CC BY
272
В. В. МАЛЯВИНА, С. А. ТОМИЛИНА, А. М. САМПИЕВ
разработка технологии фитофосфолипидов медицинского применения из побочных продуктов производства подсолнечного масла. Сообщение 1. выбор оптимального способа разрушения фосфатидной эмульсии
Кафедра фармации Кубанского государственного медицинского университета
К растительным маслам, которые за рубежом являются промышленными источниками получения фосфолипидов (ФЛ), относят: подсолнечное масло с содержанием ФЛ 0,5 - 1,2%; соевое масло - 1,1 - 3,9%; кукурузное масло - 2,0 - 2,7%; масло сафлоры - 1,1 -1,4%; хлопковое масло - 1,1 - 2,4% [1, 3, 4, 5].
Из перечисленных видов масел в нашей стране в промышленно значимых объемах производятся подсолнечное, кукурузное и хлопковое. При этом выделение в промышленных условиях из хлопкового масла ФЛ затруднено высоким содержанием в нем госсипола, являющегося прооксидантом и инициирующего окисление фосфолипидов [4, 5]. Отечественные способы переработки кукурузы при производстве масла исключают саму возможность получения фосфолипидного продукта.
Потенциальными масштабными источниками получения субстанции ФЛ в России для медицинского применения могли бы явиться побочные продукты масложировой промышленности: фосфатидная эмульсия, получаемая гидратацией нерафинированного подсолнечного масла в рамках типовых технологических схем на маслоэкстракционных заводах (МЭЗ), и фосфатидный концентрат - продукт обезвоживания эмульсии в результате высушивания при температуре 85-90° С и остаточном давлении 15,0 кПа [3]. В год только на одном из МЭЗ Краснодарского края - Лабинском вырабатывается около 250 000 тонн фосфатидного концентрата.
Материалы и методы исследования
Фосфатидная эмульсия представляет собой систему прямого типа с содержанием около 70% воды, 12% масла и 18% ФЛ. Соответственно, фосфатидный концентрат в результате удаления воды из эмульсии состоит из 40% масла и 60% ФЛ.
Проведенный нами анализ образцов от десяти серий фосфатидного концентрата производства МЭЗ «Кропоткинский» и «Лабинский» показал, что данный продукт не может выступить сырьем для получения фосфолипидных препаратов медицинского назначения, в частности, из-за высоких и широко варьируемых показателей окислительной порчи. Разброс значений по показателю «цветное число» составил 6 - 20 мг йода; «перекисное число» - 3,9 - 11,6 ммоль активного кислорода/кг и «кислотное число» - 6,3 - 20,8 мг КОН/г. Такие величины этих показателей объяснимы способом выделения фосфолипидного концентрата. Он предусматривает операцию по удалению влаги из фосфатидной эмульсии, требующей из-за высокой водоудерживающей способности ФЛ использования жестких технологи-
ческих решений: повышенную температуру и развитую поверхность площади испарения. Такие условия вызывают интенсивное протекание процессов окисления и гидролиза, которые помимо прочего активизируются присутствующей влагой. В результате в получаемом продукте накапливаются первичные, вторичные продукты окисления, азометины, меланофосфолипиды и др. Процессы окисления в первую очередь затрагивают гидрофобную часть молекулы ФЛ, а именно ненасыщенные жирные кислоты, и приводят к деструктивным изменениям последних [5, 6]. Следствием накопления вторичных продуктов окисления жирных кислот являются образование шиффовых оснований, потеря дифильности и, соответственно, поверхностно-активных свойств ФЛ, накопление токсичных продуктов конденсации или полимеризации. Кроме того, образующиеся в процессе гидролиза лизоформы ФЛ из-за отсутствия одного из двух жирно-кислотных остатков в молекулярном строении имеют форму конуса (а не цилиндра). По некоторым данным, в случае таких структурных изменений ФЛ в организме это приводит к образованию пор в бислойной мембране и нарушению барьерной функции мембран [2]. Упомянутые выше и многие другие деструктивные явления, происходящие в результате процессов окисления и гидролиза, вызывают снижение или потерю нативных физиологических, антиоксидантных, мембранот-ропных и других свойств ФЛ [6]. Таким образом, использовать фосфатидный концентрат для получения ФЛ медицинского применения нецелесообразно.
Целью настоящего исследования являлись разработка альтернативного, щадящего способа разрушения фосфатидной эмульсии и получение из нее источника фитофосфолипидов медицинского применения.
Исходная фосфатидная эмульсия обладала раз-брызгиваемостью 4-5% и высокой степенью устойчивости. Стойкость стабилизированной фосфолипидами эмульсии, выражаемая коэффициентом расслоения, составляла 0,90-1,0.
При выборе оптимальных способов разрушения эмульсии изначально предполагался отказ от воздействия на эмульсию повышенных температур, а также от применения дегидратирующих химических неорганических агентов в связи с высокой степенью лабильности и реакционной способностью ФЛ. Классические способы разрушения, такие как отстаивание, гравитационный, мембранный, оказались в эксперименте неэффективными. Так, центрифугирование при 8000 об./мин. не вызывало никаких существенных изменений в системе. Не привело к желаемому
УДК 615.014.27
Таблица 1
Сравнительная оценка показателей качества липидного комплекса, полученного после разрушения фосфатидной эмульсии этиловым спиртом, и фосфатидного концентрата промышленного производства
№ п/п Наименование показателей Липидный комплекс Фосфатидный концентрат
1 Цветное число, мг йода <2 В
2 Массовая доля влаги и летучих веществ, % 4,1 1,1
3 Массовая доля фосфатидов, % 68,0 68,5
4 Массовая доля масла, % 27,2 27,7
б Массовая доля веществ, не растворимых в этиловом эфире, % 0,3 1,1
б Кислотное число масла, выделенного из фосфатидного концентрата, мг КОН/г 0,26 8,3
7 Перекисное число, ммоль активного кислорода/кг 1,4 6,7
Примечание: приведены средние результаты 5 определений.
Таблица 2
Величины восстановительной емкости липидного комплекса, полученного после разрушения фосфатидной эмульсии этиловым спиртом, и фосфатидного концентрата промышленного производства
Наименование объекта Величина восстановительной емкости
Липидный комплекс 11,3
Фосфатидный концентрат 4,7
Примечание: приведены средние результаты 5 определений.
Таблица 3
Сравнительная оценка фосфолипидных продуктов по степени защиты парамеций от действия токсикантов
Наименование объекта Время остановки парамеций в 14,0%-ном этаноле, мин. Оценка мембрано-тропных свойств Время остановки парамеций в 1,0%-ном растворе Н2О2, мин. Оценка антиоксидантных свойств
Контроль 0,2±0,02 - 0,1±0,01 -
Липидный комплекс 23,5±0,53 Высокоактивные 4,4±0,27 Высокоактивные
Фосфатидный концентрат 7,3±0,35 Среднеактивные 1,3±0,09 Малоактивные
результату и использование методов криодеструкции, электродиализа, классической СО2-экстракции. Попытка использования таких растворителей, как хлороформ, диэтиловый эфир, петролейный эфир, также не приводила к расслоению эмульсии. В отличие от этих гидрофобных жидкостей спирт этиловый
даже в незначительных количествах приводил к заметному разрушению эмульсии.
В этой связи дальнейшие исследования были направлены на определение достаточного и необходимого количества спирта этилового 96%-ного как де-гидратанта для расслоения эмульсии. Исследование
проводилось при комнатной температуре и интенсивном перемешивании системы в течение 30 минут. Экспериментально было установлено, что полное разрушение эмульсии наблюдается при соотношении «эмульсия - спирт» 1:2. Необходимо отметить, что при выбранном соотношении в отделяемый водно-спиртовой слой все же переходило около 5% липидных веществ от их содержания в исходной фосфатидной эмульсии. После разделения фаз верхний, водно-спиртовой слой декантировали и отбрасывали. Нижнюю фракцию, содержащую сумму полярных и неполярных липидов (липидный комплекс), сушили в вакуум-ротационном испарителе при температуре 40° С и подвергали качественному анализу.
Результаты исследования и их обсуждение
Первоначально приемлемость разработанного способа разрушения эмульсии оценивали по показателям окислительной деструкции нейтральных и полярных липидов в получаемом продукте. Анализ липидного комплекса проводили по предусмотренному для фосфатидного концентрата перечню показателей качества. Для сравнительной оценки параллельно анализировался фосфатидный концентрат, произведенный классическим промышленным способом из части взятой для исследования партии фосфатидной эмульсии. Результаты данного этапа исследования приведены в таблице 1.
Как видно из приведенных данных, липидному комплексу, получаемому из разрушенной спиртом эмульсии, свойственны значительно меньшие величины показателей «цветность», «перекисное» и «кислотное» числа, чем для фосфатидного концентрата.
Для более полной и объективной оценки качества липидного комплекса проводили его тестирование по уровню выраженности антиоксидантной и мембрано-тропной активности как главного фактора, определяющего ценность ФЛ и их применение. Определение антиоксидантных свойств in vitro проводили по предложенной нами методике определения восстановительной емкости липидных продуктов с применением в качестве субстрата восстановления иона железа (III). Критерием восстановительной емкости (или антира-дикального действия) служила величина оптической плотности комплекса - иона железа (II) с о-фенантро-лином, образующегося после взаимодействия с исследуемыми объектами [7].
В таблице 2 приведены данные определения величин восстановительной емкости полученного липидного комплекса и фосфатидного концентрата. Согласно им по значению восстановительной емкости липидный комплекс превосходит в 2,4 раза фосфатидный концентрат.
Тестирование антиоксидантного и мембранотроп-ного действия in vitro проводили на известной модели с использованием Paramecium caudatum и шкалы про-тективного действия растительных препаратов в опытах на парамециях [7].
В опытах на модели in vivo (табл. 3) липидный комплекс показал более высокую мембранотропную и антиоксидантную активность, чем фосфатидный концентрат. Это обусловлено не преобладанием количества ФЛ, а более щадящими условиями получения липидного комплекса, сохраняющими нативные биосвойства содержащихся в подсолнечном масле фосфолипидов.
Таким образом, применение спирта этилового для разрушения эмульсии с последующей сушкой полученного липидного комплекса в мягких условиях позволяет максимально сохранить ФЛ от окислительной деструкции при выделении из фосфатидной эмульсии. Это, в свою очередь, прогнозирует возможность использования липидного комплекса как сырьевого источника ФЛ медицинского применения.
Поступила 03.10.2007
ЛИТЕРАТУРА
1. Арутюнян Н. С., Корнена Е. П. Фосфолипиды растительных масел: состав, структура, свойства, применение и получение. М.: Агропромиздат, 1986. 256 с.
2. Антонов В. Ф., Черныш А. М., Вознесенский С. А. и др. Биофизика. М.: Владос, 2000. 287 с.
3 . Корнена Е. П., Арутюнян Н. С. Исследование в области количественного выведения фосфорсодержащих веществ // Тр. ВНИИЖ, 1980. С. 57-63.
4 . Ерешко С. А., Константинов В. Е., Сердюк Л. И. и др. Получение и тенденции применения растительных фосфолипидов // Изв. вузов. Пищ. технологии. 2000. № 3-4. С. 34-36.
5 . Василенко И. А., Краснопольский Ю. М., Степанов А. Е. и др. Проблемы и перспективы производства фосфолипидов // Хим.-фармац. журн. 1998. № 5. С. 9-15.
6 . Сампиев А. М., Малявина В. В., Степанова Э. Ф. Перспективы и проблемы использования пищевого фосфатидного концентрата для получения высокоочищенного фосфолипидного комплекса с нативными фармакосвойствами // Человек и лекарство. Тез. докл. 8-го Рос. нац. конгр. 2-6 апр. 2001 г. С. 707.
7. Томилина С. А., Малявина В. В., Сампиев А. М. Новые подходы в оценке качества фосфолипидных продуктов // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Материалы 8-го Международ. съезда «Фитофарм 2004»; Миккели, Финляндия. СПб: ВВМ, 2004. С. 297-299.
v. v. malyavina, s. a. tomilina, a. m. sampiev
THE DEVELOPMENT TO TECHNOLOGIES PHYTOPHOSPHOLIPIDS MEDICAL USING FROM BY-PRODUCT SUNFLOWER BUTTER PRODUCTION MESSAGE 1. THE CHOICE OF THE OPTIMUM WAY OF THE DESTRUCTION PHOSPHOLIPIDS EMULSIONS
It is shown possibility of the use as raw materials source phospholipids of the medical using phospholipids emulsions - side-go product production refined sunflower butter. The offered mode of destructions to emulsions with use the alcohol ethyl, allowing unlike as distinct from applicable, greatly save the bioproperty containing phospholipids in her. The organized estimation quality offered lipids complex and are demonstrated his advantage in contrast with produced at present from sunflower butter phospholipids by concoction.
Key words: phospholipids concoction, phospholipids emulsion, phospholipids.
