CC BY
85
Shaeva A.Y., Vafin R.R., Khazipov N.Z., Kamalov B.V., Alimov A.M.,
Tagirov M.Sh.
Summary
The aim of our study was to determine the taxonomic affiliation of BLV isolated from the livestock farms of the Republic of Tatarstan, in the context of molecular-genetic aspects of BLV typing. The systematic herd monitoring on the genotypic level of BLV identification, will enhance the efficiency of antiepizootic events.
УДК: 619:57.065:578.828
РАЗРАБОТКА СХЕМЫ ПЦР-ПДРФ-ГЕНОТИПИРОВАНИЯ BLV В СООТВЕТСТВИИ С ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЙ КЛАССИФИКАЦИЕЙ
Шаева А.Ю., Вафин Р.Р.*, Хазипов Н.З., Камалов Б.В.**, Алимов А.М.,
Тагиров М.Ш.*
ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»
ГНУ «ТатНИИСХ РАСХН» (Казань)*
Главное управление ветеринарии КМ РТ (Казань)**
Ключевые слова: ВЛКРС, классификация, генотипирование, ПЦР, ПДРФ.
Key words: BLV, classification, genotyping, PCR, RFLP.
Лейкоз крупного рогатого скота, имеющий повсеместное широкое распространение, остается одной из наиболее актуальных проблем животноводства в виду нанесения данной отрасли сельского хозяйства ощутимого экономического ущерба [1, 2, 3, 4, 5].
Лабораторно-диагностические исследования в системе мониторинга инфицированности стад Bovine Leukemia virus (BLV) являются неразрывным звеном противолейкозных мероприятий [4, 5].
Ранее разработанные способы типизации ВЛКРС на основе ПЦР-ПДРФ -анализа [1, 2, 3], несмотря на определенную идентификационную ценность, всё же не позволяют охарактеризовать весь спектр генетического многообразия BLV, нежели филогенетическая классификация, предложенная S.M. Rodriguez et al. (2009) [5], и регламентирующая наличие 7 генотипов у данного инфекционного агента.
Целью данной работы являлся сравнительный анализ представителей ВЛКРС на предмет их классификации в контексте предложенных стратегий типизации с дальнейшим усовершенствованием
схемы генотипической идентификации BLV по локусу env-гена возбудителя.
Материалы и методы. В работе были использованы 2 изолята ВЛКРС: «N10» и «N28», выделенные от кр.рог.ск. из Мензелинского и Спасского районов Республики Татарстан, соответственно.
При постановке ПЦР с выделенными образцами провирусной ДНК BLV применялась модификация «nested» ПЦР, генерирующая амплификацию фрагмента env-гена ВЛКРС длиной 444 п.н. [1, 2, 3].
Эндонуклеазы рестрикции, использованные для ПЦР-ПДРФ-анализа: Ksp22I, HaeUI, BamHI, PvuII, Ddel, SspI и AsuHPI.
ПЦР-ПДРФ-фрагменты разгоняли в 2,5% агарозном геле (20 В/см, 40 мин) и визуализировали в УФ-трансиллюминаторе (А=310 нм).
ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0.
Секвенирование продуктов амплификации локуса env-гена BLV с внутренними праймерами «env5099» и «env5521» изолятов «N10» и «N28» ВЛКРС выполнено на приборе ABI-300 в лабораториях НПО «СибЭнзим».
Изоляты «N10» (GenBank A/N: HM102355) и «N28» (GenBank A/N: HM102356) были выравнены по длине 444 нуклеотидов локуса env-гена c соответствующими опубликованными в GenBank последовательностями представителей известных генотипов BLV, используя программы BLAST и CLUSTAL W (v. 1.83) с последующим филогенетическим анализом.
Результаты исследования и их обсуждение. В результате
исследования 2-х выделенных нами изолятов ВЛКРС на предмет их
таксономической принадлежности, установлено, что в зависимости от
выбранной стратегии типизации на основе ПЦР-ПДРФ-анализа, изолят «N10» BLV относится к Бельгийскому подтипу (по D. Beier et al. 2001, [1]), к 6-му генотипу (по M. Licursi et al. (2002) [3]), и к группе «A» (по H Fechner, 1997 [2]); а изолят «N28» BLV характеризуется признаком Австралийского подтипа (по D. Beier et al. 2001, [1]), 1-го генотипа (по M. Licursi et al. (2002) [3]), и группы «С» (по H Fechner, 1997 [2]). По филогенетической же классификации, предложенной S.M. Rodriguez (2009) [5], изоляты «N10» и «N28» принадлежат к кластерам 4-го и 7-го генотипов, соответственно.
При сравнительном анализе 184 заявленных в GenBank NCBI нуклеотидных последовательностей изолятов BLV на предмет их классификации в зависимости от выбранной стратегии идентификации установлено, что известные ранее способы типизации представителей BLV, разработанные на основе ПЦР-ПДРФ-анализа [1 2, 3], не
согласуются с новым подходом оценки генотипического разнообразия ВЛКРС на основе филогенетического анализа env-гена [4, 5] (табл. 1).
1. Классификация заявленных в ОепБапк КСБ1 изолятов БЬУ в зависимости от выбранной стратегии типизации (количественное
отношение)
ТИПИЗАЦИЯ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
ГЕНОТИПЫ
1-ый 2-ой 3-ий 4-ый 5-ый 6-ой 7-ой
ПЦР-ПДРФ-АНАЛИЗ И в — н п п о в Бельгийский 17
Австралийский 49 4 8 4
Японский 8 2
? 42 37 1 10 2
ГЕНОТИПЫ [3] 1-ый 87 1 7 4
2-ой
3-ий 8 2 1
4-ый
5-ый 1 4 1
6-ой 36 17 8
? 3 1 2 1
ГРУППЫ [2] A 17
B 8 2 1
C 48 4 8 4
D 39 1
E
F 36 8
G 1
? 3 1 2 1
Дальнейшие исследования были направлены на разработку схемы ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВЛКРС, согласующейся с филогенетической классификацией, предложенной S.M. Rodriguez (2009) [5], для чего, на первом этапе, провели скрининг известных эндонуклеаз рестрикций путем моделирования ПЦР-ПДРФ-профилей нуклеотидных последовательностей локуса env-гена представителей известных генотипов BLV с последующим формированием оптимального протокола идентификации.
Обобщенная информация с интерпретацией полученных env-ПЦР-ПДРФ-профилей ВЛКРС представлена в табл. 2.
Установлено, что для выделенных нами изолятов характерны соответствующие комбинации ПЦР-ПДРФ-профилей: для изолята «N10» -комбинация №11; для изолята «N28» - комбинация №16 (табл. 2).
Следует подчеркнуть, что рассчитанная в результате секвенирования продуктов ПЦР-амплификации точная картина ожидаемых ПДРФ-фрагментов ДНК изолятов «N10» и «N28» ВЛКРС, в дальнейшем, была воспроизведена нами экспериментально.
2. Япу-ПЦР-ПДРФ-профили БЬУ (праймеры епу5099-епу5521)
Г Типовой изолят вепБапк А^ ПЦР- продукт (п.н.) ПДРФ-фрагменты (п.н.) К N
ВатНІ РгнІІ БйеІ SspI НркІ (^иНРІ)
1 АЬ-63 Г1808571 444 316/128 444 444 399/45 224/220 1 57
1 АЬ-2106 Г1808578 444 444 444 444 399/45 224/220 2 37
1 Цги38 ГМ209471 444 444 444 330/114 399/45 224/220 3 3
1 уам М35239 444 316/128 444 444 399/45 224/181/39 4 1
1 КипіІ8Іа п БШ66062 444 316/128 444 444 399/45 220/196/28 5 1
2 АЬ-164 Г1808574 444 316/128 280/164 276/168 399/45 224/220 6 35
2 АКО8Г8 АГ485773 444 316/128 280/164 276/168 399/45 444 7 1
2 АЬ-1453 Г1808577 444 316/128 280/164 276/168 444 224/220 8 1
3 хрги БГ065650 444 316/128 444 276/168 399/45 444 9 4
4 БО БГ065638 444 444 280/164 276/168 399/45 224/220 10 16
4 N10 НМ102355 444 444 280/164 168/162/114 399/45 224/220 11 1
4 3 И87872 444 444 444 168/162/114 399/45 224/220 12 1
5 СКАБ-2 БГ065636 444 316/128 280/164 276/168 399/45 224/181/39 13 8
5 СЯБС-1 БГ065655 444 316/128 280/164 276/168 444 224/181/39 14 2
6 РЬ-1238 Г1808582 444 316/128 444 276/168 399/45 224/220 15 10
7 N28 НМ102356 444 316/128 444 276/168 444 224/137/83 16 3
7 12 Б83530 444 316/128 444 276/168 444 224/220 17 1
7 14 АУ515274 444 316/128 444 276/168 444 145/137/83/ 79 18 1
7 30 Бд059417 444 316/128 444 276/168 444 444 19 1
Обозначения: Г - генотип; К - комбинация; N - количество известных изолятов БЬУ с соответствующей комбинацией ПЦР-ПДРФ-профилей.
Распределение фрагментов рестрикции, полученных при эндонуклеазном расщеплении ПЦР -продуктов ферментами ВатНІ, Рупії, DdeI, 88рІ и ЛзпНРІ, представлено на рис. 1.
На рис. 1 видно, что при обработке ПЦР-продукта от изолята «N10» ферментом ВатНІ ПДРФ-фрагментов не образуется ввиду отсутствия соответствующего сайта рестрикции в анализируемом локусе впу-гена. Рупії расщепляет ампликон на 2 фрагмента - 280 и 164 п.н., DdвI - на фрагменты 168, 162 и 114 п.н., 88рІ - 399 и 45 п.н., Л8пНРі - 224 и 220 п.н.
Полученный ампликон от изолята «N28» расщепляется эндонуклеазой рестрикции ВатНІ на фрагменты длиной 316 и 128 п.н., DdвI - 276 и 168 п.н., а рестриктазой ЛsпHPI на 224, 137 и 83 п.н.. Ферменты Рупії и SspI в данном локусе впу-гена изолята «N28» ПДРФ-фрагментов не образуют из-за отсутствия соответствующих сайтов рестрикции (рис. 1).
1. Электрофореграмма env-ПЦР-ПДРФ-профилей изолятов N10 и N28 BLV
Обозначения: 1.0-1.5) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята N10 BLV: 1.0) ПЦР-продукт (444 bp); 1.1) BamHI-ПДРФ (444 bp); 1.2) PvuII-ПДРФ (280/164 bp); 1.3) DdeI-ПДРФ (168/162/114 bp); 1.4) SspI-ПДРФ (399/45 bp); 1.5) AsuHPI-ПДРФ (224/220 bp). М) ДНК-маркеры 100-1000 bp (СибЭнзим). 2.0-2.5) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята N28 BLV: 2.0) ПЦР-продукт (444 bp): 2.1) BamHI-ПДРФ (316/128 bp); 2.2) PvuII-ПДРФ (444 bp); 2.3) DdeI-ПДРФ (276/168 bp); 2.4) SspI-ПДРФ (444 bp); 2.5) AsuHPI-ПДРФ (224/137/83 bp).
Заключение. Подобранные нами условия проведения ПЦР-ПДРФ-анализа с использованием 5 ферментов BamHI, PvuII, DdeI, SspI и AsuHPI позволяют идентифицировать генотипы ВЛКРС в соответствии с филогенетической классификацией BLV [4. 5].
Следует отметить, что 1-ый генотип ВЛКРС характеризуется наличием пяти комбинаций ПЦР-ПДРФ профилей (К1-5); 2-ой генотип -трех комбинаций (К6-8), 3-ий генотип - наличием одной комбинации (К9); 4-ый генотип - трех комбинаций (К10-12); 5-ый генотип - двух комбинаций (К13-14); 6-ой генотип - одной комбинации (К15), и 7-ой генотип - наличием четырех комбинаций (К 16-19) (табл. 2).
Примечательно, что для идентификации 1-го генотипа достаточно даже одной эндонуклеазы рестрикции - DdeI. С использованием двух ферментов могут быть определены представители 4-го (BamHI и DdeI), 5го (PvuII и AsuHPI) и 7-го генотипов (PvuII и SspI) BLV (табл. 2).
В целях же исчерпывающей идентификации генотипов ВЛКРС целесообразно руководствоваться полной картиной env-ПЦР-ПДРФ-профилей с сопоставлением полученных данных с результатами секвенирования ПЦР-продуктов и последующим филогенетическим анализом представителей BLV по env-гену данного возбудителя.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Beier, D. Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA and DNA sequencing / D. Beier, P. Blankenstein, O.
Marquardt, J. Kuzmak // Berl Munch Tierarztl Wochenschr - 2001. - V. 114. -№ 7-8. - P. 252-256. 2. Fechner, H. Provirus variants of the bovine leukemia virus and their relation to the serological status of naturally infected cattle / H. Fechner, P. Blankenstein, A.C. Looman, J. Elwert, L. Geue, C. Albrecht, A. Kurg, D. Beier, O. Marquardt, D. Ebner // Virology -1997. - V. 237. - № 2. -P. 261-269. 3. Licursi, M. Genetic heterogeneity among bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts / M. Licursi, Y. Inoshima, D. Wu, T. Yokoyama, E.T. Gonzalez, H. Sentsui // Virus Res. - 2002. - V. 86. - № 1-2. - P. 101-110. 4. Moratorio, G. Phylogenetic analysis of bovine leukemia viruses isolated in South America reveals diversification in seven distinct genotypes / G. Moratorio, G. Obal, A. Dubra, A. Correa, S. Bianchi, A. Buschiazzo, J. Cristina, O. Pritsch // Arch. Virol. - 2010. - V. 155. -№ 4. - P. 481-489. 5. Rodriguez, S.M. Bovine leukemia virus can be classified into seven genotypes: evidence for the existence of two novel clades / S.M. Rodriguez, M.D. Golemba, R.H. Campos, K. Trono, L.R. Jones //J Gen Virol. -2009. - V. 90. - № 11. - P. 2788-2797.
РАЗРАБОТКА СХЕМЫ ПЦР-ПДРФ-ГЕНОТИПИРОВАНИЯ BLV В СООТВЕТСТВИИ С ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЙ КЛАССИФИКАЦИЕЙ
Шаева А.Ю., Вафин Р.Р., Хазипов Н.З., Камалов Б.В., Алимов А.М.,
Тагиров М.Ш.
Резюме
Целью данной работы являлся сравнительный анализ представителей ВЛКРС на предмет их классификации в контексте предложенных стратегий типизации с дальнейшим усовершенствованием схемы генотипической идентификации BLV по локусу env-гена возбудителя. Подобранные нами условия проведения ПЦР-ПДРФ-анализа с использованием 5 ферментов BamHI, PvuII, DdeI, SspI и AsuHPI позволяют идентифицировать генотипы ВЛКРС в соответствии с филогенетической классификацией BLV.
DEVELOPMENT OF THE SCHEME OF PCR-RFLP-GENOTYPING BLV IN ACCORDANCE WITH PHYLOGENETIC CLASSIFICATION
Shaeva A.Y., Vafin R.R., Khazipov N.Z., Kamalov B.V., Alimov A.M.,
Tagirov M.Sh.
Summary
The purpose of this study was a comparative analysis BLV isolates for their classification in the context of the proposed strategies for typing with further improvement scheme genotypic identification of BLV by env-gene locus of the pathogen. We had selected the conditions of the PCR-RFLP analysis using 5 enzymes (BamHI, PvuII, DdeI, SspI and AsuHPI) that allow identifying the genotypes in accordance with the phylogenetic classification of the BLV.
