CC BY
203
Медицинская иммунология 2001, Т. 3, № 3, стр 369-378 ©2001, СПбРОРААКИ
Обзоры
РАЗРАБОТКА ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ЦИТОКИНОВ
Масычева В.И., Пустошилова Н.М., Даниленко Е.Д.
Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии “Вектор”
Резюме. Авторами рассмотрены основные тенденции развития фармацевтики, выделено одно из наиболее перспективных направлений биотехнологии, направленное на использование в качестве лекарственных веществ естественных компонентов организма с известной биологической активностью. В статье представлены результаты научно-исследовательских работ по разработке технологии получения, экспериментального и клинического изучения биологических свойств рекомбинантных белков-цитокинов человека (TNF-a, TNF-P, IFN-y, G-CSF), их мутантных вариантов и композиционных форм. Показано, что использование новых методических подходов, основанное на достижениях генной инженерии, позволяет получать препараты нового поколения, улучшенные варианты природных белков, отличающиеся высокой терапевтической активностью и безвредностью, а также оптимизировать процессы их выделения и очистки.
Ключевые слова: биотехнология, рекомбинантные цитокины, структурная модификация.
Masycheva V.I., Pustoshilova N.M., Danilenko E.D.
THE DEVELOPMENT OF THE PREPARATIONS BASED ON RECOMBINANT CYTOKINES
Abstract. The main tendencies for the development of pharmaceutics have been considered. One of the most promising trends aimed at using natural components of the organism with known biological activity as drugs has been determined. The data on the technology for production of recombinant proteins, human cytokines (TNF-a, TNF-P, IFN-y, G-CSF), their mutant forms and compositions as well as the data on their experimental and clinical studies have been presented. It has been shown that the use of new approaches based on gene engineering achievements makes it possible to obtain the preparations of a new generation and the improved variants of natural proteins distinguished by high therapeutic activity. Also it is possible to optimize the processes of their isolation and purification. (Med.Immunol., 2001, vol.3, N3,pp 369-378)
та, которая в 50-е годы равнялась 5-7 млн долларов, к концу тысячелетия увеличилась до 500 млн долларов, при этом на долю скрининга и изучения физико-химических и фармакологических свойств биологически активных веществ приходится около 50% затрат [2].
В настоящее время лекарство рассматривается как один из важнейших регуляторов качества жизни. Поэтому высокая эффективность и безопасность являются необходимыми критериями качества препарата. С этой точки зрения традиционные подходы к созданию лекарственных средств путем, например, химического синтеза почти исчерпаны. Одно из современных представлений о лекарствах включает принцип адаптированности к человеческому организму. Согласно этому принципу, наиболее предпочтительными средствами лечения являются естественные компоненты организма с известной биологической активностью. К ним можно отнести природные регуляторы, такие, как цитокины, гормоны, факторы роста, ферменты, нуклеиновые кислоты.
Вопросам создания новых эффективных лекарственных средств в современной фармакологии уделяется большое внимание. Это обусловлено увеличением частоты известных и появлением новых заболеваний, число различных нозологических форм которых в настоящее время превышает 10 тысяч. Вместе с тем, расходы на научные исследования в области создания новых оригинальных лекарственных препаратов стабильно растут, что обусловлено как нередко недостаточной эффективностью существующих лечебных средств, так и высокой вариа-бильиостью возбудителей инфекции. По существующим данным, стоимость создания нового препара-
Адрес для переписки:
Масычева Валентина Ивановна НИКТИБАВ ГНЦ ВБ “Вектор" г. Бердск Новосибирской области, ГУС а/я 112, НИКТИ БАВ.
Тел.: (38341)5-19-60, факс (38341)5-28-21,
E-mail: nb@onlinesinor.ru
Поэтому разработка способов получения и использование таких веществ в качестве субстанций будущих лекарственных средств является весьма привлекательным и обоснованным подходом к созданию новых препаратов.
Интенсивное развитие биотехнологии, генной и клеточной инженерии во всем мире позволило претворить эти идеи в жизнь и вывести на фармацевтический рынок ряд принципиально новых лекарственных средств. Биотехнология является молодой, но быстро развивающейся ветвью фармации.
В развитых странах это наиболее капиталоемкая отрасль фармацевтических исследований. Например, в Японии, занимающей второе место после США по развитию биотехнологии, на долю лекарственных средств, получаемых методами генной инженерии и биотехнологии, приходится 50% всех раз-
работок, зарегистрированных в этой стране. В различных проектах по генетической инженерии принимают участие 129 фирм. В перечень новых лекарственных препаратов входят белковые продукты, обладающие противовирусной, иммуномодулирующей, противоопухолевой активностью, влиянием на сердечно-сосудистую и эндокринную системы (эрит-ропоэтин, интерферон-альфа 2а, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, активатор тканевого плазминогена, моноклональные антитела, вакцины против гепатита, фактор некроза опухолей и т.д.). В 1995 году на стадии клинического изучения находилось более 100 препаратов, полученных таким способом.
В США расходы на научно-исследовательские работы в области биотехнологии составили 43% общего объема продаж и в пересчете на одного занятого в
Табл.1. МИРОВОЙ РЫНОК РЕКОМБИНАНТНЫХ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОДУКТОВ В 1998 г. (Ремедиум, 1999, №11)
Химическое название/МНН Патентованное название, страна-разработчик Показания к применению Объем продаж, млн долл.
Эритропоэтин EP0GEN (США) PR0CRIT (США) ЭПОКРИН (Россия) Анемия/диализ 2 743,0
Инсулин HUMAL0G (США) HUMULIN (США) Диабет 1 188,8
Филграстим (G-CSF) NEUP0GEN, США Нейтропения 1 120,0
Соматотропин GEN0TR0PIN, HUMATR0PE, Нарушение роста 965,9
NUTROPIN, SAIZEN, SER0STIM (США) Истощение при СПИДе 88,2
Интерферон-а INTR0N-A (США) R0FER0N-A (США) Рак и вирусные инфекции 719,0 241,3
РЕАФЕРОН (Россия) Волосато-клеточный Г)
РЕКОЛИН (Россия) лейкоз и гепатит С (*)
И нтерферон - (3 AV0NEX (США) Рассеянный склероз 394,9
Альдеслейкин (IL-2) PROLEUKIN (США) РОНКЛЕЙКИН (Россия) Карцинома почек 93,0 (*)
Сарграмостим (GM-CSF) LEUKINE (США) Регенерация спинного мозга 63,8
Молграмостим (GM-CSF) LEUC0MAX (США) Нейтропения 52,4
Интерлейкин-11 NEUMEGA (США) Тромбоцитопении 49,0
Интерферон-у ACTIMMUNE (США) Хронический грануломатоз 3,9
Интерлейкин-1Р БЕТАЛЕЙКИН (Россия) Онкологические заболевания Г)
(*) - Информация об объемах продаж препаратов производства российских фирм отсутствует.
этой области специалиста пр звысили 68000 долларов по сравнению с 7500 долларов в других отраслях промышленности. В 1997 году на различных стадиях разработки находилось 234 новых продукта: для лечения рака-70, колониестимулирующие факторы -4, факторы роста -И, эритропоэтин -1, интерлейкины -13, фактор некроза опухоли -1, человеческий гормон роста -7, рекомбинантные растворимые рецепторы - 4, моноклональные антитела - 69, медицинские вакцины - 43, препараты для генной терапии - 17.
Предполагается, что объем продаж препаратов, полученных методами генной инженерни и биотехнологии, в 2004 году в мире составит 15,8 млрд долларов. Как можно видеть из таблицы 1, наиболее хорошо реализуемыми являются группы сердечно-со-судистых, противоопухолевых средств и препаратов-стимуляторов гемопоэза, такие, как эритропоэтин и в-СЭР, на долю продаж которых падает более 35% продаж (по объему) лекарственных средств.
Представленные данные свидетельствуют о том, что возможности биотехнологии в сфере создания препаратов нового поколения чрезвычайно высоки, лекарственные средства пользуются большим спросом и востребованы обществом, и этот путь является стратегическим в развитии фармацевтической науки. В настоящее время в этой сфере наметились новые подходы по дальнейшему совершенствованию биологически активных субстанций, которые заключаются в возможности целенаправленного изменения структуры молекулы, ее активных центров в целях снижения побочного действия, повышения биодоступности и усиления исходных фармакологических свойств.
В НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ “Вектор” в течение ряда лет проводятся научно-исследовательские работы, посвященные созданию лечебных препаратов, действующим началом которых являются рекомбинантные цитокины. Основной акцент исследований направлен на цитокины, значение которых для коррекции патологических состояний и роль в организме в настоящее время общеизвестны. К ним относятся факторы некроза опухолей альфа и бета (ТОТ-а, Т№-Р), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-СБР), интерферон гамма (1Р1ч[-у). В таблицах 2 и 3 приведены сведения о состоянии разработок медицинских препаратов на основе данных генно-инженерных белков и характеристика их штаммов - продуцентов.
Описывая современное состояние дел в сфере создания препаратов на основе рекомбинантных белков, следует отметить, что в качестве субстанций лекарственных средств используются либо полноразмерные белки, молекула которых практически идентична природному варианту, либо белки с измененной структурой, полученные путем направленного мутагенеза. Результаты таких исследований можно продемонстрировать на примере представителей семейства факторов некроза опухолей.
В настоящее время в разных странах мира ведутся работы по созданию противоопухолевого препарата на основе TNF-a [17,22]. Результатом подобных исследований, проведенных в нашем институте совместно с рядом отечественных институтов клиник, является разработка технологии получения рекомбинантного TNF-a и его лекарственной формы, препарата альнорин, согласование экспериментальнопроизводственных регламентов и проектов ВФС, завершение доклинических и I фазы клинических испытаний [1,10].
Данные, приведенные в таблице 4, свидетельствуют о том, что TNF-a обладал высокой цитолитичес-кой активностью, которая проявлялась как в культуре клеток, так и in vivo в условиях разных опухолевых моделей.
В ходе клинических испытаний препарата была установлена максимально переносимая доза. Спектр побочных эффектов, отмеченных при введении альнорина (озноб, гипертермия, головная боль), в основном соответствовал описанному в литературе [21]. Вместе с тем, препарат не оказывал гипотонического действия, не приводил к изменению показателей печеночных и почечных проб, не вызывал местных кожных реакций. Эти отличия в картине токсического воздействия альнорина, на наш взгляд, могут быть связаны с тем, что TNF-a, полученный в НИКТИ БАВ, в отличие от его зарубежных аналогов, представляет собой белок, на N - конце которого отсутствуют 4 аминокислоты. Следовательно, эти данные свидетельствуют о перспективности использования подобного модифи-кационного подхода для создания новых фармакологических средств.
Тем не менее, наличие широкого спектра выраженных побочных эффектов существенно сдерживает внедрение препаратов на основе TNF-a в широкую клиническую практику. С целыо их преодоления и создания препарата с улучшенными биологическими свойствами в ГНЦ ВБ “Вектор” в течение ряда лет ведутся работы по модификации молекулы TNF-a. В последние годы сотрудниками Центра совместно со специалистами Института биоорганичес-кой химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН методом сайт-направленного мутагенеза были получены два новых структурных аналога TNF-a. Один из них отличался делецией 4 аминокислотных остатков на N-концевом участке молекулы и заменой аргинина в 31 положении на глицин (R31Q )[5], второй - делецией 2 N-концевых аминокислотных остатков и заменой аргинина в 32 положении на гистидин (R32H) [14]. Установлено, что произведенные модификации структуры молекулы не отразились на интенсивности биосинтеза рекомбинантных белков и их выходе в процессе очистки, однако привели к изменению биологических свойств.
Табл.2. ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ О ПРЕПАРАТАХ, РАЗРАБАТЫВАЕМЫХ В ГНЦ ВБ “ВЕКТОР”.
Наименование препарата Область применения Разработчики Патенты Стадия разработки
Альнорин (рекомбинантный Т^-а человека) Комплексная терапия солидных опухолей различной локализации. Форма выпуска -лиофилизированный стерильный порошок в ампулах НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ “Вектор”, ИБХ им.М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Институт инженерной иммунологии РАО “Биопрепарат” Патент РФ №2144958 Патент РФ №2158303 Товарный знак №135253, №135254 Разработаны проекты ФСПи ЭПР на субстанцию и лекформу, проведены доклинические исследования и I фаза клинических испытаний. Проводится II фаза клинических испытаний как противоопухолевого средства на базах РОНЦ и МНИОИ им. П.А. Герцена
Бефнорин (рекомбинантный Т^-Р человека) Иммуномодулятор, иммунокорректор Форма выпуска -лиофилизированный стерильный порошок в ампулах НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ “Вектор”, ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Патент РФ №2132385 Патент РФ №2158303 Разработаны Инструкции по изготовлению и контролю и проекты ФСП на субстанцию и лекформу. Завершены доклинические исследования. Получено разрешение на проведение клинических испытаний как иммуномодулятора
Нейтростим (рекомбинантный б-СЭР человека) Профилактика и лечение нейтропений различной этиологии. Форма выпуска -раствор во флаконах НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ “Вектор”, Институт фармакологии ТНЦ СО РАМН Патент РФ № 2113483 Патент РФ №2158303 Разработаны Инструкции по изготовлению и контролю и проекты ФСП на субстанцию и лекформу, завершены доклинические исследования. Получено разрешение на проведение клинических испытаний как гемостимулирующего средства
Дельтаферон (аналог рекомбинантного ІИ^-у человека) Лечение и профилактика вирусных инфекций, лечение иммунных и онкологических заболеваний, бактериальных и грибковых инфекций. Форма выпуска -лиофилизированный стерильный порошок в ампулах ГНЦ ВБ “Вектор” Патент РФ № 2132386 Разработаны лабораторная методика получения и методы анализа. Проводятся доклинические исследования
Мутантные аналоги ТІ^-а (с заменой аминокислот в 31 и 32 положении) Комплексная терапия солидных опухолей различной локализации, иммунокоррегирующая терапия. Форма выпуска - лиофилизированный стерильный порошок в ампулах ГНЦ ВБ “Вектор”, ИБХ им.М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Разработаны методики получения и очистки. Проводятся доклинические исследования
Было показано, что фармакокинетические профили всех исследуемых белков ТОТ-а различались [3,12]. Время полувыведения ИЗЩв медленной фазе элиминации при его внутривенном введении кроликам составляло 5,7 ч, в то время как для ТОТ-а этот показатель был равен 1,5 ч. Повышенный уровень 1132Н в крови животных сохранялся в течение 60 ч, в то время как исходный белок полностью выводился через 8 ч. Эти результаты можно объяснить тем, что произведенные аминокислотные замены привели к удалению сайта протеолиза в молекуле ТЫР-а и повысили устойчивость белка к протеазам крови.
Повышенная устойчивость аналогов TNF-a к действию трипсина была продемонстрирована и в системе in vitro [5].
Уровни специфической цитолитической активности в культуре мышиных фибробластов L929 для TNF-a и R31Q практически не различались, в то время как активность R32H оказалась сниженной в 200 - 300 раз. По-видимому, замена Arg в положении 32 на Hys приводит к снижению связывания мутантного белка с рецептором TNF-R55 клеток-мишеней, обеспечивающим цитотоксическую активность белка [16]. Аналогичные данные по сравни-
Табл.З. ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАМ МОВ-ПРОДУЦЕНТОВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФАКТОРОВ НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА
Целевой белок Наименование плазмиды, характеристика гена Регуляторные элементы Штамм-продуцент Характеристика белка
TNF-a pTNF311, делеция 4-х ^концевых кодонов Промоторы А,, К, бактериофага Т7 Eco/i SG 200-50 Растворимая форма, 15-20 мг/г клеток
R31Q рТЫЕ 311 А, делеция 4-х № концевых кодонов, мутация АгдЗЮІп Промоторы А;, Ад бактериофага 17 Eco/i SG200-50 Растворимая форма, 15-20 мг/г клеток
R32H pTNF 311 А, делеция 2-х № концевых кодонов, мутация Агд32Нуэ Промоторы А^ Аз бактериофага Т7 £ш//SG200-50 Растворимая форма, 15-20 мг/г клеток
Табл.4. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ РЕКОМБИНАНТНОГО TNF-a ЧЕЛОВЕКА
Эффект Объект, способ введения, доза Результаты
Цитолитическая активность Клетки мышиных фибробластов L929 в присутствии актиномицина D Не менее чем 3*107 МЕ/мг
Пирогенность Кролик, внутривенно, 4*104 МЕ/животное Не пирогенен
Токсичность Эмбриональные диплоидные фибробласты человека, 5*105 МЕ/мл; Крыса, внутривенно; Собака, внутривенно Не токсичен LD50 8*107 МЕ/кг LD50 2*106 МЕ/кг
Противоопухолевая активность Мыши с трансплантированной опухолью МХ-11, внутриопухолевое, 4*102 МЕ/мышь; Мыши с трансплантированной карциномой легких Lewis, внутривенно, 4*102 МЕ/мышь; Мыши с трансплантированной мастоцитомой Р815, перитонеал'ьно, 4*103 МЕ/мышь Ингибирование роста опухоли на 82% Ингибирование роста опухоли на 52% Ингибирование роста опухоли на 53%
тельной антибластоидной активности мутантов и ТЫР-а были получены на мышах с перевивными опухолями.
Результатом замены в 32 положении ТОТ-а являлось значительное снижение токсичности белка, что проявлялось как в повышении по сравнению с исходным белком уровня ЬБ50 (по меньшей мере, в 8 раз), так и меньшей интенсивности реакции основных систем организма на введение субтоксической дозы Ы32Н. Что касается 1131(), то, несмотря на близость среднесмертельной дозы, токсическое дей-
Рис.1. Содержание производных гематопорфирина в ткани аденокарциномы Эрлиха в разные сроки после введения комплексного препарата ПГП-TNF-a, ПГП или ПГП с TNF-a По оси абсцисс - время после введения, ч; по оси ординат -концентрация ПГП в ткани опухоли, мкг/г, после введения ПГП- TNF-a (белые столбики), ПГП (черные столбики), ПГП и TNF-a (столбики серые). Клетки аденокарциномы Эрлиха трансплантировали белым беспородным мышам ICR подкожно в дозе 105 клеток на животное, препараты вводили на 4-е сутки после перевивки опухоли подкожно однократно в дозе 3 мкг/мышь (105 Е TNF-a).
1 2 3 4 5
Рис.2. Влияние препарата ПГП-ЮТ-а на процесс образования экспериментальных метастазов в легких мышей с перевивной карциномой легких Льюис.
По оси абсцисс - 1 - физиологический раствор; 2 - ПГП, 33 нг/ мышь; 3 - Т№-а, 103 Е/мышь; 4 - Т№-а, 103 Е/мышь, ПГП, 33 нг/мышь, раздельно; 5 - композиционный препарат ПГП (33 нг/ мышь)- Т№-а (103 Е/мышь); по оси ординат- среднее количество метастазов в легких на мышь. Карциному легких Льюис перевивали мышам линии С57В1/6 подкожно, 105 клеток на мышь. Препараты вводили 10-кратно внутрибрюшинно, начиная инъекции на 7-е сутки после перевивки опухоли. Количество метастазов в легких подсчитывали на 19-е сутки после трансплантации опухоли.
ствие мутанта на организм мышей также было менее выраженным, чем в случае применения ТОТ-а. Не исключено, что аминокислотные замены в 31 и 32 положениях молекулы могут отражаться и на связывании белка с ТЫР-К75 рецептором, опосредующим провоспалительную и токсическую активность Т№-а [16].
Полученные данные свидетельствуют о перспективности использованного подхода для получения препаратов ТЫР-а со сниженной системной токсичностью при сохранении фармакологических свойств исходного белка.
Другим подходом, позволяющим снизить побочные эффекты ТЫР-а, является создание его композиций с другими веществами. Нами было проведено изучение противоопухолевой активности композиционного препарата, в состав которого входили ПЧР-а и производное гематопорфирина (препарат, активно используемый в качестве фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии опухолей).
В биологических экспериментах было показано, что тропность препарата ПГП- ТОТ-а к ткани опухоли была выше, чем у его компонентов (рис. 1). Противоопухолевый эффект композиционного препарата проявлялся и в тех случаях, когда каждый из препаратов оказывался неэффективным, при этом эффективная доза ТОТ-а была существенно снижена. Полученный препарат обладал повышенной способностью ингибировать метастазирование экспериментальной опухоли (рис.2).
Несмотря на то, что биологические свойства "ШР-а изучены довольно подробно, в последнее время появляются все новые данные о роли этого белка в иммунологических процессах, связанных с формированием специфического иммунного ответа. В экспериментах на мышах нами была исследована возможность применения ТЫР-а в качестве иммуноадъюванта. Установлено, что эффект вакцинации против бешенства был более выраженным в случае использования вакцины в сочетании с ТЫР-а (рис.З). Максимальная устойчивость к последующему заражению была отмечена у животных, которым ТЫР-а вводили через сутки после вакцинации, при этом выживаемость вакцинированных мышей составляла 90%. Приведенные данные говорят о том, что сфера применения данного цитокина не может ограничиваться только онкологией, и новым аспектам применения ТМР-а необходимо уделять серьезное внимание.
Известно, что, несмотря на высокую структурную и аминокислотную гомологию, факторы некроза опухолей альфа и бета существенно различаются по своей противоопухолевой, цитолитической активности и токсическим свойствам. Однако, в отличие от ТОТ-а, биологическая роль ТЫР-(3 и механизмы реализации его эффектов в целостном организме изучены пока слабо.
Известно, что ТКР-(3 обл адает иммунорегулятор-ным, противоопухолевым и антиинфекционным действием [18,23]. Данный цитокин является медиатором межклеточных взаимодействий, оказывает влияние на пролиферацию и дифференцировку Т- и В- лимфоцитов, стимулирует фагоцитоз. В последние годы убедительно доказана его роль в формировании и поддержании структуры органов иммунной системы (лимфатические узлы, селезенка) [20]. Иммуномодулирующие свойства ТЫР-|3 в значительной мере обуславливают его способность вызывать элиминацию трансформированных и инфицированных клеток. Продемонстрировано и прямое цитотоксическое действие цитокина на опухолевые клетки [19]. Все это позволяет считать ТОТ-р перспективным для использования в комплексной терапии заболеваний, сопровождающихся развитием иммунодефицитиых состояний, в том числе онкологических.
В последние годы в ГНЦ ВБ “Вектор” разработана технология получения ТОТ-Р человека из рекомбинантного штамма Е.соН 56 20050/рЬТ21, завершены работы по созданию лекарственной формы, препарата бсфнорин, оформлены проекты ФСП на субстанцию и лекарственную форму, получено разрешение на проведение его клинических испытаний [6,8,9].
Препарат рекомбинантного Т№-Р представляет собой полипептид, содержащий 151 аминокислотный остаток, идентичный природному белку с 22-й по 171-ю аминокислоту с добавлением метионина на Ы-конце. Специфическая активность рекомбинантного ТОТ-Р в цитолитическом тесте на культуре клеток Ь929 превышает 2*107 Е/мг.
Исследование иммуномодулирующей активности ТЫБ-Р и его лекарственной формы показало, что препарат повышал функциональную активность нейтрофилов крови, макрофагов перитонеального экссудата и внутренних органов, модулировал клеточный и гуморальный иммунный ответ.
Рекомбинантный ТОТ-Р усиливал клеточную иммунную реакцию ГЗТ у белых беспородных мышей и мышей линии С57ВЬ/6, повышал интенсивность реакции исчезновения макрофагов из брюшной полости мышей, но не влиял на пролиферацию Т-лимфо-цитов и их активность в реакции “трансплантат против хозяина”. Препарат оказывал модулирующее влияние на гуморальное звено иммунного ответа у беспородных мышей, мышей линий СВА и С57В1/6, однако динамика эффекта, его направленность у мышей разных линий была различной и зависела от величины использованной дозы [11]. На модели цитостати-ческой иммуиосупрессии и иммунодефицита, вызванного рентгеновским облучением, было показано, что ТЫР-Р усиливал клеточный иммунный ответ и не оказывал влияния на гуморальный ответ (рис.4).
На основании этих данных было сделано заключение о перспективности клинических испытаний
1 ОО 90 80 70 60
АО 30 20 Ю О
Контроль О ч через 2А ч
Рис.З. Влияние Т№-а при разных схемах применения на выживаемость вакцинированных мышей, зараженных вирусом бешенства в дозе 50 Ш.(|.
По оси абсцисс - время введения ТОТ-а относительно вакцины; по оси ординат - процент защиты, %. Прозрачные столбики -вакцинированный контроль, темные столбики - ТОТ-сс в дозе 3,3*103 Е/мышь, светлые столбики - Т№-а в дозе 3,3*104 Е /мышь. Белых беспородных мышей вакцинировали антирабической вакциной в дозе
0,025 МЕ на животное двукратно с интервалом в 7 дней. Вирус бешенства штамм О/Б инокулировапи интрацеребрально на 21-й день после первой вакцинации.
ГТЗ, индекс Гемолизины,о.е.*100
Рис.4. Влияние на показатели иммунного ответа
облученных мышей.
По оси абсцисс- индекс реакции ГЗТ (первая группа столбиков) и количество гемолизинов в сыворотке крови (вторая группа столбиков); по оси ординат-величина показателя (ГЗТ,%; гемолизины, о.е.*100). Прозрачные столбики (1)-необлученный контроль, столбики 2 -Т№-Р, столбики 3 - облученный контроль, столбики 4 - облученные мыши, которым вводили 1>1Р-р. Мышей-гибридов первого поколения (СВАхС57В176)Р1 подвергали сублетальному рентгеновскому облучению (6 Гр, 0,15 Гр/мин). За сутки до облучения животных иммунизировали 107 ЭБ, препарат ЮТ-Р вводили в дозе 5*103 Е/мышь через сутки после облучения.
препарата бефнорин в качестве средства коррекции иммунодефицитиых состояний, обусловленных недостаточностью Т-клеточного звена иммунитета.
Доклинические испытания безвредности бефно-рина не обнаружили противопоказаний для проведения клинических испытаний препарата. Исследование фармакокинетики препарата в эксперименте па кроликах показало, что даже при концентраци-
ях, десятикратно превышающих терапевтические, препарат быстро выводится из кровеносного русла лабораторных животных.
В ходе работ по данному направлению было установлено, что целенаправленное изменение структуры белков может привести не только к изменению их биологических свойств, но и к принципиальному изменению технологического процесса их получения. Как известно, получение рекомбинантного IFN-у человека сопряжено с определенными трудностями, обусловленными тем, что данный белок синтезируется в бактериальной клетке в тельцах включения. В связи с этим был сконструирован рекомбинантный штамм Escherichia coli, продуцирующий аналог IFN-y дельтаферон, белок с делецией 10 С-кон-цевых аминокислотных остатков и мутациями в 129 и 130 положениях. Дельтаферон синтезируется в растворимой нативной форме [13]. Технология получения дельтаферона позволяет выделить из 1 г биомассы 1,89 мг целевого белка, что почти в 2 раза выше выхода исходного IFN-y (1,03 мг/г).
В экспериментах in vitro и in vivo было показано, что новый структурный аналог IFN-y отличался повышенной устойчивостью к протеолизу трипсином и дольше (по меньшей мере, на 2 ч) циркулировал в биологически активной форме в крови мышей по сравнению с исходным белком (рис.5). Повышенная протеолити-ческая устойчивость аналога дает основание предполагать, что использование препарата на основе дельтаферона в клинической практике позволит уменьшить частоту инъекций, необходимых для поддержания эффективных концентраций интерферона в крови.
1,5 мин 4 мин 90 мин
Рис.5. Динамика изменения содержания №N-7 и его аналога в инкубационной среде, содержащей трипсин (0,04%, 37 °С).
По оси абсцисс-время инкубации, мин; по оси ординат-содержание белка, в % к исходному уровню. Темные столбики - ШІМ-у, столбики серые - дельтаферон.
Уровень противовирусной активности дельтаферона, определенной на культуре человеческих фиб-робластов Ь-68, был снижен и составлял 8* 105 Е/мг, в то время как для 1Р^у этот показатель был равен 107 Е/мг. В то же время, противовоспалительные свойства белка остались неизменными. Как было показано на модели экспериментального адъювантного артрита у мышей, применение как полноразмерного, так и модифицированного ШН-у в дозе 105 Е/ мышь тормозило развитие воспалительного процесса [13]. Индекс реакции через 16 суток после индукции заболевания составил 80,6% и 79,4% для 1Р^у и дельтаферона соответственно. Аналогичный характер реакции наблюдался и в период максимального развития процесса.
Следовательно, произведенные изменения в молекуле 1РН-у позволили осуществить синтез рекомбинантного белка в бактериальном штамме-проду-центе в растворимой нативной форме, увеличить его выход при очистке, не затрагивая основные биологические свойства. Проведенные модификации позволили также повысить устойчивость мутанта к действию протеаз крови.
Еще одним примером получения рекомбинантных цитокинов, по структуре своей близких к природным, но имеющих некоторые модификации, может служить гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. О-СБР - гликопротеин, синтезируемый в организме моноцитами, фибробластами, клетками эндотелия и стромы костного мозга. Он относится к наиболее значимым в группе клеточных факторов роста, обладает стимулирующим действием на днфференцировку костно-мозговых предшественников, стимулирует пролиферацию и созревание гра-нулоцитов, регулирует функциональную активность зрелых нейтрофилов [24].
За рубежом на основе рекомбинантного О-СБР человека созданы и успешно используются в клинической практике лекарственные препараты (нейпо-ген, граноцит). Показаниями к применению препаратов являются нейтропении у онкологических больных, подвергнутых химио- и радиотерапии, больных СПИД и СПИД-ассоциированным комплексом, нарушения гемопоэза (хроническая нейтропения, ап-ластическая анемия, миелодиспластический синдром) и кроветворения при пересадке костного мозга. В связи с высокой потребностью препаратов на основе в-СБР в ряде стран вводятся крупномасштабные производственные линии.
В НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ “Вектор” совместно с ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН впервые в России создан рекомбинантный штамм-продуцент в-СБР человека на основе плазмиды ООР8, содержащей ген С-СБР человека, и Е.соН 5020050, синтезирующей белок человека конститутивно [15]. Показано, что плазмидная ДНК в процессе ферментации стабильна. Отработаны условия, по-
Табл. 5. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТОВ НЕЙТРОСТИМ И НЕЙПОГЕН
Показатели Нейпоген [2] Нейтростим
Биохимические характеристики активного компонента (G-CSF):
- количество аминокислот 175 175
- N-концевая аминокислота Метионин Метионин
- гликозилирование Нет Нет
- молекулярная масса (кДа), определенная:
- электрофорезом 18,7 19,0 ± 0,6
- гель-фильтрацией 18,9 19,0
- масс-спекгрометриеи 18,8
Биологические характеристики:
- колониестимулирующая активность in vitro, 108 Не менее 5x107
МЕ/мг белка
Гемостимулирующая активность in vivo на модели
цитостатической миелосупрессии (% к контролю)
- повышение общего числа лейкоцитов периферической крови мышей 268 386
- повышение числа нейтрофилов периферической крови мышей 1088 1117
- повышение числа незрелых нейтрофилов костного мозга мышей 158 221
- повышение числа зрелых нейтрофилов костного мозга мышей 275 278
Время полувыведения из крови кроликов (tl/2 ч) 4,71 ± 0,48 4,59 ± 0,50
зволяющие преодолеть сегрегационную нестабильность плазмиды на всех этапах производства биомассы штамма-продуцента и повысить воспроизводимость процесса получения качественной биомассы с содержанием G-CSF 10-15% от суммы клеточных белков [7].
Разработанный нами рекомбинантный G-CSF идентичен природному полипептиду, состоящему из 174 аминокислотных остатков, но содержит дополнительный метионин на N-конце и является аналогом активного начала зарубежного препарата нейпо-ген. Показано, что рекомбинантный полипептид обладает высокой колониестимулирующей активностью в системе in vitro (108 МЕ/мг белка) и высокой гемостимулирующей активностью на модели миело-супрессии у мышей, вызванной введением цикло-фосфана [4]. На основе этого белка был создан лекарственный препарат нейтростим, который по показателям качества, физико-химическим характеристикам и биологической активности не уступает зарубежному препарату-аналогу. Результаты его доклинического изучения в сравнении с препаратом нейпоген представлены в таблице 5.
Изучение токсикологических характеристик рекомбинантного G-CSF показало, что введение 10-кратной эффективной дозы препарата (1,25 мг/кг) как однократно, так и многократно в течение 30 дней не вызывало развития необратимых выраженных патологических изменений в организмах мышей. Препарат обладает умеренно выраженным раздражающим действием, признаки которого исчезают после
отмены препарата, и не проявляет аллергизирующих свойств. В настоящее время завершены доклинические исследования препарата и получено разрешение на проведение его клинических испытаний.
Таким образом, результаты работ по созданию препаратов на основе генно-инженерных цитокинов свидетельствуют о том, что использование достижений биотехнологии и методических приемов генной инженерии может привести к созданию улучшенных вариантов природных белков, отличающихся высокой терапевтической активностью и безвредностью, и оптимизировать процессы их выделения и очистки. Использование новых методических подходов позволяет получать препараты нового поколения, отличающиеся целенаправленным действием и высокой степенью адаптированное™ к макроорганизму, а также создать базу для совершенствования диагностических средств и повышения их качества.
Конструирование белковых молекул природного происхождения открывает новый этап в развитии фармацевтической науки - биотехнологической фармацевтики молекулярных нюансов.
Список литературы
1. Акименко З.А., Шапров В.В., Самуков В.В., Шемякин В.В., Зернов Ю.П., Шингарева Н.В., Пустоши-лова Н.М., Блоха В.В., Меденцев Р.А. Структура рекомбинантного фактора некроза опухолей альфа человека, синтезируемого в клетках Е.соН Бв 20050/р'ШЕ 311Д // Биотехнология. -1996.- № 8,- С. 3-12.
2. Варпаховская И. Мировой рынок биотехнологии на подъеме. Перспективы развития рынка современных биотехнологических препаратов в России // Ремедиум. - 1999,- № 11. - С. 4-11.
3. Гамалей С.Г., Даниленко Е.Д., Емельянова А.В., Лебедев Л.Р., Пустошилова Н.М., Масычева В.И. Особенности фармакокинетики нового аналога фактора некроза опухоли альфа // Хим.-фармацевт. журн.-1999.-№ 11,- С. 3-5.
4. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., Кри-вопалова Г.Н., Масычева В.И., Пустошилова Н.М., Пушкарева Н.С., Симанина Е.В., Синичкина С.А. Механизмы гемостимулирующего эффекта грануло-цитарного колониестимулирующего фактора при ци-тостатическом воздействии. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1999. - Т.128, № 8. - С. 194-199.
5. Корепанова А.В., Ерошкин А.М., Иванисенко
B.А., Лебедев Л.Р., Микрюков Н.Н., Пустошилова Н.М., Петренко В.А., Ильичев А.А. // Молекуляр. биология. - 1994,- Т. 28., № 1.- С. 143-149.
6. Коробко В.Г., Давыдов И.В., Добрынин В.Н., Пустошилова Н.М., Лебедев Л.Р., Гилева И.П., Петренко В.А. Получение и бактериальная экспрессия мутантного гена лимфотоксина человека. // Биоорган. химия. - 1993. - Т. 19, № 4 -С. 414-419.
7. Лебедев Л.Р., Зернов Ю.П., Кривопалова Г.Н., Каныиина А.В., Литовченко Л.Л., Пустошилова Н.М. Оптимизация процесса биосинтеза гранулоцитарно-го колониестимулирующего фактора при культивировании рекомбинантного штамма E.coli SG 200-50/ pGGF8 // Биотехнология. - 1998.-№ 2,- С. 44-51.
8. Лебедев Л.Р., Пустошилова Н.М., Синичкина
C. А., Андреева И.С. Получение лимфотоксина и изучение его свойств. // Прикл. биохимия и микробиология. - 1998. - Т. 34, № 1. - С. 120-126.
9. Масычева В.И., Даниленко Е.Д., Морозова Е.Н., Федосова Л.К., Сизова Л.Ю., Гамалей С.Г., Лебедев Л.Р., Пустошилова Н.М. Изучение токсических свойств рекомбинантного фактора некроза опухоли // Антибиотики и химиотерапия. - 1997. - Т. 42, №4. - С. 24-27.
10. Масычева В.И., Даниленко Е.Д., Пустошилова Н.М., Белявская В.А. Создание средств стимуляции системы неспецифической резистентности // Вестн. РАМН.-1998.-№4.-С.13-17.
И. Масычева В.И., Фадина В.А., Даниленко Е.Д., Сысоева Г.М., РатнерГ.М., СтахееваМ.Н., Степовая Е.А., Хлусова М.Ю., Шерстобоев Е.Ю., Пустошилова Н.М. Исследование иммунорегуляторных свойств рекомбинантного фактора некроза опухоли бета у оппозитно реагирующих на антиген мышей // Эксперим. и клин, фармакология,- 1999.-№ 4.-С.44-47.
12. Сандахчиев Л.С., Мерзликин Н.В., Пустошилова Н.М., Истомина Н.Н., Лебедев Л.Р., Святченко М.И., Даниленко Е.Д., Масычева В.И., Усова С.В. Некоторые
биологические свойства мутантного фактора некроза опухоли - альфа человека // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 1998. - Т. 125, №1. - С. 89-92.
13. Татьков С.И., Смирнова О.Ю., Цивковский Р.Ю., Кочнева Г.В., Кузьмичева Г.А., Христофоров B.C., Косарев И.С., Черных Е.Р., Хонина Н.А., Лебедев Л.Р., Даниленко Е.Д., Фадина В.А., Пустошилова Н.М., Масычева В.И., Сандахчиев Л.С. Мутантный у-интер-ферон человека с укороченным С-концом и его свойства // Докл. Рос. АН. - 2000. - Т.372, № 6.-С. 833-835.
14. Шингарова Л.Н., Сагайдак Л.Н., Турецкая Р.Л., Недоспасов С.А., Есипов Д.С., Коробко В.Г. Мутанты фактора некроза опухолей человека: получение и некоторые свойства // Биоорган, химия. -1996.-Т. 22., №4.-С. 243-251.
15. ШингароваЛ.Н., Кашьяп С.К., Петровская Л.Е., Петренко Л.А., Пустошилова Н.М., Синичкина С.А., Коробко В.Г. Экспрессия гена гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека в Escherichia coli. // Биотехнология. - 1998,- №6. -С. 24-35.
16. Barbara J.A.J., Smith W.B., Gamble J.R., Van Ostade X., Vandenabeele P., TavemierJ., Fiers W., Vadas M. A., Lopez A.F Dissotiation of TNF-a cytotoxic and proinflammatory activities by p55 receptor- and p75 receptor-selective TNF-a.mutants. //EMBO J.-1994.-Vol.l3.-P.843-850.
17. Eggermont A.M. TNF alpha in isolated perfusion systems: success in the limb, developments for the liver credits, debits and future perspectives // Anticancer Res.-1998.- Vol.18 (5D). - P. 3899-3905.
18. Funahashi I., Kawatsu М., Kajikawa T. Et.al. Usefulness of glycosylated recombinant human lymphotoxin for growth inhibition of human and murine solid tumors and experimental metastasis in mice. // J.Immunother. - 1991. - Vol.10, №1. - P. 28-38.
19. Granger G.A., Masunaka I., Averbook B. et.al. Differences in the bioactivity of recombinant human TNF, LT and T-cell derived LT-3 on transformed cells in vitro and the Meth A tumor growing in В ALB/c mice. // Lymphokine Res.-1988. -Vol.7.-P.488-492.
20. Horald von Boehmer. Lymphotoxins:from cytotoxicity to lymphoid organogenesis. // Proc.Nat.Acad.Sci. - 1997. - Vol.94 -N 17,- P.8926-8927
21. Jones A.L., Selby P. Clinical application of tumor necrosis factor. // Progr. Growth Factor Res.- 1989.-Vol.l., N2 - P.107-122.
22. Mueller H. Tumor necrosis factor as an antineoplastic agent: pitfalls and promises // Cell. Mol. Life Sci.- 1998,- № 54,- C. 1291-1298.
23. Ruddle N.H. Tumor necrosis factor-beta/ Lymphotoxin-alpha // The Cytokine Handbook/ ed.Thomson A.-Academic Press, 1994,- P. 305-318.
24. Weisbart R.H., Gasson J.C., Golde D.W. Colony-stimulating factors and host defense. // Ann. Intern. Med.-1989.-Vol.ll0.-P.297-303.
поступила в редакцию 07.05.2001 принята к печати 21.06.2001
