Разработка технологии использования биопрепарата для ремедиации почв, загрязненных пестицидом прометрин, в лабораторных и полевых условиях

Ксенофонтова Ольга Юрьевна; Третьякова Светлана Эдуардовна; Тихомирова Елена Ивановна; Васнецова Елена Владимировна

УДК 579.22; 57.033

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ РЕМЕДИАЦИИ ПОЧВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПЕСТИЦИДОМ ПРОМЕТРИН, В ЛАБОРАТОРНЫХ И ПОЛЕВЫХ УСЛОВИЯХ

1 Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского 2 Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А.

Статья поступила в редакцию 14.11.2016

Изучен процесс деструкции пестицида прометрина штаммом Pseudomonas putida П2 в лабораторных и полевых условиях в экспериментально загрязненной почве. Проведена химико-аналитическая и токсикологическая оценка эффективности ремедиации почвы при использовании агротехнических приемов и внесении штамма-деструктора. Показано, что при внесении в загрязненную почву биодеструктора степень деградации пестицида в течение 30 суток возрастает до 70%. Использование только технологии активизации почвенной микрофлоры агротехническими приемами приводит к деструкции 13,5% прометрина. Применение технологических агроприемов в сочетании с внесением штамма-биодеструктора в почву оказывает значительное влияние на активность и скорость процессов биоремедиации.

Ключевые слова: биоремедиация, микроорганизмы деструкторы, пестицид прометрин, Pseudomonas putida, биопрепарат

Одной из актуальных задач современной биотехнологии является создание биопрепаратов на основе штаммов-деструкторов, выделенных из аборигенной микрофлоры, для решения комплекса задач, связанных с реабилитацией почв, загрязненных ксенобиотиками. Особенно сильному разрушающему влиянию подвергаются почвы вследствие интенсивного применения пестицидов с нарушением норм и правил их использования, что приводит к их значительному накоплению в почвах. Также особую опасность представляют полигоны захоронения неиспользованных или запрещенных химикатов. Естественные процессы самоочищения почв не способны справиться с такими объемами загрязнений [1, 2].

Известно, что плодородие и самоочищение почв напрямую зависят от активности микробиологических процессов, однако в результате высокой интоксикации почвы автохтонная микрофлора ингибируется [3]. Поэтому разработка комплексных технологий, направленных на восстановление основных функций почв и повышение их плодородия представляет значительный научный интерес, как для теоретической, так и для прикладной микробиологии. В настоящее время для решения проблем очистки загрязненных почв в качестве приоритетных рассматриваются методы биологической ремедиации [4-

Ксенофонтова Ольга Юрьевна, кандидат биологических наук, доцент. Е-mail: ksenofontova64@mail.ru Третьякова Светлана Эдуардовна, кандидат биологических наук, заведующая биотехнологическим отделом. Е-mail: treste1@mail.ru

Тихомирова Елена Ивановна, доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой экологии. Email: tichomirova_ei@mail. т Васнецова Елена Владимировна, аспирантка

6]. Биодеструкция считается наиболее перспективным направлением в технологиях рекультивации почвенных систем, зараженных органическими поллютантами, в том числе и пестицидами. На настоящий момент выделено и депонировано большое количество штаммов пестицид-деструкторов, как в виде монокультур, так и в консорциумах [7-9], однако практическое их применение в целях биоремедиации почв возможно только после изготовления из них биопрепаратов и разработки технологии применения.

Цель исследования: разработка технологии использования биопрепарата для ремедиа-ции почв, загрязненных пестицидом прометри-ном, в лабораторных и полевых условиях на примере чернозема южного.

Материалы и методы.

Объекты исследования: прометрин [N2,N4 -ди-изопропил-6-метилтио-1,3,5-триа-зин-2,4-диамин] - высокоэффективный гербицид с однолетними двудольными и злаковыми сорняками. «Гезагард» - препаративная форма пестицида с действующим веществом промет-рин. Штамм бактерий, выделенный из почвы, экспериментально загрязненной пестицидом прометрин, Pseudomonas putida П2, депонированный в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН в качестве прометрин-деструктора (свидетельство о депонировании №12310/02-1-4-940 от 28.03.2013). Биопрепарат на основе данного штамма [10]. Почва - чернозем южный, среднесуглинистый, мощность 0,8 м, содержание гумуса по ГОСТ 26213 - 2,8%, содержание общего азота по ГОСТ 26107 - 0,15%, содержание аммонийного азота -1,3 мг/кг, содержание нитратного азота -89,1 мг/кг, объемная масса почвы - 1,43 см3, общая

пористость почвы- 46%, соотношение C:N - 9,1, кислотность водного раствора почвы 7,79, емкость катионного обмена по ГОСТ 17.4.4.01 -30,0, насыщенность основаниями - 90%, содержание подвижного фосфора по ГОСТ 26205 - 407 мг/кг, подвижного калия - 407 мг/кг, сумма анионов и катионов - 0,079%.

Методы исследования. Индикацию штамма-деструктора в составе общей микро-биоты почвы проводили на твердой среде М9 (состав среды, г/л: Na2HPO4^2O - 6,0; KH2PO4 -3,0; NaCl - 0,5; NH4Cl - 1,0, вода дистиллированная - до 1000 мл; рН среды до стерилизации -6,8-7,0) с добавлением в нее пестицида в качестве источника углерода 0,01% 2,3,5-трифенил-тетразолия хлорида (ТТХ) в качестве индикатора дегидрогеназной активности бактерий [11]. Выращивание биомассы прометрин-деструктора Pseudomonas putida П2 проводили методом глубинного культивирования в лабораторном ферментере в модифицированной среде КГКДЭ (состав среды, г/л: кислотный гидролизат казеина (КГК) (производство HighMedia, Индия) - 10; дрожжевой экстракт (ДЭ) (производство HighMedia, Индия) -5; глюкоза - 25; (NH4)2SO4 - 4,0; MgSO4^7H2O - 0,3; K2HPO4 - 2,0; пеногаситель «Пента-474» (производство ООО «Пента-91») -0,3 мл, вода дистиллированная - до 1000 мл, рН -6,8-7,0. Процесс ферментации проводили в 3 цикла в лабораторном ферментере с общим объемом 1 л. Рабочий объем среды составлял 600 мл (60% от общего объема). Параметры культивирования подбирались экспериментально.

Определение концентрации бактериальных клеток в культуральной жидкости проводили на спектрофотометре СФ-102 (НПО «ИНТЕРФОТО-ФИЗИКА») при постоянных параметрах: длина волны Х=630 нм, длина кюветы /=10 мм (ОП630). Количество клеток определяли по калибровочному графику, выражающему зависимость оптической плотности ОП630 культуральной жидкости от количества клеток, определенного по стандарту мутности БАК-10 (производство ООО «ОРМЕТ»). Внесение пестицида и биопрепарата в почву: при загрязнении почвы использовали промышленный препарат «Гезагард» с действующим веществом (ДВ) прометрином, который вносили в почву с таким расчетом, чтобы конечная концентрация ДВ в почве соответствовала 100 ПДК (50 мг/кг). Концентрация и объем вносимой бактериальной суспензии был рассчитан так, чтобы конечная концентрация микроорганизмов была порядка 108 клеток на 1 г воздушно-сухой почвы, а увлажненность почвы составляла не более 60% от ПВ. В качестве жидкой фазы суспензии использовали минеральную среду М9 с 0,1% сахарозой. Отбор проб и определение концентрации пестицидов проводили на 7-е, 14-е и 30-е сутки. Определение концентрации пестицидов проводили на хромато-

масс-спектрометре Agilent Technologies (GH 7820A,MS 5975) с низкополярной колонкой HP-5MS. Условия программы и режима прибора подбирали для каждого из веществ индивидуально в соответствии с данными библиотеки спектров MS Search v.2.0. Пробоподготовку и экстракцию проводили в соответствии со стандартными методиками (РД 52.18.188-2001; РД 52.24.4112009). Токсичность почвы определяли с использованием стандартных тест-объектов Daphnia magna Straus и Ch/ore//a vu/garis Beijer в соответствии с ПНД Ф Т 14.1:2:4.12-06 (Т16.1:2:3:3.9-06, ФР.1.31.2009.066410) и ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.10-04 (16.1:2.3.7-04). Отбор образцов почв на все виды исследований проводили согласно нормативным документам (ГОСТ 2816889; ГОСТ 17.4.3.01-83; ГОСТ 17.4.4.02-84). Статистическую обработку данных проводили по общепринятым методикам с использованием программ статистического пакета Excel (MS Office 2007). Повторность всех экспериментов трехкратная.

Результаты исследований и их обсуждение. Разработка технологии использования биопрепарата на основе штамма-деструктора проводилась в 2 этапа:

1 - изучение процесса деструкции пестицида прометрина штаммом Pseudomonas putida П2 в лабораторных условиях;

2 - испытание деструктивных свойств биопрепарата на основе модельного биодеструктора на экспериментально загрязненных почвенных системах в полевых условиях.

На 2 этапе представляло интерес оценить эффективность ремедиации экспериментально загрязненной почвы в естественных климатических условиях при использовании агротехнических приемов и внесении штамма деструктора по данным химико-аналитических и токсикологических исследований.

Изучение процесса деструкции пестицида в лабораторных условиях. Для определения разрушения пестицида под действием аборигенной микрофлоры или интродуцированного биодеструктора совместно с аборигенной микрофлорой нами были проведены лабораторные исследования деградации пестицида в стерильной и нестерильной почве, а также нестерильной почве с внесение биодеструктора в течение 30 суток. Анализ полученных результатов в стерильной почве не выявил снижения концентрации пестицида. В результате применения технологии активизации аборигенной почвенной микрофлоры классическими агротехническими приемами (внесение минерально-углеводных добавок, увлажнение, рыхление) степень деструкции к 30-м суткам составила только 16%. А в почве, инокулированной биодеструктором деградация прометрина была значительно выше и составила 70% (рис. 1).

□ Исходная концентрация

□ 7-е сутки

□ 14-е сутки

□ 30-е сутки

стерильная почва

нестерильная почва +агротех. нестерильная почва+биодеструктор приемы +агротех. приемы

Рис. 1. Динамика деградации прометрина в почве в различных условиях

Внесение штамма P. putida П2 в стерильную и нестерильную почву с последующими периодическими высевами на два варианта сред (питательную МПА и элективную М9) показало его конкурентоспособность и сохранение деструктивных свойств в присутствии аборигенной микрофлоры. Концентрация интродуцирован-ного штамма P. putida П2 на протяжении 30 суток оставалась стабильно высокой.

Изучение деградации пестицида прометрина в полевых условиях. Для проведения полевого эксперимента были подготовлены 3 экспериментальных участка площадью по 20 м2, оборудованные тентованными навесами для укрытия от дождя, изолированные от прилегающей

территории и друг от друга. При помощи специально оснащенной агротехники почва была окультурена на глубину 10-12 см, на все участки был внесен агрохимикат «Гезагард» в количестве 50 мг/кг (100 ПДК) ДВ (прометрина) в почве. В соответствии с задачами эксперимента на участках оценивали эффективность технологий реме-диации земель, загрязненных «Гезагардом». Назначение участков и приемы ремедиации приведены в табл. 1. На протяжении всего эксперимента влажность полевой почвы поддерживали на уровне около 40% от ПВ. Эффективность проведенных технологических агроприемов оценивали по снижению концентрации пестицида (рис. 2) и показателям токсичности почвы.

Таблица 1. Назначение участков для проведения полевого эксперимента по оценке эффективности применяемых технологических агроприемов и внесения разработанного биопрепарата

60

50

40

30

20

10

№ уч-ка Задачи эксперимента Приемы ремедиации загрязненной почвы Внесенные компоненты

1 деструкция пестицида под воздействием естественных факторов окружающей среды. Загрязненный контроль агроприемы не проводились «Гезагард», вода водопроводная

2 деструкция пестицида в почве под воздействием естественных факторов окружающей среды с применением агротехнических приемов агротехнические приемы (полив и аэрация почвы рыхлением), стимулирование автохтонной микрофлоры «Гезагард», вода водопроводная, углеводно-минеральные добавки

3 деструкция пестицида в почве под воздействием естественных факторов окружающей среды с применением агротехнических приемов и влиянием внесенного деструктора в виде водной суспензии агротехнические приемы (полив и аэрация почвы рыхлением), стимулирование автохтонной микрофлоры, внесение суспензии деструктора «Гезагард», вода водопроводная, углеводно-минеральные добавки, водная суспензия биомассы штамма-деструктора P. putida П2 (108 кл/г почвы)

Установлено, что при внесении в загрязненную почву соответствующего биодеструктора степень деградации пестицида в течение 30 суток возрастает до 70%. Внесение биодеструктора оказалось наиболее эффективным, чем использование только технологии активизации почвен-ной микрофлоры агротехническими приемами, где степень деструкции прометрина составила 13,5% (участок № 2). На участке № 1 и концентрация

прометрина снизилась незначительно. Сразу после загрязнения почвы «Гезагардом», но до внесения биопрепаратов, с каждого участка были отобраны обобщенные образцы почв для определения исходной токсичности. Через 30 суток для определения остаточной токсичности также были отобраны обобщенные образцы почв индии-видуально с каждого участка. Токсичность экспериментальных почв, загрязненных прометрином

определяли биотестированием. Установлено острое токсическое действие вытяжек почв на биотест-объекты Daphnia magna Straus и Chlorella vulgaris Beijer сразу после загрязнения

пестицидом. В результате проведенных мероприятий по биоремедиации токсичность почвы участка № 3 значительно снизилась по сравнению с контрольным участком № 1.

14 суток 21 сутки 30 сутки

Рис. 3. Динамика изменения концентрации прометрина в почве экспериментальных участков

Выводы: при анализе химических и токсикологических показателей выявлено, что под воздействием биотических и абиотических факторов в полевых условиях, но без проведения агротехнических и биоремедиационных мероприятий, концентрация прометрина в почве практически не изменяется. Применение технологических агроприемов без проведения биоремедиации незначительно стимулирует активность аборигенной микрофлоры к деструкции пестицида. Использование технологических агроприемов в сочетании с внесением штамма-биодеструктора в почву оказало значительное влияние на активность и скорость процессов биоремедиации почвы, загрязненной прометри-ном.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Бабкина, Э.И. Полигоны захоронения пестицидов как источник загрязнения окружающей среды / Э.И. Бабкина, В.А. Сурин, Д.П. Самсонов и др. // Природные ресурсы. Использование и охрана природных ресурсов в России. - 2003. Бюл. № 1112. С. 115-122.

2. Ксенофонтова, О.Ю. «Микроорганизмы почвы и пестициды», LAP LAMBERT Academic Publishing, 2015-01-16. 136 с.

3. Терещенко, Н.Н. Эколого-биологические факторы и механизмы ремедиации антропогенно-нарушенных почв: Автореф. дис. ... д.б.н. - Томск, 2007. 42 с.

4. Савина, К.В. Изучение микроорганизмов почв с мест захоронений химикатов и анализ их способности к деструкции пестицидов различных по химическому составу / К.В. Савина, Д.А. Тихонова, Е.А. Филимонова, О.Ю. Ксенофонтова // Сборник статей V Междунар. науч.-практ. конф. «Изучение, сохранение и восстановление естественных ландшафтов» г. Волгоград, 12-16 октября 2015 г. -М.: Планета, 2015. С. 288-289.

5. Тихомирова, Е.И. Разработка методических подходов к использованию комбинированной сорб-ционно-биологической технологии ремедиации почв, загрязненных пестицидами / Е.И. Тихомирова, С.Э. Третьякова, В.В. Олискевич и др.

// В сб. мат-лов I Кавказского экологического форума. - Грозный, 2013. С. 112-114.

6. Третьякова, С.Э. Использование комбинированной сорбционно-биологической технологии для ремедиации почв, загрязненных пестицидами / С.Э. Третьякова, В.В. Олискевич, Н.М. Талаловская и др. // Актуальные проблемы экологии промышленных городов: мат-лы Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Саратов, 2013. Т.2. С. 167-171.

7. Олискевич, В.В. Оптимизация технологий биоре-медиации сельскохозяйственных земель, загрязненных гербицидом «Гезагард» / В.В. Олискевич, Н.М. Талаловская, С.Э. Третьякова и др. // Известия Саратовского университета. Серия Химия. Биология. Экология. 2013. Вып. 2. Т. 13. С. 101-107.

8. Третьякова, С.Э. Создание биопрепаратов на основе штаммов-деструкторов пестицидов прометрина и паратион-метила и испытание технологии ремедиации загрязненных почв в лабораторных и полевых условиях: Автореф. дис. ... к.б.н. - Саратов, 2013. 24 с.

9. Афанасьев, В.Н. Способ получения микробного препарата для утилизации пестицидов, способ утилизации пестицидов (варианты) и устройство для утилизации пестицидов / В.Н. Афанасьев, Н.В. Гамова, Н.Г. Гаранькина // Патент РФ №2279325, кл С12М1/10, С12М1, В09С1/10. - 2002. Гранатская, Т.А. Способ выявления микроорганизмов-деструкторов ксенобиотиков // Патент РФ № 2051961, кл C12N1/20. - 1996. Третьякова, С.Э. Создание биопрепарата на основе штамма-деструктора прометрина Pseudomonas putida П2, иммобилизованного на микрокапсулах, для ремедиации загрязненных промет-рином почв / С.Э. Третьякова, О.Ю. Ксенофонтова // Экология: синтез естественнонаучного, технического и гуманитарного знания: тезисы докл. III Всерос. науч.-практ. форума. - Саратов: СГТУ, 2012. С. 114-118.

12. Олискевич, В.В. Определение пестицид-деструкти-рующей активности бактерий с помощью индии-катора дегидрогеназной активности микроорганизмов 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида / В.В. Олискевич, С.Э. Третьякова, Н.В. Веденеева, В.В. Дмитриенко // Российский химический журнал. 2012. № 5. С. 56-61.

10.

11.

DEVELOPMENT THE TECHNOLOGY OF USING THE BIOLOGICAL PRODUCT FOR REMEDIATION THE SOILS, POLLUTED BY PROMETRIN PESTICIDE, IN LABORATORY AND FIELD CONDITIONS

1 Saratov State University named after N.G. Chernyshevskiy 2 Saratov State Technical University named after Gagarin Yu.A.

Process of destruction the pesticide prometrin by strain of Pseudomonas putida P2 in laboratory and field conditions in experimentally polluted soil is studied. The chemical analysis and toxicological efficiency evaluation of soil remediation during the using of agrotechnical acceptances and introduction of a strain destructor is carried out. It is shown that when entering into the polluted soil of biodestructor extent of pesticide degradation within 30 days increases up to 70%. Use only the technology of activization the soil microflora by agrotechnical acceptances leads 13,5% of prometrin to destruction. Application of technological agroacceptances in combination with entering of a strain biodestructor into the soil exerts considerable impact on activity and speed of processes of bioremediation.

Key words: bioremediation, microorganisms destructors, pesticide prometrin, Pseudomonas putida, biological product

Olga Ksenofontova, Candidate of Biology, Associate Professor. Е-mail: ksenofontova64@mail.ru Svetlana Tretyakova, Candidate of Biology, Chief of theBiotechnologicalDepartment. Е-mail: treste1@mail.ru Elena Tikhomirova, Doctor of Biology, Professor, Head of the Ecology Department. E-mail: tichomirova_ei@mail.ru Elena Vasnetsova, Post-graduate Student