНЧ является одним из перспективных мультидисциплинарных направлений развития науки и техники, которое коренным образом изменит область здравоохранения. Современный технологический уровень позволяет развивать методы гетерогенного интегрирования функциональных компонентов ЛНЧ и создавать автоматизированные платформы нового поколения.
Литература
1. Manz A., Graber N., Widmer H. M. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing // Sensors and Actuators B1. 1990. P. 244-248.
2. Зимина Т. М. Лаборатории на чипе для телемедицины // Биотехносфера. 2012. № 1 (19). С. 29-40.
3. Зимина Т. М., Лучинин В. В. «Лаборатория на чипе». Микробиологическая экспресс-диагностика па-
тогенных бактерий // Наноиндустрия. 2013. № 7 (45). С. 38-44.
4. Зимина Т. М., Лучинин В. В. Микросистемы для экспресс-анализа // Журн. аналитической химии. 2011. Т. 66, № 12. С. 1252-1275.
5. URL: https://www.fluidigm.com/documents
6. Элементы микрогидравлической логики в лабораториях на чипе / Ю. А. Гвоздев, Р. А. Хафизов, Ш. М. Гаммадов, Д. Е. Каблуков [и др.] // Биотехносфера. 2013. № 6.
7. Blow N. Microfluidics: the great divide // Nature methods. 2009. Vol. 6. N 9. P. 683.
8. Multiplexed extraction and quantitative analysis of pharmaceuticals from DBS samples using digital mi-crofluidics / N. M. Lafreniere, S. C. C. Shih, P. Abu-Rabie [et al.] // Bioanalysis. 2014. Vol. 6 (3). P. 307-318.
9. Picoliter DNA se-quencing chemistry on an electrowetting-based digital microfluidic platform / Erin R. Ferguson Welch, Yan-You Lin, Andrew Madison, Richard B. Fair // Biotechnol. Jurn. 2011. Vol. 6. P. 165-176.
10. Tran B. Q., Marmottant P., Thibault P. Fast acoustic tweezers for the two-dimensional manipulation of individual particles in microfluidic channels // Applied Physics Letters. 2012. Vol. 101. P. 112-120.
11. Acoustofluidics and Whole-Blood Manipulation in Surface Acoustic Wave Counterflow Devices / M. Travagliati, R. J. Shilton, M. Pagliazzi [et al.] // Anal. Chem. 2014. Vol. 86 (21). P. 10633-10638.
12. Zihni Onur Uygun, Hilmiye Deniz Ertugrul Uygun. A short footnote: Circuit design for faradaic impedimetric sensors and biosensors // Sensors and Actuators B: Chemical. 2014. Vol. 202. P. 448-453.
13. Kowalik J. Tarczynska A., Ziajka S. Application of impedimetry for microbiological risk assessment in food / Food and Agriculture Organization of United Nations. URL: http://agris. fao.org/agris-search/search.do?recordID=PL2005000843.
14. Highly sensitive fluorescence detection system for microfluidic lab-on-a-chip / G. Ryu, J. Huang, O. Hofmann [at al.] // Lab on a Chip—Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (9). P. 1664-1670.
15. Comaniciu D. An algorithm for data-driven bandwidth selection // IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 2003. Vol. 25 (2). P. 281-288.
16. Sun J., Rehg J. M., Bobick A. Automatic cascade training with perturbation bias. In Pro-ceedings of the Conference on Computer Vision and Pattern Recognition, Washington, DC, USA. 2004. P. 276-283.
