CC BY
34
Разработка препаратов на основе трис(1-алкилиндол-3-ил)метана с целью преодоления лекарственной устойчивости возбудителен
A. С. ТРЕНИН*, С. Н. ЛАВРЕНОВ, E. П. МИРЧИНК, E. Б. ИСАКОВА, О. П. БЫЧКОВА, А. Ю. СИМОНОВ, С. А. ЛАКАТОШ, Е. А. ЦВИГУН
НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе, Москва
Compounds Based on Tris(1-alkylindol-3-yl)methan for Overcoming Drug Resistance in Pathogens
A. S. TRENIN, S. N. LAVRENOV, E. P. MIRCHINK, E. B. ISAKOVA, O. P. BYCHKOVA, A. Y. SIMONOV, S. A. LAKATOSH, E. A. TSVIGUN
Gause Institute of New Antibiotics, Moscow
Путём химического синтеза получены соли трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия — производные трис(1-алкилиндол-3-ил)метана, обладающие высокой антибактериальной и противогрибковой активностью. По своей активности в отношении грамположительных бактерий полученные соли практически не уступали левофлоксацину, а по активности в отношении дрожжей Candida albicans и грибов Aspergillus niger амфотерицину В. У ряда производных выявлена умеренная активность в отношении грамотрицательных бактерий. Антимикробная активность производных зависела в первую очередь от длины алкильных радикалов, практически не зависела от степени их разветвлённости и оказывалась максимальной при длине радикалов в четыре — пять атомов углерода. Производные трис(1-алкилиндол-3-ил)метана проявили чрезвычайно высокую активность (МПК 0,13—1,0 мкг/мл) как в отношении микроорганизмов, чувствительных к антибиотикам, так и в отношении штаммов, резистентных к лекарственным препаратам, в том числе в отношении клинических изолятов с множественной лекарственной устойчивостью. Наиболее активные соединения проявили активность in vivo в моделях стафилококкового и кандидозного сепсиса у мышеи. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности создания на основе трис(1-алкилиндол-3-ил)метана новых препаратов, способных к преодолению лекарственной устойчивости возбудителей.
Ключевые слова: антибактериальные и противогрибковые антибиотики, производные трис(1-алкилиндол-3-ил)метана, соли трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия, аналоги турбомицина А, множественная лекарственная устойчивость, антимикробная активность in vitro и in vivo, модель стафилококкового и кандидозного сепсиса у мышей.
Tris(1-alkylindol-3-yl)methylium salts that are tris(1-alkylindol-3-yl)methan derivatives with high antibacterial and antifungal activity were obtained through chemical synthesis. These salts were practically not inferior to levofloxacin in their activity against Grampositive bacteria and were almost as good as amphotericin B against yeast Candida albicans yeast or Aspergillus niger fungi. Several derivatives demonstrated moderate activity against Gram-negative bacteria. Antimicrobial activity of derivatives depended primarily on the length of their alkyl radicals, was maximal when radicals had four — five carbon atoms and practically did not practically depend on radical branching. Tris(1-alkylindol-3-yl)methan derivatives revealed an extremely high activity (MIC 0.13—1.0 ^g/ml) against bacteria that are sensitive to antibiotics and resistant strains, including multidrug-resistant clinical isolates. The most active compounds showed activity in vivo in staphylococcal and candida sepsis models in mice. These results testify to the prospects of the development of new drugs on the basis of tris(1-alkylindol-3-yl)methan capable to overcome drug resistance in pathogens.
Keywords: antibacterial and antifungal antibiotics, tris(1-alkylindol-3-yl)methan derivatives, tris(1-alkylindol-3-yl)methylium salts, turbomycin A analogues, antimicrobial activity in vitro and in vivo, multi drug resistance, staphylococcal and candida sepsis models in mice.
Введение
В связи с необходимостью создания препаратов, преодолевающих лекарственную устойчивость возбудителей инфекционных заболеваний,
© Коллектив авторов, 2017
Адрес для корреспонденции: 119021 Москва, Большая Пироговская, 11. НИИНА им. Г. Ф. Гаузе. E-mail: [email protected]
особое внимание исследователей обращено к новым классам химических соединений [1—3].
Разработанные нами ранее методы синтеза симметричных трис (1 -алкилиндол- 3 -ил)метанов с их последующим окислением позволили получить соли трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия [4], обладающие как высокой цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток, так и значительной антимикробной активностью в отношении бакте-
риальных и грибных тест-культур [5]. Являясь аналогами природного антибиотика турбомицина А, впервые выделенного в качестве продукта микробного метаболизма дрожжей Saccharomyces cere-visiae [6] и получаемого впоследствии с помощью метагеномного подхода при клонировании генетического материала, содержавшегося в образцах почвы [7—9], соли трис(1-алкилиндол-3-ил)мети-лия, получаемые в НИИНА им. Г. Ф. Гаузе путём химического синтеза, значительно превосходят исходный антибиотик как по спектру, так и по уровню своей биологической активности [5]. Изучение соединений этой группы, выявление присущих им закономерностей «структура—активность» и, соответственно, определение перспективных направлений дальнейшей химической модификации могут способствовать созданию новых лекарственных препаратов, в том числе преодолевающих лекарственную устойчивость.
С этой целью нами проведена дальнейшая химическая модификация соединений указанной группы. Полученные соли трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия были испытаны в отношении широкого набора бактериальных тест-культур, резистентных к применяемым в настоящее время химиотерапевтическим препаратам. Ряд соединений проявили высокую активность. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования соединений группы трис(1-алки-линдол-3-ил)метана для создания препаратов, преодолевающих лекарственную устойчивость.
Материал и методы
Получение и очистка солей трис(1-алкилиндол-3-ил)мети-лия, реактивы и материалы. Методы получения и очистки солей трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия описаны ранее [4, 5]. Тестированию подвергали растворы препаратов производных трисиндолилметилия в диметилсульфоксиде (ДМСО). Препаратами сравнения для оценки антимикробного действия тестируемых препаратов служили левофлоксацин («Белмедпре-параты РУП», Беларусь) и амфотерицин В («Sigma», США). В работе использовали одноразовые стерильные 96-луночные планшеты, Пан-Эко, Россия, пластиковые чашки Петри, пластиковые стерильные пипетки, пробирки (Пан-Эко, Россия), одноканальные и многоканальные дозаторы ВНИИ БП, Россия, фильтры Sterivex-GV 0,22 мкм (Millipore, США).
Для оценки микробных культур, имевших разную чувствительность к антибиотикам, использовали препараты антибиотиков отечественных и зарубежных компаний, а также антибиотики, полученные в НИИНА им. Г.Ф. Гаузе.
Микробные штаммы, питательные среды, условия культивирования. В работе использовали клинические изоляты бактерий, полученные из клиник и из музея штаммов Лаборатории проблем клинической микробиологии и контроля за госпитальными инфекциями ПМГМУ им. И. М. Сеченова, а также коллекционные штаммы грамположительных, грамот-рицательных бактерий и грибов. Клинические изоляты — Staphylococcus aureus 10, Staphylococcus aureus 3798, Staphylococcus epidermidis 533, Staphylococcus haemoliticus 602, Enterococcus faecalis 560, Enterococcus faecium 569; коллекционные культуры — Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 43300, Staphylococcus aureus ATCC 700699, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae
ATCC 13883, Salmonella cholerasuis ATCC 14028, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Candida albicans ATCC 14053, Aspergillus niger ATCC 16404.
Питательные среды для бактериальных штаммов: бульон и агар Мюллера—Хинтон готовили из сухих сред (Mueller Hinton broth and Mueller Hinton agar, Acumedia, Baltimore) и стерилизовали автоклавированием при 121°C в течение 15 мин. Для культивирования Staphylococcus spp., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella cholerasuis использовали готовую сухую среду — Триптиказо-соевый агар (Trypticase Soy Agar, BBL). При культивировании Enterococcus spp., Pseudomonas aeruginosa использовали готовую сухую среду — Колумбийский агар (Columbia Agar Base, BBL). Среды стерилизовали автоклавированием при 121°С в течение 15 мин.
Для культивирования дрожжей применяли агар Сабуро (пептон — 10 г, глюкоза — 40 г, агар — 20 г, дистилированная вода — 1 л, pH 6,0), при культивировании мицелиальных грибов использовали картофельно-глюкозный агар (картофель
— 200 г, глюкоза — 20 г, агар — 15 г, дистиллированная вода
— 1 л, pH 5,5—6,0), которые готовили из соответствующих ингредиентов и стерилизовали автоклавированием в течение 30 мин при 110°C, при 0,5 атм.
Необходимая для постановки опыта с грибами среда RPMI 1640 с L-глютамином, без бикарбоната натрия, была приготовлена из готовой сухой среды (ICN Biomedicals Inc., Ohio, USA) путём разведения в дистиллированной воде, последующего забуферивания с использованием 0,165 М мор-фолинпропансульфоновой кислоты (MOPS; ACROS ORGANICS, New Jersey, USA) и доведения кислотности среды до 7,0 добавлением 1 н раствора NaOH. Питательную среду RPMI 1640 стерилизовали фильтрацией под давлением через фильтры Sterivex-GV 0,22 мкм (Millipore, США).
Культуры бактерий выращивали на плотных питательных средах (триптиказо-соевый или Колумбийский агар) в течение 24 ч и хранили в виде скошенных столбиков при 4°С. Долгосрочное хранение бактериальных штаммов проводили при температуре -80°С в микропробирках, содержащих соответствующие готовые питательные среды, используемые для хранения микробных культур.
Культуры дрожжей C.albicans ATCC 14053 и грибов A.niger ATCC 16404 выращивали и хранили на плотных питательных средах (картофельный агар) в виде скошенных столбиков, залитых 50% раствором глицерина, при -70°С. Для краткосрочного хранения культуры помещали на агаровые скошенные столбики при -4°С. Дрожжи перед использованием в опыте выращивали на агаре Сабуро в течение 24 ч при 35°С для получения свежей культуры. Грибы перед использованием в опыте выращивали на картофельном агаре в течение 7 дней при 35°С для получения максимальной споруляции.
Определение антимикробной активности тестируемых соединений in vitro. Определение антибактериальной активности производили путём определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде Мюллера—Хинтон с использованием микрометода и 96-луночных стерильных планшетов [10]. Определение МПК испытуемых соединений в отношении культур дрожжей и мицелиальных грибов проводили методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде в соответствии с требованиями руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств [11], а также с требованиями Американского национального комитета клинических лабораторных стандартов [12, 13].
Определение антибактериальной активности in vitro. Для экспериментов по определению антибактериальной активности тестируемых соединений готовили инокулюм бактериальных культур, для чего использовали чистую суточную культуру грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, выращенных на соответствующих плотных питательных средах. В стерильном изотоническом растворе NaCl готовили взвесь микроорганизмов, доводя плотность инокулюма до 0,5
по стандарту МакФарланда (1,5x10s КОЕ/мл). Затем полученный инокулят разводили до концентрации 5x105 КОЕ/мл бульоном Мюллера—Хинтон и использовали в течение 15 мин после приготовления. Чистоту бактериальных штаммов контролировали путём высева на селективные среды и последующего микроскопирования [10].
Исходные растворы испытуемых соединений готовили в ДМСО в концентрации 1000 мкг/мл; полученный раствор затем разводили стерильной водой до концентрации 128 мкг/мл.
При постановке эксперимента в лунки каждого планшета вносили по 100 мкл бульона Мюллера—Хинтон; в первую лунку вносили испытуемое соединение в концентрации 128 мкг/мл в объёме 100 мкл и последовательным двукратным разведением доводили его концентрацию до 0,25 мкг/мл. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл заранее приготовленного инокулюма, что приводило к разведению концентрации изучаемых соединений в два раза. Каждый препарат в эксперименте титровали дважды. В качестве контроля включали лунки, не содержащие тестируемых веществ (контроль роста культуры). Кроме того, ставился контроль чистоты питательных сред и растворителей. Планшеты инкубировали в термостате при 36°С в течение 24 ч.
МПК определяли как минимальную концентрацию препарата, полностью предотвращающую рост тест-организма.
Определение противогрибковой активности in vitro. Для экспериментов по определению антифунгальной активности тестируемых соединений использовали культуру дрожжей C.albicans ATCC 14053 и культуру грибов A.niger ATCC 16404. Перед использованием в опыте дрожжи выращивали на агаре Сабуро при 35°С в течение 24 ч, а грибы — на картофельном агаре при 35°С в течение 7 дней. Непосредственно перед постановкой эксперимента по выявлению активности изучаемых препаратов готовили посевную суспензию (инокулят) тест-организмов.
Для приготовления инокулята использовали суспензию клеток дрожжей и суспензию спор грибов в стерильном физиологическом растворе (0,85 % NaCl), доводя её до определённой плотности. Оптическую плотность исходной суспензии дрожжей контролировали спектрофотометрически, добиваясь D=0,11 при длине волны 530 нм. Такую суспензию дрожжевых клеток разводили 1:1000 стандартной средой (RPMI 1640) для получения суспензии инокулюта, содержащего двукратную, по сравнению с опытом, концентрацию клеток. Конечная концентрация дрожжевых клеток в опыте составляла 1—5x103 клеток/мл.
Суспензию спор грибов подводили до оптической плотности 0,09—0,11 и разводили стандартной средой (RPMI 1640) в 100 раз. Конечная концентрация спор грибов в опыте составляла 0,4—5x104 клеток/мл. Количество клеток в инокуля-те проверяли путём высева на агар Сабуро и подсчёта выросших колоний.
Тестируемые вещества растворяли в ДМСО с начальной концентрацией 2000 мкг/мл и в том же растворителе готовили серии двукратных разведений от 2000 до 1,5 мкг/мл. Затем полученные растворы в ДМСО разводили в 50 раз в стандартной используемой для опыта среде RPMI 1640. При постановке опыта (т.е. при смешивании с инокулятом тест-микроорганизмов, приводившему к дальнейшему двукратному разведению) конечная концентрация растворителя снижалась до 1%. Все растворы тестируемых препаратов готовили непосредственно перед использованием. Препаратом сравнения служил амфотерицин В (Sigma, USA).
Эксперименты проводили в стерильных 96-луночных плоскодонных планшетах. Для этого в лунки каждого планшета вносили сначала по 100 мкл растворов серийных разведений тестируемых препаратов (среда RPMI 1640, содержание ДМСО-2%), а затем по 100 мкл раствора инокулята тест-культуры. Конечная концентрация препаратов в опыте после внесения микробных инокулятов составляла от 20 до 0,15 мкг/мл при концентрации растворителя (ДМСО) 1%. Каждый препарат в эксперименте присутствовал не менее, чем в трёх повторах. В
панель эксперимента в качестве контроля включали лунки, не содержащие тестируемых препаратов или растворителя.
Планшеты инкубировали при 35°С. Оценку роста культур проводили визуально. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) противогрибковых препаратов считывали через 24 ч культивирования для C.albicans и 48 ч культивирования для A.niger. МПК определяли как минимальную концентрацию препарата, полностью предотвращающую рост тест-организма.
Определение антимикробной активности тестируемых соединений in vivo. Определение активности соединений in vivo проводили с использованием модели микробного сепсиса у мышей, заражённых либо культурой золотистого стафилококка, либо культурой дрожжей C.albicans.
Модель стафилококкового сепсиса мышей. Мышей колонии SHK массой 18—20 г, полученных из Центрального питомника РАМН «Крюково», инфицировали внутривенно культурой S.aureus №10 (клинический изолят). Учёт гибели мышей проводили ежедневно в течение 10 дней. Первоначально определяли летальную дозу (LD100) стафилококка, необходимую для гибели всех животных данной линии мышей при внутривенном пути заражения. Затем с помощью стафилококка, взятого в летальной дозе, определяли дозу препарата, способствующую выживанию половины животных (ED50). Для этого мышей разделяли на несколько групп по 10 животных в каждой и через 1 ч после заражения животным, заражённым летальной дозой стафилококка, перорально вводили испытуемый препарат в различных дозах и кратности введения. Одну группу мышей, заражённых летальной дозой стафилококка оставляли без лечения (контрольная группа). Учёт гибели животных проводили ежедневно в течение 10 дней. ED50 испытуемого препарата определяли по гибели животных, используя метод Баренса (накопления частот) [14].
Модель кандидозного сепсиса мышей. Использовали метод, описанный ранее [15]. Мышей колонии Balb/c массой 20—22 г, полученных из Центрального питомника РАМН «Крюково», содержали в виварии Института на стандартном рационе брикетированных кормов со свободным доступом к питьевой воде. После двухнедельного карантина здоровые животные использовались в экспериментальной работе. В качестве инфекционного агента использовали дрожжевую культуру C.albicans АТСС 14053. Растворы испытуемого препарата готовили ex tempore.
Мышей рассаживали в клетки по 4 шт. и заражали внутривенно культурой C.albicans (0,1 мл) в дозе 1,0 млн КОЕ на мышь. Через 30 мин после заражения мышам проводили первое внутривенное введение испытуемого препарата в соответствующей дозе и кратности в объёме 0,2 мл (скорость введения 0,2 мл/30 с).
В опыте присутствовала группа не лечённых, заражённых C.albicans животных. Также присутствовала группа «плацебо», т.е. интактных не заражённых животных, которым внутривенно (в том же объёме что и лечебные препараты) вводили 0,2 мл физиологического раствора.
На 4-й день опыта мышей умерщвляли путём шейной дислокации. Затем в стерильных условиях животных из каждой группы вскрывали, брали почки, взвешивали, растирали в фарфоровых ступках со стерильным корундом, делали разведения полученных суспензий и высевали на чашки Петри с агаром Сабуро. Инкубацию проводили 24 ч при температуре 35°С, после чего подсчитывали выросшие колонии C.albi-cans и проводили пересчёт их количества на 1 г ткани почек. Полученные данные после математической обработки вносили в таблицу.
Статистическая обработка результатов исследований проводилась с использованием компьютерных программ Statgraf и Microsoft Ехсе1, рассчитывали средние арифметические значения, доверительные интервалы и стандартное отклонение. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента (/><0,05).
Таблица 1. Структура производных трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия 1a — h
Соединение
R
Название заместителя
М.м
1a 1b 1c
1d
1e
1f
-CH2CH2CH3 -CH2CH2CH2CH3 ■CHCH2CH3 CH3
-CH2(CH2)3CH3 -CH2(CH2)3CH3
/CH3 -CH2CH2CH.
4
n-пропил n -бутил втор-бутил
n-пентил n-пентил
изоамил
486.7
528.8
528.8
665.9 606,3
665,9
CH3
1g 1h
-CH2-
-ch2ch2ch2-n
©/ CH3
CL
H4CH3 e
бензил 725,9
Л?-диметиламинопропил гидрохлорид 618,9
Результаты и обсуждение
Ранее соединения трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия показали высокую антимикробную активность, главным образом, в отношении грамположительных бактерий, грибов, а также выраженную цитотоксическую активность в отношении линий опухолевых клеток [5]. Активность соединений сильно зависела от длины ал-кильной цепи в заместителе (радикал Я) в трииндолилметильных группировках и возрастала с увеличением числа атомов углерода в алкиль-ных цепях до четырех — пяти. Поскольку дальнейшее удлинение радикала сопровождалось уменьшением и резким падением биологической активности производных, в проводимых нами дальнейших химических модификациях была поставлена цель — использовать относительно небольшие радикалы, содержащие не более шести атомов углерода. В отличие от синтезированных ранее производных вновь синтезированные соединения обладали, в основном, разветвлёнными радикалами, или, вместо индольных, имели 7-азаиндольные циклы (табл. 1, рисунок). Ранее отдельные производные трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия проявили себя в тест-системах, широко используемых нами для отбора противоопухолевых антибиотиков [16, 17].
Было целесообразно оценить антимикробную активность новых производных, в том числе их активность в отношении бактериальных штам-
Структура производного 1i
мов, обладающих резистентностью к антибиотикам, сравнить с активностью других ранее синтезированных соединений и определить действие производных (как новых, так и полученных прежде) на штаммы, обладающие множественной лекарственной устойчивостью. Кроме того было целесообразно оценить действие наиболее активных соединений в экспериментах in vivo.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Таблица 2. Антимикробная активность производных трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия 1a — g
Соединение МПК, мкг/мл
S.aureus S.aureus S.aureus S.aureus S.epi- S.haemo- E.faeca- E.fae- E.coli K.pneu- S.chole- P.aeru- C.albi- A.niger
ATCC (GISA) ATCC ATCC dermidis liticus lis 560 cium 569 ATCC moniae rasuis ginosa cans ATCC
25923 3798 43300 700699 533 602 (GRE) (GRE) 25922 ATCC ATCC АТСС ATCC 16404
(MRSA) 13883 14028 27853 14053
Контроль 0,25 32,0 0,25 16,0 0,5 0,5 0,5 1,0 0,06 0,25 0,13 1,0 1,0 1,0
(Лф) (Лф) (Лф) (Лф) (Лф) (Лф) (Лф) (Лф) (Лф) (Лф) (Лф) (Лф) (АмВ) (АмВ)
1a — 0,5 — — 0,25 0,5 1,0 1,0 8,0 — 16,0 32,0 1,0 2,0
1b 0,13 0,5 0,13 1,0 0,25 0,5 0,5 0,5 4,0 4,0 16,0 4,0 1,0 1,0
1c 0,13 0,13 0,13 0,13 0,13 0,25 — 0,25 8,0 16,0 16,0 8,0 1,0 2,0
1d 0,25 1,0 0,25 0,5 1,0 1,0 2,0 2,0 8,0 8,0 4,0 8,0 1,0 1,0
1e 0,25 0,25 1,0 0,5 0,13 0,5 0,13 0,13 >64,0 >64,0 >64,0 >64,0 1,0 1,0
1f 0,13 0,13 0,13 >64,0 0,13 0,13 0,13 0,5 >64,0 >64,0 >64,0 >64,0 1,0 1,0
1g 1,0 2,0 0,25 1,0 1,0 1,0 2,0 1,0 >64,0 >64,0 >64,0 >64,0 2,0 2,0
Примечание. МПК - минимальная подавляющая концентрация; Лф - левофлоксацин (для бактерий); АмВ -амфотерицин В (для грибов).
Антимикробная активность производных трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия была изучена в отношении коллекционных штаммов и клинических изолятов грамположигельных и грамотри-цательных бактерий, а также в отношении коллекционных штаммов грибов (табл. 2). Препаратами сравнения для оценки антибактериальной и противогрибковой активности испытуемых соединений служили антибактериальный фторхинолоновый антибиотик третьего поколения левофлоксацин и полиеновый противогрибковый антибиотик амфотерицин В.
Анализ антимикробной активности проводился как в отношении штаммов, полностью чувствительных к существующим антибиотикам (S.aureus ATCC 25923), так и штаммов, обладающих резистентностью к различным препаратам. Среди последних были культуры, устойчивые как к отдельным препаратам, например, S.epidermidis 533, резистентный только к гентамицину, так и штаммы, обладающие устойчивостью к нескольким антибиотикам одновременно. Например, коллекционная культура S.aureus ATCC 43300 обладает устойчивостью к пенициллинам и цефало-споринам и является, таким образом, метицил-линорезистентным штаммом золотистого стафилококка (MRSA). Клинический изолят S.aureus 3798 проявляет резистентность не только к пенициллинам и цефалоспоринам, но также к целому ряду других антибиотиков. Кроме того, он демонстрирует промежуточную чувствительность к гликопептидным антибиотикам (группа GISA). Подобно штамму S.aureus ATCC 700699, он устойчив также к фторхинолоновому антибиотику ципрофлоксацину.
Полирезистентные штаммы энтерококков E.faecalis 560 и E.faecium 569 обладают устойчивостью к цефалоспоринам, гентамицину, а также к ванкомицину, т.е являются гликопептидорезис-тентными энтерококками (GRE).
Кроме того, в качестве тест-культур были использованы полирезистентные штаммы грамот-рицательных бактерий Е.соН АТСС 25922, К.рпеи-тотае АТСС 13883, БхИокпизик АТСС 14028, Р.аеги^1по5а АТСС 27853, а также коллекционные культуры дрожжей С.аШсат АТСС 14053 и грибов А^ег АТСС 16404.
Все приведённые в табл. 2 производные обладают выраженной активностью в отношении грамположигельных бактерий и грибов — дрожжевой культуры С.аШсат АТСС 14053 и грибной культуры А^ег АТСС 16404. По действию на грибы они практически не уступают амфотерицину В.
Ряд производных (1Ь —1ф активны не только в отношении грамположительных, но также в отношении грамотрицательных бактерий, правда в этом отношении они значительно уступают лево-флоксацину.
Важно отметить, что представленные производные 1а — ^ чрезвычайно активны в отношении бактерий, обладающих множественной лекарственной устойчивостью.
Активность двух солей п-пентильных производных трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия — Ы и 1е немного различается: метилсульфонатная соль Ы проявляет несколько меньшую активность по сравнению с хлоридом в действии на грамполо-жительные бактерии, но вместе с тем, большую в действии на грамотрицательные бактерии, хотя, в целом, с учётом относительно невысокой активности в отношении грамотрицательных бактерий, указанные различия, по-видимому, не следует признавать существенными.
Производные с разветвлёнными радикалами — втор-бутильное (1с) и изоамильное (11) практически не уступают соответствующим производным 1Ь и 1е, имеющим прямые алкильные радикалы с аналогичным числом атомов углерода.
М-диметил аминопропильное производное 1Ь (см. табл. 1), имеющее в своей структуре также
разветвлённые радикалы, было полностью неактивным, что, возможно, объясняется как введением в состав радикалов атомов азота, так и общим удлинением радикалов, затрудняющим вращение индольных колец относительно оси (hub) и, таким образом, преобладанием конфор-маций, не способных к эффективному взаимодействию с внутриклеточной мишенью.
Лишенным антимикробной активности оказалось также производное 1i (рисунок), имеющее n-пентильные радикалы, характерные для самых активных производных, но, вместе с тем, обладающее серьёзным изменением в структуре индоль-ных колец, состоящим в замещении одного из атомов углерода на атом азота в структуре каждого кольца. Утрата активности у таких производных свидетельствует о значительной роли индо-льных циклов в общей структуре производных трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия и их необходимости для максимального проявления биологической активности рассматриваемой группы соединений.
Два соединения — n-бутильное (1b) и n-пен-тильное (1e) производные, проявившие наибольшую активность в экспериментах in vitro, были испытаны в модельных экспериментах на животных при внутривенном введении мышам.
При стафилококковом сепсисе мышей оба соединения способствовали снижению смертности животных на 20%. Соединение 1b показало свою эффективность при однократном введении в дозах 4,5 и 5,5 мг/кг, а соединение 1e было наиболее эффективным при 5-кратном введении в дозе 0,5 мг/кг.
Испытание соединения 1e в модели кандидоз-ного сепсиса мышей показало, что при его 4-кратном введении в дозе 0,25, 0,5 и 1,0 мкг/кг наблюдается достоверное снижение количества клеток возбудителя C.albicans в почечной ткани заражённых животных. Наблюдаемый эффект имел
ЛИТЕРАТУРА
1. Тренин А.С. Методология поиска новых антибиотиков: состояние и перспективы. Антибиотики и химиотер 2015; 60: 7—8: 34—46. / Trenin A.S. Metodologija poiska novykh antibiotikov: sostojanie i perspek-tivy. Antibiotiki i khimioter 2015; 60: 7—8: 34—46. [in Russian]
2. Shallcross L.J., Davies S.C. The World Health Assembly resolution on antimicrobial resistance. JAntimicrob Chemother2014; 69: 11: 2883—2885.
3. Sunazuka T, Hirose T, Omura S. Efficient total synthesis of novel bioac-tive microbial metabolites. Acc Chem Res 2008; 41: 2: 302—314.
4. Lavrenov S.N., Luzikov Y.N., Bykov E.E. et al. Synthesis and cytotoxic potency of novel tris(1-alkylindol-3-yl)methylium salts: role of N-alkyl substituents. Bioorg Med Chem 2010; 18: 18: 6905—6913.
5. Степанова E.B., Штиль A.A., Лавренов С.Н. и др. Соли трис(1-алки-линдол-3-ил)метилия — новый класс противоопухолевых соединений. Известия Академии наук. Серия хим 2010; 12: 1—9. / Stepanova E.V., Shttil'A.A., Lavrenov S.N. i dr. Soli tris(1-alkilindol-3-il)metilija — novyj klass protivoopukholevykh soedinenij. Izvestija Akademii nauk. Serija khim 2010; 12: 1—9. [in Russian]
6. Budzikiwicz H, Eckau H, Ehrenberg M. Bis (3-indolyl-)-3Hindolyliden-methan, ein von Saccharomyces cerevisiae Gebildeter Farbstoff. Tetrahedron Lett 1972; 36: 3807—3810.
7. Gillespie D.E., Brady S.F., Bettermann A.D. et al. Isolation of antibiotics turbomycin A and B from a metagenomic library of soil microbial DNA. Appl Environ Microbiol 2002; 68: 9: 4301—4306.
дозозависимый характер и был максимальным при введении препарата в дозе 1 мг/кг в течение 4 суток.
Таким образом, испытание солей трис(1-ал-килиндол-3-ил)метилия показало наличие у них антимикробного эффекта in vivo.
Выводы
1. Путём химического синтеза получены соли трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия — производные трис(1-алкилиндол-3-ил)метана, обладающие высокой антимикробной активностью и по своему действию в отношении грамположительных бактерий практически не уступающие левофлоксаци-ну, а по противогрибковой активности — амфоте-рицину В. Отдельные производные обладают умеренной активностью в отношении грамотри-цательных бактерий.
2. Антимикробная активность производных зависит от длины алкильных радикалов и практически не зависит от степени их разветвлённости.
3. Наиболее активные соединения с длиной алкильных радикалов в четыре и пять атомов проявили себя в моделях стафилококкового и канди-дозного сепсиса у мышей, подтверждая наличие у них антимикробного действия in vivo.
4. Полученные производные чрезвычайно высокоактивны в отношении бактериальных штаммов, резистентных к антибиотикам, в том числе в отношении клинических изолятов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью, что свидетельствует о перспективности соединений на основе трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия в создании препаратов, способных к преодолению лекарственной устойчивости.
Благодарности.
Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда (проект №16-15-10300).
8. Handelsman J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev 2004; 68: 4: 669—685.
9. Brady S.F., Simmons L, Kim J.H, Schmidt E.W. Metagenomic approaches to natural products from free-living and symbiotic organisms. Nat Prod Rep 2009; 26: 11: 1488—1503.
10. Рекомендации Национального Комитета Клинических Лабораторных Стандартов США (NCCLS). NCCLS Reference Method for Broth Dilution Antibacterial Susceptibility Testing, USA 2000. / Rekomendacii Nacional'nogo Komiteta Klinicheskikh Laboratornykh Standartov SShA (NCCLS). NCCLS Reference Method for Broth Dilution Antibacterial Susceptibility Testing, USA 2000. [in Russian]
11. Кубанова A.A., СтепановаЖ.В., Гусъкова T.A., Пушкина Т.В., Крылова Л.Ю., Шилова И.Б., Тренин А.С. Методические указания по изучению противогрибковой активности фармакологических веществ. В кн.: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 1. / Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К, 2012; 944. / Kubanova A.A., Stepanova Zh.V, Guskova T.A., Pushkina T.V., Krylova L.Ju, Shilova IB, Trenin A.S. Metodicheskie ukazanija po izucheniju protivogribkovoj aktivnosti far-makologicheskikh veshhestv. V kn.: Rukovodstvo po provedeniju dok-linicheskikh issledovanij lekarstvennykh sredstv. Chast' 1. / Pod red. A.N. Mironova. M.: Grif i K, 2012; 944. [in Russian]
12. Clinical and laboratory standards institute: Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. In Third International Supplement CLSI M27-S3. Clinical and Laboratory Standards Institute. Pensylvania. 2013.
13. Clinical and laboratory standards institute: Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. In approved standart. 2nd ed CLSI M38-A2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Pensylvania. 2008.
14. Беленький М.Л.Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Ленинград: Медгиз, 1963; 45—49. / Belen'kij M.L. Jelementy kolichestvennoj ocenki farmakologicheskogo jeffekta. Leningrad: Medgiz, 1963; 45—49. [in Russian]
15. Brautaset T, Sletta H, Nedal A., et al. Improved antifungal polyene macrolides via engineering of the nystatin biosynthetic genes in Streptomyces noursei. Chem Biol 2008 Nov 24; 15: 11: 1198—1206.
16. Тренин A.C. Микробная модель Halobacterium salinarum для поиска ингибиторов биосинтеза стеролов. Антибиотики и химиотер 2013;
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Тренин Алексей Сергеевич — д.б.н., заведующий лабораторией Разработки методов поиска биологически активных соединений ФГБНУ «НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе» (ФГБНУ «НИИНА»), Москва Лавренов Сергей Николаевич — к.х.н., старший научный сотрудник лаборатории химической трансформации антибиотиков ФГБНУ «НИИНА», Москва Мирчинк Елена Павловна — д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории фармакологии и химиотерапии ФГБНУ «НИИНА», Москва
Исакова Елена Борисовна — научный сотрудник лаборатории фармакологии и химиотерапии ФГБНУ «НИИНА», Москва
58: 5—6: 3—10. / Trenin A.S. Mikrobnaja model' Halobacterium salinarum dlja poiska ingibitorov biosinteza sterolov. Antibiotiki i khimioter 2013; 58: 5—6: 3—10. [in Russian] 17. Тренин A.C., Цвигун Е.А., Бычкова О.П., Лавренов С.Н. Микробная модель Halobacterium salinarum в отборе синтетических аналогов антибиотика турбомицина А, обладающих противоопухолевым действием. Антибиотики и химиотер 2013; 58: 9—10: 3—7. / Trenin A.S., Tsvigun E.A., Bychkova O.P., Lavrenov S.N. Mikrobnaja model' Halobacterium salinarum v otbore sinteticheskikh analogov antibiotika tur-bomicina A, obladajushhikh protivoopukholevym dejstviem. Antibiotiki i khimioter 2013; 58: 9—10: 3—7. [in Russian]
Бычкова Ольга Петровна — к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории Разработки методов поиска биологически активных соединений ФГБНУ «НИИНА», Москва Симонов Александр Юрьевич — к.х.н., научный сотрудник лаборатории химической трансформации антибиотиков ФГБНУ «НИИНА»
Лакатош Сергей Александрович — к.х.н., старший научный сотрудник лаборатории химической трансформации антибиотиков ФГБНУ «НИИНА», Москва Цвигун Елена Анатольевна — научный сотрудник лаборатории Разработки методов поиска биологически активных соединений ФГБНУ «НИИНА», Москва
