CC BY
20
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
оценивали интенсивность и характер воспаления в легких, а также уровень провоспалительных цитокинов, ассоциированных с астмой.
В ходе данной работы было обнаружено, что, по сравнению с контрольными мышами, мыши, подвергавшиеся анти-Ш-6 терапии, демонстрируют значительное снижение тяжести воспаления дыхательных путей. Подсчет иммунных клеток в тканях легких и бронхоальвеолярной жидкости, проведенный в конце эксперимента, показал снижение общего числа лимфоцитов в группе мышей, которым вводили антитела блокирующие IL-6. Кроме того, цитофлуориметрический анализ выделенных из легких и бронхоальвеолярной жидкости лимфоцитов выявил существенное снижение как доли, так и абсолютного числа гранулоцитов и патогенных при астме 1Ь2-клеток у мышей на фоне анти-Ш-6 терапии. Методом количественного ПЦР было установлено, что блокировка IL-6 приводила к снижению экспрессии активирующих цитокинов, таких как IL-4, IL-5, и IL-13, участвующих в индукции и поддержании воспаления при астме. Иммунофермент-ный анализ (ELISA) сыворотки и бронхоальвеолярной жидкости показал снижение уровня IgE, маркера астматического поражения легких, у мышей, подверженных anti-IL6 терапии по сравнению с контрольными мышами. Наконец, экспрессия муцина Muc5ac и маркера бокаловидных клеток Gob5 была снижена на фоне анти-Ш-6 терапии. Следует отметить, что медикаментозное подавление продукции слизи в дыхательных путях является одним из способов облегчения состояния при астме.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что введение антител против IL-6 может снижать гиперреактивность дыхательных путей и аллергическое воспаление в мышиной модели HDM-индуцированной астмы. Данные результаты предоставляют рациональную основу для начала разработки терапии астмы, основанной на блокировке IL-6. Дальнейшие эксперименты необходимы для определения конкретного клеточного источника IL-6 в данной модели, а также с целью установления молекулярного механизма, определяющего па-тогенность этого цитокина в астме.
Работа была осуществлена при поддержке гранта РНФ 14-25-00160.
РАЗРАБОТКА ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЭХИНОХРОМА А В КАЧЕСТВЕ СОПРОВОДИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ БЛЕОМИЦИН-ИНДУЦИРОВАННОГО ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА В ЛЕГКИХ НА РАННЕМ ЭТАПЕ ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА
Гусева О.Е., Лебедько О.А., Рыжавский Б.Я., Кузнецова М.С.
Хабаровский филиал ФГБНУ«Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» — Научно-исследовательский институт охраны материнства и детства, Хабаровск, Россия
Введение. Блеомицин — смесь гликопептидных антибиотиков с цитостатическим эффектом, механизм действия которого связан со способностью вызывать фрагментацию молекул ДНК. Блеомицин входит в «золотые» стандарты терапии различных форм лимфогранулематоза у детей и подростков. Повсеместно известен его пневмо-токсический эффект, который характеризуется развитием воспалительных и фибротических изменений. Одним из ключевых молекулярных механизмов формирования
и прогрессирования воспалительно-фиброзных процессов является оксидативный стресс, нарушающий баланс редокс-сенситивной регуляции апоптоза, пролиферации, дифференцировки, миграции мезенхимальных и эпителиальных клеток. Препараты на основе природного антиоксиданта Эхинохрома А (2,3,5,6,8-пента-гидрокси-7-этил-1,4-нафтохинон) в настоящее время широко используются в офтальмологии, кардиологии, неврологии.
Цель и задачи. Изучение влияния Эхинохрома А на показатели оксидативного стресса, индуцированного блеомицином, в легких крыс на раннем этапе постна-тального онтогенеза. Исследование влияния Эхинохро-ма А на блеомицин-индуцированные нарушения процес-синга свободных радикалов (СР) в легких крыс на раннем этапе постнатального онтогенеза.
Материалы и методы. Исследование проводилось в рамках программы фундаментальных исследований ДВО РАН «Новые лекарственные формы, биопрепараты и медицинские технологии, преимущественно на основе молекул и надмолекулярных комплексов из биологических объектов Дальнего Востока и Мирового океана», научный проект 15-I-5-030. Опыт поставлен на крысах линии Вистар. Животные были разделены на три группы. Первая группа — «блеомицин» — введение блеомицина крысам в возрасте 30 дней, однократное, внутрибрю-шинное, в дозе 1 мг/кг. Вторая группа «блеомицин + эхи-нохром» — введение блеомицина, как и в первой группе, а также введение эхинохрома А через желудочный зонд в форме водного раствора, приготовленного extempore, в дозе 10 мг/кг в течение 5 суток (в день введения блеомицина, а также на 2, 3, 4 и 5-е сутки после этого). Третья группа — «контроль» — однократное внутрибрюшинное введение 30-дневным крысам физиологического раствора в эквиобъемных блеомицину дозах. Для интегральной оценки процессов биогенеза СР в гомогенатах легочной ткани использовали метод хемилюминесценции (ХМЛ) на люминесцентном спектрометре LS 50B «PERKIN ELMER».
Результаты. Результаты ХМЛ-исследования легких крыс, повергнутых воздействию блеомицина, свидетельствовали о развитии выраженного оксидативного стресса. Зарегистрировано повышение генерации свободных радикалов в целом — показатель Ssp превышал аналогичный в группе «контроль» в 2,6 раза, при этом продукция супероксид-анион радикалов (Sluc), перекисных радикалов (Sind-1) возросла в 2,8 и 3,2 раза соответственно. Зарегистрирована интенсификация первичного этапа перекисного окисления липидов: концентрация гидроперекисей липидов (h) превышала значения в группе «контроль» в 3,1 раза. Нарушение процессинга СР сопровождалось ослаблением антиоксидантной антирадикальной защиты и снижением перекисной резистентности: величина Sind-2 возросла в 3,4 раза, амплитуда H — в 3,2 раза соответственно. Известно, что Эхинохром А способен одновременно блокировать ряд звеньев свободнора-дикальных реакций, действует как перехватчик активных форм кислорода, нейтрализует липопероксидные радикалы, хелатирует ионы металлов, ингибирует перекисное окисление липидов. Эти свойства были продемонстрированы им в данной экспериментальной модели — величины всех ХМЛ-параметров, характеризующих оксидативный статус в группе «блеомицин+эхинохром» (Ssp, Sluc, Sind-1, h, Sind-2, H), были достоверно меньше, чем в группе «блеомицин» — в 1,9; 2,0; 1,9; 2,0; 2,4; 2,3 раза соответственно.
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
Заключение. Признанной стратегией фармакотерапии при пневмофиброзе является коррекция локальных проявлений оксидативного стресса (Walters D.M., Cho H.Y, 2014). Полученные нами результаты согласуются с данной стратегией, расширяя возможности для создания на основе Эхинохрома А официнального препарата для патогенетической и сопроводительной терапии в детской пульмонологической и онкологической практике.
ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ БИОПЛЕНКИ НА ФОРМИРОВАНИЕ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛОВУШЕК
Долгушин И.И., Шишкова Ю.С., Колесников О.Л., Пичугов С.М., Галагудин И.В.
ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный медицинский университет», Челябинск, Россия
Введение. Первой линией защиты от микроорганизмов выступает врожденная противоинфекционная система макроорганизма, самыми многочисленными клетками которой являются нейтрофилы. Нейтрофилы, выходя из периферической крови в ткани и на поверхность слизистых оболочек, участвуют в антимикробных и воспалительных реакциях. Известно, что бактерии сосуществуют в виде биопленки, обладая повышенной по сравнению с планктонными культурами устойчивостью к экстремальным физико-химическим условиям среды и биологическим факторам (неблагоприятной температуре, рН, концентрации соли, антимикробным веществам, фагоцитозу). Несмотря на многочисленные исследования антибиопленочных реакций врожденного иммунитета роль внеклеточного матрикса в формировании нейтро-фильных внеклеточных ловушек остается невыясненной.
Цель. Определить влияние бактериальной биопленки на формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек.
Задачи. 1) Оценить in vitro влияние планктонной культуры E. coli и ее биопленки на формирование нейтрофиль-ных внеклеточных ловушек. 2) Определить in vivo способность нейтрофильных гранулоцитов к формированию нейтрофильных внеклеточных ловушек до и после хирургической обработки инфицированной ожоговой раны.
Материалы и методы. Для решения первой задачи использовали взвесь суточной и 3-суточной культуры E. coli и нейтрофилы, выделенные из периферической крови условно-здоровых доноров на двойном градиенте фиколла-верографина. Исследование проводили в 5 повторах. Результаты взаимодействия изучали с помощью люминесцентной микроскопии при окраске акридиновым оранжевым. Для решения второй задачи было проведено цитологическое исследование препаратов раневого отделяемого, окрашенных по Романовскому—Гимзе, до и после выполнения хирургической обработки ожоговых ран 15 пациентов с помощью аэрозольной струи 0,05% раствора хлоргексидина биглюконата под давлением воздушного потока. В цитологических препаратах изучали содержание нейтрофильных гранулоцитов в поле зрения и определяли процентное содержание нейтрофильных внеклеточных ловушек от 100 просмотренных морфологических форм нейтрофилов с помощью световой микроскопии при увеличении 100x10x2. Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке.
Результаты. В результате проведенных исследований установили, что после 3-минутного взаимодействия су-
точной культуры E. coli со взвесью донорских нейтро-филов происходило формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек, через 30 минут совместного культивирования in vitro 95% нейтрофильных гранулоцитов экстрагировали свою ДНК. Иначе выглядела морфология нейтрофильных гранулоцитов при взаимодействии с 3-суточной культурой E. coli. В препаратах микроорганизмы были представлены плотно упакованными клетками, напоминающими кукурузные початки, а нейтрофилы сохраняли морфологию сегментоядерных гранулоцитов в течение 40 минут наблюдения и не формировали ней-трофильные внеклеточные ловушки.
При изучении цитологических препаратов раневого отделяемого до проведения хирургической обработки в поле зрения визуализировалось 9,01±1,38 нейтрофилов, после обработки 4,94±0,88 (р = 0,04). Процентное содержание нейтрофильных внеклеточных ловушек до обработки составляло 40,94±5,55%, а после - 59,91±5,70% (р = 0,01)
Заключение. Таким образом, при взаимодействии биопленки E. coli и нейтрофильных гранулоцитов в эксперименте in vitro показано отсутствие формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек. В то же время на примере использования хирургической обработки инфицированной ожоговой раны, при которой происходит механическое разрушение биопленки аэрозольной струей, высвобождение планктонных форм микроорганизмов и представление незащищенных бактериальных клеток тканевым нейтрофилам, было обнаружено интенсивное формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек.
ВЛИЯНИЕ САПОЗИНА D НА ФОРМИРОВАНИЕ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ
Евстифеев В.В., Шепелькова Г.С., Еремеев В.В.
ФГБНУ «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза», Москва, Россия
Сапозины (Sap) — подгруппа гликопротеинов большого семейства сапозин-подобных белков. Сапозины A, B, C и D образуются в кислых эндосомах путем расщепления просапозина (pSap). Сапозины участвуют в процессе презентации антигенов микобактерий на молекулах CD1. Ранее было показано, что макрофаги, полученные от мышей-нокаутов по гену pSAP, подавляли рост M. tuberculosis слабее, чем макрофаги мышей дикого типа. При добавлении к культуре клеток реком-бининтного человеческого сапозина D (Sap-D) наблюдалось полное восстановление функций макрофагов. При инкубации M. tuberculosis с рекомбинантными Sap наблюдалось подавление метаболизма бактерий, причем наибольшей активностью обладал Sap-D. Методами флуоресцентного мечения и электронной микроскопии было обнаружено повреждающее действие Sap-D на мембрану M. tuberculosis. Результаты экспериментов, проведенных в лаборатории, позволяют сделать вывод, что Sap-D является важным компонентом в формировании иммунного ответа к туберкулезу (ТБ). Однако неясно как влияет дефицит Sap-D на формирование противотуберкулезного иммунного ответа in vivo у мышей при экспериментальной туберкулезной инфекции.
Мышей C57BL/6 (B6) и B6.Sap-D-/- аэрозольно инфицировали вирулентным штаммом M. tuberculosis H37Rv. Через 3 и 5 недель после инфицирования исследовали степень поражения легочной ткани и рост микобактерий в легком.
