CC BY
141
УДК 579:57.083:576.85
разработка системы молекулярно-генетической детекции бактерий видов LISTERIA MONOCYTOGENES и LISTERIA IVANOVII
Басильев дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Мастиленко Андрей Владимирович, кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитар-ная экспертиза»
Ковалева Елена Николаевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза» ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина» 432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел.:8(8422)559547 e-mail: [email protected]
Ключевые слова: детекция, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, мультиплексная ПЦР в режиме «реального времени».
Статья посвящена вопросу разработки мультиплексной ПЦР в режиме «реального времени» для генетической дифференциации патогенных видов листерий, являющихся причиной пищевого листериоза. Авторами показано, что использование праймеров и флуоресцентных зондов с красителями R6G и Fam, фланкирующих фрагмент гена prfA позволяет проводить детекцию бактерий видов Listeria monocytogenes и Listeria ivanovii.
Введение
На сегодняшний день листериоз имеет эпидемиологическое и эпизоотологическое значение не столько как классическая нозологическая единица, характеризующаяся традиционными инфекционными показателями, связанными с инфекционной болезнью овец и, как следствие, теоретически возможным заражением специалистов по профессиональным показателям (животноводы, ветеринарные врачи), а в первую
очередь как пищевая инфекция людей [1]. Рассмотрение листериоза в данном ракурсе можно объяснить как биологическими особенностями листерий, так и появившимся в последнее время широким спектром продуктов питания человека, в том числе растительного происхождения [2].
Повышение жизненного уровня людей, улучшение медицинского обслуживания привело к увеличению продолжительности жизни и понижению детской смерт-
и
SS ESS »1
Si
р и ш IS ;>i M ■ i
00 s!
ности, что повлекло за собой (по сравнению с серединой 50-х годов ХХ века) расширение спектра людей, входящих в первую группу риска - люди с пониженным иммунитетом, недоношенные дети, ВИЧ-инфицированные больные, люди, перенесшие пересадку органа и принимающие иммунодепрессанты.
Комплекс биологических свойств ли-стерий, обусловленный в первую очередь сапрофитной природой (способность существовать и размножатся в температурном диапазоне от +4°С до -20°С - в условиях хранения в холодильниках) и высокой вирулентностью (до 62% у людей первой группы риска), выводит данный микроорганизм в группу наиболее коварных, а инфекцию наименее прогнозируемых [1, 2].
Для листерий характерна сложная таксономическая структура. В настоящее время род Listeria включает 7 видов: L.monocytogenes, L.ivanovii, L.grayi, L.murrayi, L.innocua, L.seeligeri, L.welshimeri. Установлено, что наибольшую опасность для человека представляют листерии вида L.monocytogenes, в связи с этим существующие методы и тесты направлены на выявление бактерий именно этого вида с целью исключения в пищевом сырье и продуктах питания. Фенотипические свойства листерий видов LL.ivanovii, L.grayi, L.murrayi, L.innocua, L.seeligeri, L.welshimeri недостаточно определены, а по некоторым показателям аналогичны бактериям L.monocytogenes, что может приводить к неточной идентификации, а значит, и к ошибочному заключению по экспертной проверке пищевого сырья (и/ или продуктов питания), рекомендации к уничтожению или перевода его в категорию непищевого.
Основными средствами диагностики листериоза в России являются бактериологические методы, требующие значительных трудовых и временных затрат. Поэтому остро встает задача создания современных экспрессных высокочувствительных и специфичных средств и методов индикации и идентификации листерий различных видов [3].
Одним из путей преодоления указанных трудностей является разработка и использование систем на основе методов выявления генома возбудителя с использованием полимеразной цепной реакции
(ПЦР) [4, 5, 6, 7]. Данный подход позволит идентифицировать присутствие возбудителя листериоза в пищевом сырье и продуктах питания [8, 9, 10].
Цель исследований - разработка мультиплексной ПЦР в режиме «реального времени» для генетической дифференциации патогенных видов листерий
объекты и методы исследований Работа была выполнена на базе отдела молекулярной биотехнологии кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА им П.А. Столыпина.
В работе использованы штаммы L.monocytogenes, L.ivanovii, L.innocua, L.grayi, L.murrayi из музея кафедры. Для выделения ДНК использовали «ДНК-сорб-АМ» («ИнтеЛабСервис», Москва), в основе метода лежит лизис бактериальных клеток, сорбция ДНК на силикагеле и отмывка ДНК спиртово-солевым буфером. В работе были использованы олигонуклеотиды LMC-f TCGATTAACGGGAAGCTCGG, LMC-r AACAGCTGAGCTATGTGCGA, LIV-f GCTCAGA-TATCACGCAGCTT, LIV-r AGCTGTCCGCAAATA-GAACCT и флуоресцентные зонды LMC-oli-go TGCAGGAGTTAGGCTATTCAAGCGGT - R6G-BHQ2, LIV-oligo TCCAAGCTTTGCAAAAGCAA-GTTTCA - Fam-BHQl. Для амплификации в работе использовали «Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ с Taq-ДНК-полимера-зой и ингибирующими активность фермента антителами» (состав набора: дезоксину-клеозидтрифосфаты, 2.5 мМ, 500 мкл; 10-кратный ПЦР буфер, 500 мкл; MgCl2, 25 мМ, 500 мкл; Taq ДНК-полимераза с ингибиру-ющими активность фермента антителами, 5 Е/мкл, 50 мкл; деионизированная вода, 2х1,7 мл.) («Синтол», Москва), а также детектирующий амплификатор ДТ-96 («ДНК-Технология», Москва).
результаты исследований Для бактерий вида L.monocytogenes были определены несколько участков генов, среди которых видоспецифичным оказался prfA, фланкирующий протеин-регулятор ли-стериолизина, а для бактерий вида L.ivanovii видоспецифичным оказался участок гена, кодирующего протеин позитивной регуляции листериолизина.
В системе BLAST ресурса NCBI Gene-
Таблица 1 Программа для амплификации ДНК
№ цикла Шаг Температура Длительность Де-тек-ция Количество повторов
1 1 95°С 5 мин 1
1 95°С 10 сек
2 2 3 55°С 72°С 20 сек 10 сек * 40
3 1 72°С 2 мин 1
Таблица 2
Ct Fam/Hex при RT-PCR проб с содержанием ДНК ¡..monocytogenes, L.ivanovii, L.innocua, L.grayi, L.murrayi
№ лунки Идентификатор пробирки Cp, Fam Cp, Hex
A1 L.ivanovii.5a (Lister) 25,8
A2 L.ivanovii.5b (Lister) 30,2
A3 L.innocua.6a (Lister)
A4 L.innocua. c-644 (Lister)
A5 L.grayi. (Lister)
A6 L.murrayi. (Lister)
A7 L.monocytogenes.k-1 (Lister) 23,5
A8 L.monocytogenes.11944 (Lister) 25,6
B1 L.monocytogenes.9-130 (Lister) 20,4
B2 L.innocua.1 (Lister)
B3 Lmonocytogenes. 9-127 (Lister) 23,4
B4 Lmonocytogenes. 9-72 (Lister) 22,1
B5 Lmonocytogenes.10522 (Lister) 25,2
B6 L.monocytogenes.766 (Lister) 22,6
B7 L.monocytogenes.139 (Lister) 23,0
B8 Lmonocytogenes. 9-72 (Lister) 26,2
C1 K+_L.ivanovii. (Lister) 25,9
C2 K+_L.monocytogenes. (Lister) 26,6
C3 K- (Lister)
Bank нами были определены полные ну-клеотидные последовательности участков генов для молекулярно-генетической идентификации и дифференциации вышеуказанных микроорганизмов.
После дизайна праймеров, были определены олигонуклеотидные зонды с включением флуоресцентных меток, индивидуальных для L.monocytogenes и L.ivanovii.
Рис. 1 - Кривая роста флуоресцентного сигнала по каналу Рат
мху
n; 6001
J
I 41 4Mb
=r
л
л
f d00-
В
J00:
икН
о1
/ /V -—
/ , fi
/ / ——■
// J 1
hi 1
/
ffi 1L
V /
ю
]5 J0 25 Номер цикла
30
Рис. 2 - Кривая роста флуоресцентного сигнала по каналу Hex
Так, флуоресцентный сигнал, свидетельствующий об амплификации специфического фрагмента генома L.monocytogenes, детектируется по каналу Hex (краситель R6G), а L.ivanovii по каналу Fam (краситель Fam).
По данным ряда предварительных экспериментов по оптимизации протокола проведения ПЦР нами была составлена программа амплификации для термоциклеров с детекцией в режиме «реального времени» (табл. 1).
Для подтверждения видоспецифич-ности работы праймеров в эксперименте были использованы штаммы бактерий видов L.innocua, L.grayi, L.murrayi. Результаты обработки данных экспоненциального роста флуоресценции по каналам Fam и Hex отражены в табл. 2.
SI
SS ESS »1
Si
p и Ш IS ;>i M >1
00 л и
При проведении ПЦР в процессе эксперимента наблюдался экспоненциальный рост флуоресцентных сигналов по каналам Fam и Hex, соответствующих каждому из определяемых возбудителей. Результаты представлены на рис. 1 и 2.
выводы
В результате экспериментов нами определены праймеры и флуоресцентные зонды с красителями R6G и Fam для L.monocytogenes и L.ivanovii соответственно. В процессе оптимизации программы амплификации (95°С-5 мин - 1 цикл; 95°С-10 сек, 55°С-20 сек, 72°С-10 сек - 40 циклов; 72°С-2 мин - 1 цикл) была доказана специфичность праймеров и олигонуклеотидных зондов для указанных возбудителей. Мультиплексный формат ПЦР в режиме «реального времени» позволяет проводить одновременную амплификацию и детекцию L.monocytogenes и L.ivanovii в одной пробирке при использовании двухканальных термоциклеров (Fam и Hex).
Библиографический список
1. Листерии и листериоз: [монография] I И.А. Бакулов, Д.А. Васильев, Д.В. Кол-басов, Т.И. Кольпикова, Ю.О. Селянинов, И.Ю. Егорова. - Ульяновск: Ульяновская ГСХА, 2008. - 168 с.
2. Джей, Дж. М. Современная пищевая микробиология I Дж. М. Джей, М. Дж. Лесс-нер, Д.А. Гольден. - М.: Бином. Лаборатория знаний, 2011. - 887 с.
3. Васильев, Д.А. Листериозные Бактериофаги: [научное издание] I Д.А. Васильев, E.H. Ковалева, С.Н. Золотухин. - Ульяновск: НИИЦМиБ, Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина, 2013. - 66 с.
4. Diagnosis of Listeria monocytogenes Meningoencephalitis by Real-Time PCR for the hly Gene I Alban Le Monnier, Eric Abachin, Jean-Luc Bereffi, Patrick Berche, Samer Kayal II J. of Clinical Microbiol. - 2011. - 49, № 11. - P.
3917 - 3923.
5. Serogroup-Related PCR Typing of Listeria monocytogenes 4b Isolates / Bixing Huang, Ningxia Fang, Karolina Dimovski, Xian Wang, Geoff Hogg, John Bates // J. of Clinical Microbiol. - 2011. - 49, № 1. - P. 426 - 429.
6. Real-Time PCR Assay To Differentiate Listeriolysin S-Positive and -Negative Strains of Listeria monocytogenes / Evelyn M. Clayton, Colin Hill, Paul D. Cotter, R. Paul Ross // Appl. And Environ. Microbiol. - 2011. - 77, № 1. - P. 163 -171.
7. Stress- and Growth Rate-Related Differences between Plate Count and Real-Time PCR Data during Growth of Listeria monocytogenes / Franziska Reichert-Schwillinsky, Carmen Pin, Monika Dzieciol, Martin Wagner, Ingeborg Hein // Appl. And Environ. Microbiol.
- 2009. - 75, № 7. - P. 2132 - 2138.
8. Васильева, Ю.Б. Разработка методов детекции бактерий Bordetella bronchiseptica / Ю.Б. Васильева // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2013. - № 3 (23). - С. 46-51.
9. Использование количественной ПЦР для идентификации Bordetella bronchiseptica / Д.А. Васильев, А.В. Мастиленко, Ю.Б. Васильева, Д.Г. Сверкалова // Молекулярная диагностика - 2010: Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, 24-26 ноября, 2010. - Москва, 2010. - С.68 - 70.
10. Определение эффективности разработанных зондов в реакции РВ-ПЦР для повышения специфичности выявления Bordetella bronchiseptica / А.В. Мастиленко, Д.А. Васильев, Ю.Б. Васильева, Д.Г. Свер-калова / Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций: материалы международной конференции, Санкт-Петербург, 5 - 7 июня 2013 года. - Санкт-Петербург: НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера. - «Инфекция и иммунитет». - Т.3.
- №2. - С. 152.
