УДК / UDC 634.75:57.086.83
РАЗРАБОТКА ПРОТОКОЛА ВВЕДЕНИЯ РАСТЕНИЙ ЗЕМЛЯНИКИ
В КУЛЬТУРУ IN VITRO
DEVELOPMENT OF AN INTRODUCTION PROTOCOL FOR STRAWBERRY PLANTS INTO IN VITRO CULTURE
Мацнева O.B.*, научный сотрудник Mazneva O.V., Scientific Researcher Ташматова Л.В., кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник Tashmatova L.V., Candidate of Agricultural Sciences, Senior Researcher Хромова T.M., младший научный сотрудник Khromova T.M., Junior Researcher Шахов В.В., младший научный сотрудник Shakhov V.V., Junior Researcher ФГБНУ ВНИИ селекции плодовых культур, Орловская область, Россия Russian Research Institute of Fruit Crop Breeding, Orel Region, Russia
*E-mail: [email protected]
Исследования проводили с целью разработки эффективного протокола введения растений земляники в культуру in vitro. Объектами исследований служили наиболее востребованные сорта земляники отечественной и зарубежной селекции: Царица, Берегиня, Флоренс (Florence), Фрида (Frida), Кимберли (Kimberly) и др. В качестве стерилизующих агентов применяли ртутьсодержащие препараты мертиолят в концентрации 0,01% и сулему в концентрации 0,1%. Изоляцию эксплантов проводили в несколько сроков: февраль - начало роста, июнь - активный рост, август - затухание роста. Исследования показали, что максимальные асептические культуры были получены при обработке растительного материала земляники ртутьсодержащим препаратом сулема в концентрации 0,1%. На первом этапе микроразмножения экспланты имели высокую жизнеспособность во все сроки изоляции, приживаемость в среднем по сортам составила 74,8-80,7%. Отмечали существенное влияние генотипа (сортовых особенностей) на показатели приживаемости эксплантов. Количество эксплантов, пригодных к клонированию, не зависело от общего уровня регенерации. Стабилизация культуры при зимнем введении проходила значительно быстрее, чем в другие сроки. Использование зимнего срока изоляции эксплантов земляники позволило повысить выход эксплантов, способных к дальнейшему клонированию, ускорить стабилизацию культуры in vitro и сократить сроки получения микрорастений, пригодных для высадки в нестерильные условия. В среднем по сортам было получено 75,2% эксплантов, способных к дальнейшему клонированию. В результате проведенных исследований были отработаны условия и способы получения наибольшего количества жизнеспособных стерильных эксплантов земляники, которые будут включены в процесс размножения in vitro и дальнейшие исследования.
Ключевые слова: земляника, in vitro, протокол введения в культуру, стерилизующий агент, срок изоляции, жизнеспособность.
The research was conducted in order to develop an effective protocol for introducing strawberry plants into in vitro culture. The objects of the research were the most popular varieties of strawberries of domestic and foreign selection: Tsaritsa, Bereginya, Florence, Frida, Kimberly, etc. Mercurial preparations mertiolate at a concentration of 0.01% and sulema at a concentration of 0.1% were used as sterilizing agents. The isolation of explants was performed in several periods: the beginning of the growth was in February, active growth was in June, the decline of growth was in August. The studies have shown that the maximum aseptic cultures were obtained when processing strawberry plant material with mercury-containing sulema preparation in the concentration of 0.1%. At the first stage of micro-
propagation, explants had a high viability during all periods of the isolation, the average survival rate for varieties was 74.8-80.7%. A significant influence of the genotype (varietal characteristics) on the survival rates of explants was noted. The number of explants suitable for cloning did not depend on the overall level of regeneration. Stabilization of the crop during winter introduction was much faster than in other periods. Using the winter term of the isolation of strawberry explants allowed to increase the yield of explants capable of further cloning, accelerate the stabilization of the culture in vitro and reduce the time for obtaining micro-plants suitable for planting in non-sterile conditions. On average, 75.2% of explants capable of further cloning for the varieties were obtained. As a result of the research, the conditions and methods for obtaining the largest number of viable sterile strawberry explants were worked out, which will be included into the process of reproduction in vitro and further research. Key words: strawberry, in vitro, protocol of introduction, sterilizing agent, isolation period, viability.
Введение. Земляника садовая является одной из наиболее экономически значимых культур в современном ягодоводстве. Мировой объем производства ягод земляники увеличился до 9,1 млн. тонн на фоне увеличения посадочных площадей до 0,4 млн. га. Освоение современных технологий производства плодов и ягод невозможно без развития питомниководства, обеспечивающего стабильность и конкурентноспособность отрасли садоводства в целом [1]. Основными приемами интенсивной технологии возделывания земляники садовой является подбор высокопродуктивных сортов и выращивание оздоровленного от комплекса патогенов посадочного материала, что способствует повышению продуктивности агроценозов земляники в 3-5 раз и существенно снижает инвестиционные риски [2]. Россия довольно активно импортирует рассаду земляники, ввоз по данным статистики в 2018 году составил 17,7 млн. шт., что связано с недостатком собственного посадочного материала при росте площадей закладываемых земляничных плантаций.
Одним из путей значительного увеличения производства рассады земляники является микроклональное размножение, которое также способствует освобождению от болезней и вирусов. Ценность такого посадочного материала неизмеримо выше, чем вегетативно размножаемого. Маточные и промышленные насаждения, заложенные базисным и сертифицированным посадочным материалом, максимально реализуют свой генетический потенциал по сравнению с рядовым посадочным материалом [3]. Затраты, связанные с оздоровлением и доращиванием розеток, быстро окупаются за счет повышения выхода и качества рассады, а при закладке плодоносящих плантаций - за счет прибавки урожая [4].
В то же время, метод культуры тканей считается длительным и дорогостоящим. Несмотря на высокую эффективность, он требует для оздоровления сортов не менее 2,5 лет и значительных материальных затрат [5]. Поэтому актуальна разработка эффективных и воспроизводимых систем регенерации растений в системе in vitro.
Первичная культура in vitro определяет весь последующий технологический цикл клонального микроразмножения. Одними из основных факторов, влияющими на эффективность инициации культуры in vitro и ее дальнейшую стабилизацию, можно выделить: период изоляции меристем, сортовые особенности и тип стерилизующего агента.
Целью исследований была разработка эффективного протокола введения эксплантов земляники для ускоренного размножения в системе in vitro.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили на базе лаборатории биотехнологии ФГБНУ ВНИИСПК в 2017-2019 гг. В качестве растительных объектов были выбраны наиболее востребованные сорта земляники
садовой различного эколого-географического происхождения: Флоренс (Florence), Азия (Asia), Хоней (Honeoye), Дарселект (Darselect), Кимберли (Kimberly), Фрида (Frida), Мармелада (Marmolada), Берегиня, Царица, Урожайная ЦГЛ.
Исследовали три срока введения земляники в культуру: начало роста (февраль), активный рост (июнь), затухание роста (август). Исходным материалом для летних сроков введения служили розетки, заготовленные с вегетирующих растений непосредственно перед введением. В отличие от других плодовых и ягодных растений земляника не имеет ярко выраженного периода покоя, что можно использовать для нетрадиционной зимней изоляции эксплантов в культуру in vitro. Для зимнего введения розетки заготавливались в конце октября и после предварительной подготовки хранились в пластиковых пакетах в холодильной камере при температуре +1 -+2°С. Введение в культуру проводили с первыми признаками возобновления роста (выдвижением центрального листа и образованием молодых корешков).
Лабораторные исследования проводили по существующим методическим рекомендациям [6, 7].
В качестве стерилизующих агентов использовали мертиолят в концентрации 0,01% и сулему - 0,1% с экспозицией 10 минут. После стерилизации растительный материал трижды промывали стерильной дистиллированной водой. Для снятия фенольного окисления питательной среды и эксплантов проводили замачивание стерильного материала земляники в 0,3 % стерильном растворе аскорбиновой кислоты на весь период изоляции.
На этапе введения экспланты культивировали на среде Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962), дополненной 6-бензиламинопурином (БАП) - 0,5 мг/л.
Собственно микроразмножение проходило на питательной среде Мурасиге-Скуга на фоне 6-БАП 0,8 мг/л.
Культивировали экспланты при температуре 23 ± 10C, освещенности 2 тыс. люкс и фотопериоде 16 ч день/ 8 ч ночь.
Результаты и обсуждение. Основными факторами эффективного введения в культуру in vitro растительных объектов являются тип стерилизующего вещества и время обработки, сортовые особенности растения, возраст и качество растительного материала, сезон проведения работ. Полная стерильность растительного материала и быстрая стабилизация ростовых процессов -необходимые условия нормального развития эксплантов в культуре in vitro.
По результатам исследований, наибольшее количество стерильных эксплантов земляники было получено при обработке 0,1% раствором сулемы (табл. 1).
Таблица 1 - Влияние типа стерилизатора на выход стерильных жизнеспособных эксплантов земляники, 2017-2019 гг., %_
Показатели введения Начало роста (февраль) Активный рост (июнь) Затухание роста (август)
мертиолят сулема мертиолят сулема мертиолят сулема
Контаминация 18,1 11,6 14,8 4,0 12,0 7,6
Некроз 23,5 13,9 13,4 16,0 19,8 11,7
Жизнеспособность 58,4 74,8 71,8 80,0 68,2 80,7
Доля жизнеспособных эксплантов снижалась в основном за счет некроза растительных тканей у части объектов. При этом экспланты всех сроков введения при обработке 0,1% раствором сулемы отличались более высокой жизнеспособностью и меньшей контаминацией, чем при обработке 0,01%
раствором мертиолята. В среднем по сортам было получено 74,8-80,7% жизнеспособных эксплантов (табл. 2). На начальном этапе в среднем по сортам отмечали высокую приживаемость эксплантов независимо от срока введения в культуру. В то же время, отмечали существенное влияние генотипа (сортовых особенностей) на показатели приживаемости эксплантов.
Таблица 2 - Результативность введения земляники в культуру in vitro, 2017-2019 гг., %_
Сорт Показатели Срок введения
февраль июнь август
Флоренс контаминация 3,5 21,0 11,5
некроз 11,2 13,0 13,5
жизнеспособность 85,3 66,0 75,0
Хоней контаминация 9,0 4,4 6,0
некроз 10,8 26,9 6,0
жизнеспособность 82,2 68,7 88,0
Дарселект контаминация 20,3 0,0 2,0
некроз 21,9 4,0 7,0
жизнеспособность 57,8 96,0 91,0
Азия контаминация 6,9 14,7 9,0
некроз 6,9 7,3 10,5
жизнеспособность 86,2 78,0 80,5
Кимберли контаминация 16,0 2,0 5,5
некроз 16,0 36,0 12,5
жизнеспособность 68,0 62,0 82,0
Берегиня контаминация 14,0 2,0 12,0
некроз 4,0 36,0 23,0
жизнеспособность 82,0 62,0 65,0
Фрида контаминация 15,4 8,0 5,5
некроз 35,9 16,0 6,0
жизнеспособность 48,7 76,0 88,5
Мармелада контаминация 18,6 9,4 4,5
некроз 16,3 15,1 9,0
жизнеспособность 75,1 75,5 86,5
Царица контаминация 9,6 0,0 7,0
некроз 8,1 17,0 9,5
жизнеспособность 82,3 83,0 83,5
Урожайная ЦГЛ контаминация 6,6 4,0 13,0
некроз 11,2 16,0 19,5
жизнеспособность 82,2 80,0 67,5
В среднем по сортам контаминация 12,0 4,0 7,6
некроз 14,2 16,0 11,7
жизнеспособность 74,8 80,0 80,7
Проведенные исследования показали различную регенерационную активность эксплантов, изолированных в разные сроки вегетации: февраль -начало роста после хранения, июнь - активный рост, август - снижение ростовой активности. Скорость инициации меристематической ткани, приводящей к образованию из нее целых растений, зависит от темпов ее дифференциации. В то же время, количество эксплантов, пригодных к клонированию, не зависело от общего уровня регенерации. Стабилизация культуры при зимнем введении проходила значительно быстрее, чем в другие сроки. (табл. 3).
Таблица 3 - Регенерационная способность меристематических верхушек земляники
Срок введения Регенерировало через 2 месяца, % Средний балл развития
всего образовало розетку
февраль 75,8 75,2 4,2
июнь 80,0 39,5 2,6
август 80,7 28,9 2,2
При зимнем сроке введения через два месяца образовало розетку в среднем по сортам 75,2% введенных эксплантов. Микророзетки были интенсивно зелеными, хорошо развитыми, с 2-3-мя листьями (рис.).
а б в
Рисунок - Регенерационная способность микрорастений земляники при различных сроках введения: а) февраль, б) июнь, в) август
Средний балл развития составил 4,2 балла из 5. В летние сроки, несмотря на высокий выход стерильных эксплантов, к дальнейшему клонированию было пригодно лишь 28,9-39,5% эксплантов, введенных в культуру. Средний балл развития не превышал 2,6 балла. Коэффициент размножения в культуре in vitro в значительной мере определяется генотипом растений (табл. 4).
Таблица 4 - Высота растений и коэффициент размножения сортов земляники, 1 -ый пассаж
Фев раль Июнь Август
Сорта высота растений, мм коэффициент размножения, шт./эксплант высота растений, мм коэффициент размножения, шт./эксплант высота растений, мм коэффициент размножения, шт./эксплант
Царица 10,3±0,6 1,4±0,1 6,0±0,3 0,0 6,0±0,2 0,0
Флоренс 8,8±0,6 2,3±0,4 5,2±0,7 2,8±0,3 7,0±0,7 0,0
Азия 10,7±0,6 1,6±0,1 9,0±0,3 3,5±0,3 6,8±0,5 0,0
Урожайная ЦГЛ 12,0±0,8 1,5±0,2 9,0±0,3 1,3±0,2 6,0±0,6 1,1 ±0,2
Максимальную регенерационную способность в первом пассаже микроразмножения отмечали у сорта Флоренс зимнего и раннелетнего сроков введения (2,3 и 2,8 шт./эксплант) и сорта Азия раннелетнего срока введения (3,5 шт./эксплант). На первых этапах микроразмножения не образовали дополнительных розеток экспланты сортов Царица, Флоренс, Азия позднелетнего срока введения.
Таким образом, изменения в темпах роста и развития сортов на первых этапах микроразмножения зависели не только от генотипических особенностей, но и от времени изоляции. У микрорастений зимнего срока уже через три месяца после введения наблюдали не только пролиферацию, но и спонтанное образование корней. Растения имели хорошо развитую корневую систему и были пригодны к пересадке в нестерильные условия.
Выводы. Максимальный процент приживаемости эксплантов был получен при поверхностной стерилизации 0,1% раствором сулемы. На первом этапе микроразмножения экспланты имели высокую жизнеспособность во все сроки изоляции, приживаемость составила 74,8-80,7%. Использование зимнего срока изоляции эксплантов земляники позволило повысить выход эксплантов, способных к дальнейшему клонированию, ускорить стабилизацию культуры in vitro и сократить сроки получения микрорастений, пригодных для высадки в нестерильные условия. В среднем по сортам было получено 75,2% эксплантов, способных к дальнейшему клонированию.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Пронина И.Н., Матушкина О.В. Экономические аспекты использования клонального микроразмножения в системе производства посадочного материала плодовых и ягодных культур // Плодоводство и ягодоводство России. 2011. Т. 26. С. 82-88.
2. Козлова И.И. Система производства высокопродуктивной рассады земляники с программируемыми параметрами качества // Плодоводство и ягодоводство России. 2008. Т. 18. С. 183-187.
3. Технология выращивания высококачественного посадочного материала плодовых и ягодных растений / Ю.В. Трунов, A.B. Соловьев, И.И. Козлова [и др.]. Мичуринск: Изд. ООО «БИС», 2018. 246 с.
4. Стольникова Н.П. Культура земляники в Западной Сибири. ФГНУ «НИИС». Барнаул. 2014. 182 с.
5. Оздоровление сортов земляники садовой в коллекции ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии / В. Г. Толстогузова [и др.] // Плодоводство и ягодоводство России. 2010. Т.24. № 2. С. 119-126.
6. Атрощенко Г.П., Костицын В.В., Наделюев А.Л. Рекомендации по производству оздоровленного посадочного материала земляники. СПб., 2001. 15 с.
7. Джигадло E.H., Джигадло М.И., Голышкина Л.В. Методические рекомендации по использованию биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и декоративными культурами. Орел: ГНУ ВНИИСПК. 2005. 49 с.
REFERENCES
1. Pronina I.N., Matushkina O.V. Ekonomicheskie aspekty ispolzovaniya klonalnogo mikrorazmnozheniya v sisteme proizvodstva posadochnogo materiala plodovykh i yagodnykh kultur // Plodovodstvo i yagodovodstvo Rossii. 2011. T. 26. S. 82-88.
2. Kozlova I.I. Sistema proizvodstva vysokoproduktivnoy rassady zemlyaniki s programmiruemymi parametrami kachestva // Plodovodstvo i yagodovodstvo Rossii. 2008. T. 18. S. 183-187.
3. Tekhnologiya vyrashchivaniya vysokokachestvennogo posadochnogo materiala plodovykh i yagodnykh rasteniy / Yu.V. Trunov, A.V. Solovev, I.I. Kozlova [i dr.]. Michurinsk: Izd. OOO «BIS», 2018. 246 s.
4. Stolnikova N.P. Kultura zemlyaniki v Zapadnoy Sibiri. FGNU «NIIS». Barnaul. 2014. 182 s.
5. Ozdorovlenie sortov zemlyaniki sadovoy v kollektsii GNU VSTISP Rosselkhozakademii / V.G. Tolstoguzova [i dr.] // Plodovodstvo i yagodovodstvo Rossii. 2010. T.24. № 2. S. 119-126.
6. Atroshchenko G.P., Kostitsyn V.V., Nadelyuev A.L. Rekomendatsii po proizvodstvu ozdorovlennogo posadochnogo materiala zemlyaniki. SPb., 2001. 15 s.
7. Dzhigadlo Ye.N., Dzhigadlo M.I., Golyshkina L.V. Metodicheskie rekomendatsii po ispolzovaniyu biotekhnologicheskikh metodov v rabote s plodovymi, yagodnymi i dekorativnymi kulturami. Orel: GNU VNIISPK. 2005. 49 s.