CC BY
264
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО ЭКСТРАКТА СЕМЯН КОНСКОГО КАШТАНА ОБЫКНОВЕННОГО (AESCULUS HIPPOCASTANUML.) И ЕГО СТАНДАРТИЗАЦИЯ
О.Г. Жарова, Т.Б. Шемерянкина, А.А. Савина, Т.А. Сокольская
Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) ул. Грина, 7, Москва, Россия, 117216
Основными биологически активными веществами семян конского каштана обыкновенного (Aesculus hippocastanum L.) являются тритерпеновые гликозиды — эсцин, обладающие выраженной противовоспалительной активностью. В настоящее время экстракт семян успешно применяется при лечении хронической венозной недостаточности. Разработан способ получения сухого экстракта семян конского каштана обыкновенного. Порошок семян (степень измельчения 3 мм) 3 раза экстрагируют 70% этанолом (по объему) с обратным холодильником на водяной бане по 2 часа, затем извлечения объединяют и фильтруют. После отгонки под вакуумом (при 50 °C) проводят жидко-фазную экстракцию с этилацетатом (соотношение фаз вода — этилацетат, 1 : 2). Затем делят в делительной воронке, и водую фракцию отгоняют до сухого остатка (при 50 °C). Количественный анализ проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Таким образом, разработан способ получения сухого экстракта семян конского каштана обыкновенного (не менее 15% эсцина).
Ключевые слова: семена, конский каштан, экстракт, ВЭЖХ.
Эпидемиологические, патогенетические и патофизиологические исследования последних лет свидетельствуют, что хроническая венозная недостаточность (ХВН) — серьезное, широко распространенное заболевание, в значительной степени обусловленное наследственной предрасположенностью, провоцируемое и усиливающееся при воздействии многих внешних и внутренних факторов. Лекарственное лечение ХВН до недавнего времени сводилось к применению единичных, главным образом симптоматических средств (диклофенак, индометацин, гепатромбин, пентоксифиллин, сулодексид и др.) [2, 5]. Их использование и применение других методов консервативного лечения ХВН не оказало существенного влияния на показатели распространения заболевания.
Все более широкое применение для лечения ХВН находят препараты на основе биологически активных соединений (БАС) растительного происхождения. Подавляющее большинство из них содержит в качестве действующего начала тритерпеновые гликозиды (эскузан, анавенол, венитан, эссавен-гель, веноплант и др.) и флавоноиды (аскорутин, детралекс, флебодиа и др.). Важной особенностью фитопрепаратов является сочетание достоверной терапевтической эффективности, хорошей переносимости и системного влияния на патогенез заболевания [3].
Фармакологически показана целесообразность использования стандартизованных по содержанию тритерпеновых гликозидов (известных под названием эс-цин) препаратов на основе семян конского каштана обыкновенного (ККО) и комбинированных препаратов ККО в качестве базового метода лечения ХВН на всех стадиях ее развития. Они могут использоваться как альтернатива компрессионной терапии — общепризнанного основного метода консервативного лечения ХВН, и как средства, существенно усиливающие терапевтический эффект компрессионной терапии [6]. Препараты семян ККО могут использоваться не только в флебо-логической практике, но и в широкой общетерапевтической практике с целью профилактики развития тяжелых форм ХВН.
При разработке препаратов растительного происхождения для лечения ХВН в настоящее время наблюдаются 3 основные тенденции: получение как можно более высоко очищенных субстанций; создание комбинированных лекарственных средств (ЛС), содержащих вещества с разнонаправленной фармакологической активностью; создание сборов лекарственных растений, содержащих разнообразный комплекс БАС в их натуральном виде (не подвергнутых химической модификации) [3]. Целесообразны, по-видимому, все три направления. Первое обеспечивает стабильность и воспроизводимость получаемого терапевтического эффекта, второе и третье — возможность усиления эффекта за счет влияния на разные патофизиологические механизмы заболевания. Наибольшими возможностями для терапии ХВН, по нашему мнению, обладают комбинированные ЛС. Так, добавление к эсцину флавоноидного комплекса из ККО (1 : 10) в 5 раз увеличивает его активность [7]. Сочетание научно обоснованных процессов экстракции, концентрирования и сушки, осуществляемых на оборудовании, специально подобранным для работы с лекарственными растениями, позволяет сохранить в сухих экстрактах весь комплекс БАС. Сухие экстракты являются одним из наиболее рациональных способов переработки ЛРС, обеспечивающих максимальное извлечение действующих веществ и возможность создания стандартизованного фитопрепарата [4]. Однако в настоящее время на фармацевтическом рынке РФ более 90% — это препараты импортного производства [1].
В связи с этим актуальным представляется разработка технологии получения сухого экстракта на основе семян ККО как субстанции для создания готовых лекарственных форм (в том числе комбинированных) с венотонизирующей активностью. Объектом исследования служили несколько опытных партий семян ККО, заготовленных в Ботаническом саду ВИЛАР, с содержанием эсцина не менее 4%.
Технологическая схема получения сухого экстракта ККО предусматривает стадии твердофазной экстракции, концентрирования полученного извлечения, очистки жидкофазной экстракцией с этилацетатом и сушки концентрированного экстракта. Количественное определение содержания эсцина на всех технологических стадиях проводили методом ВЭЖХ на приборе «Agilent 1100 series» (США) с УФ-спектрофотометрическим детектором на диодной матрице (СДДМ) с последующей компьютерной системой для сбора и обработки хроматографических данных ChemStation for LC3D, Rev. A. 09.03 [1417], Agilent. В качестве неподвижной фазы использовали хроматографические колонки Waters Symmetry C18
250 х 4,6 мм, США. В качестве подвижной фазы — систему растворителей: буферный раствор о-фосфорной кислоты (рН = 2,5): ацетонитрил в условиях градиентного элюирования. Для спектрофотометрического анализа исследуемых соединений использовали спектрофотометр фирмы GBC UV-visible Cintra 6 Spectrophotometer (Австралия) с диапазоном длин волн от 190 нм до 1100 нм. Детектирование проводили с помощью УФ-детектора при длине волны 210 нм.
Установлены оптимальные условия экстракции семян ККО. Для этого нами изучено влияние экстрагента, степени измельченности семян, температурного режима, соотношения сырье-экстрагент, времени и кратности экстракции на выход БАС.
При подборе экстрагента учитывали возможность получения максимального количества эсцина, проводя однократную экстракцию. Выход его возрастает с увеличением концентрации спирта этилового: 50% спиртовое извлечение содержит 2,56% эсцина от содержания в сырье, 60% — 3,21%, 70% — 3,53%, 80% — 3,50% соответственно. Из полученных данных следует, что лучшим экстрагентом является 70% этиловый спирт.
Изучение влияния степени измельченности семян на процесс экстракции три-терпеновых сапонинов (эсцина) показало, что с уменьшением размера частиц в растворе быстрее устанавливается равновесная концентрация, а также увеличивается выход эсцина и суммы экстрактивных веществ. Однако мелко измельченное сырье неприемлемо для экстракции в больших объемах из-за его запрессовы-вания и замедления тока экстрагента. Кроме этого, уменьшение размера частиц приводит к затруднению процесса фильтрования, получению мутных извлечений, а чрезмерное увеличение размера частиц — к снижению выхода БАВ. На основании полученных экспериментальных данных определено, что оптимальной степенью измельчения сырья является 3 мм.
Повышение температуры положительно влияет на эффективность процесса экстракции, увеличивая выход экстрактивных веществ и эсцина. Экстракцию семян предложили проводить при температуре (60 ± 5) °С (содержание экстрактивных веществ 31,95% с выходом эсцина от содержания в сырье 3,52%). Данный температурный режим обеспечивает высокий выход экстрактивных и БАС при минимальных затратах электроэнергии. При температуре выше 60 °С содержание эсцина повышается не существенно (до 3,56%), кроме того, увеличивается содержание сопутствующих веществ (сахаров, крахмала, белков и др.), соответственно повышается выход до 33,3% экстрактивных веществ, что приводит к ухуд-ению качества экстракта.
При однократном экстрагировании подобрали оптимальное соотношение фаз, соответствующее 1 : 5 (сырье — экстрагент). Увеличение объема экстрагента неоправданно, ввиду незначительного повышения выхода БАВ, а также приводит к повышению затрат на производство и, соответственно, себестоимости лекарственной субстанции.
С целью определения продолжительности и кратности экстракции установили время достижения равновесной концентрации в системе сырье-экстрагент. Для
этого к навескам по 5 г измельченного сырья (3 мм) прибавляли 70% спирт в соотношении 1 : 5 и настаивали в течение 1 ч, затем нагревали на водяной бане при температуре (60 ± 5) °С с обратным холодильником в течение 30 мин., 1 ч, 1,5 ч, 2 ч, 2,5 ч. По истечении времени извлечения охлаждали до комнатной температуры, фильтровали и определяли содержание суммы экстрактивных веществ и эсцина. Экстракцию повторяли трижды, заливая сырье новой порцией экстра-гента в количестве, равном слитому излечению. Полученные данные приведены в табл. 1.
Таблица 1
Выход экстрактивных веществ и эсцина в семенах конского каштана обыкновенного
Время экстракции Выход экстрактивных веществ, % Выход эсцина от содержания в сырье,%
I II III I II III
30 мин. 18,48 7,12 1,99 1,68 0,14 0,01
1 час 19,18 7,37 2,87 1,89 0,21 0,06
1,5 часа 20,67 7,95 3,10 2,54 0,44 0,13
2 часа 20,89 8,03 3,11 3,52 0,84 0,16
2,5 часа 20,94 8,04 3,17 3,53 0,88 0,18
3 часа 20,95 8,05 3,18 3,52 0,85 0,17
Представленные результаты свидетельствуют о том, что равновесное состояние при первом, втором, третьем контакте фаз достигается через 2 часа. При этом при первом контакте в извлечение переходит 60—65% экстрактивных веществ и эсцина, при втором — 20—25% и 8—10% при третьем. Таким образом, трехкратная экстракция обеспечивает истощение сырья в среднем на 85—95%.
С целью ускорения экстракционного процесса экстракцию сырья следует вести при постоянном перемешивании, так как при этом происходит обновление поверхности контактирующих фаз, что приводит к увеличению движущей силы процесса. При отгонке полученного извлечения целесообразно добавление небольшого количества бутанола, насыщенного водой, для увеличения поверхностного натяжения и снижения пенообразования, которое возникает из-за высокого содержания в нем сапонинов.
Семена ККО содержат 5—8% жирных масел, поэтому необходимо провести жидкофазную экстракцию этилацетатом, который был выбран вследствие плохой растворимости эсцина и хорошей растворимости липофильных соединений семян и многих соединений фенольного ряда, что улучшает очистку и качество получаемого экстракта. Жидкофазную экстракцию этилацетатом проводили два раза, при соотношении объемов водной и органической фаз 1 : 2, что обеспечивало наиболее полное освобождение извлечения от липофильных и сопутствующих феноль-ных и полифенольных веществ. При этом потери эсцина были незначительны (0,1% от содержания в семенах).
Итак, оптимальным является проведение трехкратной экстракции с обратным холодильником по 2 ч (после настаивания в течение 1 ч) сырья со степенью
измельчения 3 мм в соотношении 1 : 5 при использовании в качестве экстра-гента 70% этилового спирта и нагревании до 60 °С. Затем отгонка полученного извлечения с бутанолом и двухкратная жидкофазная экстракция этилацетатом в соотношении объемов водной и органической фаз 1 : 2. Все подобранные оптимальные параметры процесса экстракции были положены в основу проведения серии балансовых загрузок в лабораторных условиях.
На основании проведенных лабораторных загрузок оформлен и утвержден лабораторный регламент на производство ККО экстракта сухого, который представляет собой растворимый в 70% спирте комплекс БАС из семян ККО. Готовый продукт — аморфный гигроскопичный порошок желто-коричневого цвета со специфическим запахом. Насыпная масса при свободном падении — 0,66 г/см3, насыпная масса при уплотнении — 0,83 г/см3. Сыпучесть — 6,0 г/с. Угол естественного откоса 32°.
Таким образом, разработан способ получения сухого экстракта семян конского каштана обыкновенного с содержанием эсцина не менее 15%. Данный экстракт является субстанцией для создания лекарственных препаратов с венотони-зирующей активностью.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Жарова О.Г., Куркин В.А., Петрухина И.К. Организационно-экономический анализ ан-гиопротекторных препаратов в России // Материалы VIII-ого Международного съезда Фитофарм «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». — Микелли, Финляндия, 2005. — С. 95—100.
[2] Кияшко В.А. Консервативное лечение хронической венозной недостаточности // РМЖ. — 2002. — Т. 10. — № 26.
[3] Майнсков А.В., Киселева Т.Л., Колхир В.К. и др. Лекарственные средства растительного происхождения в терапии хронической венозной недостаточности. — М.: МОКБ Марс, 1999. — 42 с.
[4] Сухие экстракты из растений — основа создания современных лекарственных форм / Глызин В.И., Лубсандоржиева П.Б., Даргаева Т.Д. и др. // Сб. тр. «Физ.-биол. аспекты изучения лек. растений». — Улан-Удэ, 1998. — С. 142—143.
[5] Cheatle T.R., Scurr J.H., Colerige Smith P.D. Drug treatment of chronic venous insufficiency and venous ulceration: a review // J. R. Soc. Med. — 1991. — V. 84. — № 6. — P. 354—358.
[6] Facino R.M., Carini M., Stefani R. et al. Anti-elastase and anti-hyaluronidase activities of saponins and sapogenins from Hedera helix, Aesculus hippocastanum and Ruscus aculeatus: Factors contributing to their efficacy in the treatment of venous insufficiency // Arch. Pharmazie (Weinheim). — 1995. — V. 328. — № 10. — P. 720—723.
[7] Siebert U., Brach M., Sroczynski G. et al. Efficacy, routine effectiveness and safety of horse chestnut seed extract in the treatment of chronic venous insufficiency. A meta-analysis of randomized controlled trials and large observational studies // Int Angiol. — 2002. — V. 21. — № 4. — P. 305—315.
Жарова О.Г. и др. Изучение липидов семян конского каштана обыкновенного...
DEVELOPMENT THE RECEIPT OF TECHNOLOGY OF EXTRACT FROM SEEDS OF HORSE-CHESTNUT (AESCULUS HIPPOCASTANUM L.)
O.G. Zharova, V.I. Sheichenko, T.A. Sokolskaya
All-Russian Institute of Medical and Aromatic Plants Grina str., 7, Moscow, Russia, 117216
V.V. Vandishev
Department of botany, physiology, pathology of plants and agrobiotechnology
Pharmaceutical faculty Peoples' Friendship University of Russia
M-Maklaya str., 8, Moscow, Russia, 117198
The plants of Aesculus genus (Family Hippocastanaceae) have attracted much interests of phyto-chemists for many years due to the discovery of triterpene glycosides — escin with extraordinary antiinflammatory activity from horse-chestnut (Aesculus hippocastanum L.) seeds and the successful applications of its seeds extract for treatment of peripheral chronic venous insufficiency now. The powdered seeds (with reduction range 3 mm) were extracted three times with 70% (v/v) aqueous EtOH under reflux for 2 h at 60 °C with a water bath and the extracts were combined, filtered. After removal of the solvent in vacuum using a rotary evaporator at 50 °C, the extract was further partitioned between H2O and EtOAc (1 : 2, v/v) to give H2O-soluble and EtOAc-soluble fractions. The H2O-soluble fraction was evaporated to dry-ness using a rotary evaporator at 50 °C. High-performance liquid chromatography (HPLC) method has been developed for the quantitative determination of escin. Thus, it was developed the receipt of technology of dry extract from seeds of horse-chestnut (not less 15% of escin).
Keywords: seed, horse-chestnut, Aesculus, extract, High-performance liquid chromatography (HPLC).
ИЗУЧЕНИЕ ЛИПИДОВ СЕМЯН КОНСКОГО КАШТАНА ОБЫКНОВЕННОГО (AESCULUS HIPPOCASTANUM L.)
О.Г. Жарова, В.И. Шейченко, Т.А. Сокольская
Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) ул. Грина, 7, Москва, Россия, 117216
В.В. Вандышев
Кафедра ботаники, физиологии, патологии растений и агробиотехнологии Фармацевтический факультет Российский университет дружбы народов ул. Миклухо-Маклая, 8, Москва, Россия, 117198
Проведены исследования содержания и состава жирного масла и липофильной фракции семян конского каштана обыкновенного, произрастающего в условиях Подмосковья, методами газо-
