CC BY
132
164
Химия
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2014, № 4 (1), с. 164-168
УДК 54.061+062: 577.112.083
РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ К ЭКСПРЕССНОМУ АНАЛИЗУ КОЛЛАГЕНОВЫХ БЕЛКОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА ГЕЛЬ-ПРОНИКАЮЩЕЙ ХРОМАТОГРАФИИ
© 2014 г. Е.В. Гераськина,1 Ю.Л. Кузнецова,1 Н.Б. Валетова,2 О.А. Таранкова, 1
Ю.О. Маткивская,1 Е.П. Чухманов,1 М.В. Астанина,3 Л.Л. Семенычева1
:НИИ химии Нижегородского госуниверситета им. Н.И. Лобачевского Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
3
ООО «Системы качества жизни», Нововоронеж
Поступила в редакцию 25.04.2014
Предложено использование метода гель-проникающей хроматографии с детектором по светорассеянию для проведения экспресс-определения коллагеновых белков на качественном и количественном уровнях.
Ключевые слова: коллаген, биополимеры, гель-проникающая хроматография.
Введение
Необходимость рационального использования побочных продуктов и отходов перерабатывающей и пищевой промышленности тесно связана с экономической результативностью работы предприятия и природоохранными проблемами, острота которых с каждым днем растет. Из массы таких продуктов заметное место занимают отходы мясной и рыбной промышленности в силу того, что данный вид биологических отходов является потенциальным источником минералов, жиров и ценных белков, которые могут найти применение в народном хозяйстве, косметологии, медицине, производстве функциональных продуктов питания [1].
На сегодняшний день в силу новизны данного направления, а также неоднородности объектов не существует единой стандартной технологии переработки подобного типа отходов. И в этом отношении не вызывает сомнения актуальность разработки как самой технологии, так и методов аналитического контроля, применимых в отношении данных объектов биологического происхождения.
При рассмотрении проблемы утилизации отходов рыбной промышленности актуальной и важной задачей является разработка методик анализа коллагена - фибриллярного белка, составляющего основу соединительной ткани гидробион-тов, так как именно они в первую очередь и определяют его дальнейшее использование [2].
Экспериментальная часть
В работе использовали уксусную и аскорбиновую кислоты марки «ч. д. а.».
Воду очищали дистилляцией и бидистилля-цией. Готовили необходимые растворы для экстракции коллагена, а также проведения хрома-тографических исследований.
Растворы коллагена готовили из шкур форели в соответствии с патентом [3]. Полученный продукт анализировали на содержание коллагена, определяли молекулярно-массовые характеристики коллагена.
Пробоподготовку осуществляли путем фильтрования образцов с использованием насадочных мембранMillipore Millex-LCR (PTFE 0.45 цш).
Хроматографическое разделение проводили с применением высокоэффективного жидкостного хроматографа фирмы Shimadzu CTO-20A/20AC (Япония) с программным модулем LC-Solutions-GPC. Разделение проводили с применением колонки Tosoh Bioscience TSKgel G3000SWxl с диаметром пор 5 мкм. В качестве детектора использовали низкотемпературный светорассеивающий детектор ELSD-LT II. Элюентом служил 0.5 М раствор уксусной кислоты. Скорость потока 0.8 мл/мин.
Для калибровки применяли узкодисперсные образцы декстрана с диапазоном молекулярных масс 1000-410000 Да (Fluca).
Результаты и их обсуждение
При использовании жидкостной хроматографии как метода контроля, её эффективность стоит рассматривать, прежде всего, с двух позиций: возможности разделения пробы и возможности детектирования [4].
В качестве детектора для объектов сложного состава, в соответствии с рекомендациями про-
Таблица
Характеристики основных детекторов для жидкостной хроматографии _
Параметр детектора ELSD Рефрактометр Спектрофотометр МС
Чувствительность ++ - ++ ++
Работа с градиентом ++ - + ++
Стабильность базовой линии ++ - + ++
Пик растворителя ++ - - ++
Эквивалентный концентра- ++ ++
ции отклик
Условные обозначения: «++» — - отлично, «+» — хорошо, «-» — плохо.
изводителей [5], использован детектор по светорассеянию (Evaporative Light Scattering Detector - ELSD), исходя из реализации процесса детектирования, представляющего собой трёхступенчатый процесс:
1. распыление хроматографического элюен-та в смеси с инертным газом;
2. испарение подвижной фазы в пролётной трубке;
3. детекция оставшихся частиц образца по светорассеянию.
Принято считать, что данные детекторы для жидкостной хроматографии являются наиболее точными и универсальными. Они реагируют на любые аналиты, которые менее летучи, чем подвижная фаза. Эти детекторы имеют низкий фоновый сигнал, совместимы с широким спектром растворителей, а также позволяют использовать градиентное элюирование. Кроме того, результат ELSD-детекции не зависит от оптических свойств исследуемого вещества, он пропорционален его массе, что очень удобно для определения чистоты образца или при исследовании веществ с неизвестными свойствами. Немаловажным при этом является и то, что по ряду свойств ELSD-детекторы приближаются к масс-спектрометрическим, оставаясь значительно более простыми и менее дорогими устройствами, что важно и при внедрении методики в реальный производственный процесс [6]. Наглядным образом характеристики детекторов, используемых для жидкостной хроматографии, представлены в таблице.
Таким образом, преимущества ELSD-детек-торов в наибольшей степени удовлетворяют потребностям эксперимента по анализу смесей биополимеров.
Вопрос эффективности разделения пробы рассмотрен, как минимум, в трех аспектах: про-боподготовка, подбор сорбентов и элюента, подбор режима элюирования. Выбор того или иного подхода основан, прежде всего, на необходимости обеспечения надежности и простоты эксперимента.
В настоящее время ряд производителей предоставляет максимум информации по воз-
можности использования систем пробоподго-товки и разделения [7, 8]. В данном случае проведение подготовки проб для хроматографического исследования осуществляли путем фильтрования образцов для удаления механических примесей и, при необходимости, приготовления раствора заданной концентрации, в соответствии с требованиями к эксплуатации хромато-графической колонки. Последнее осуществлялось с применением гравиметрического контроля. Необходимость и достаточность данной процедуры обусловлена и подтверждена воспроизводимостью эксперимента и способствовала стабильной работе оборудования.
С применением гель-проникающей хроматографии были проведены исследования по определению качественного и количественного состава растворов биополимеров.
Для определения молекулярно-массовых характеристик колонка была откалибрована с применением узкодисперсных стандартов декстрана. Вид калибровочной кривой представлен на рис. 1. Необходимо отметить, что наиболее корректное определение молекулярных масс может быть проведено для полимеров, элюируемых из колонки в диапазоне 8-14 мин. Об этом свидетельствует линейный участок на калибровочной кривой.
Данный факт подтверждается и при анализе смеси полимеров с различной молекулярной массой. Полимеры, элюируемые из колонки в оговоренном временном диапазоне, характеризуются относительно симметричным молеку-лярно-массовым распределением. Таким образом, молекулярно-массовые характеристики (ММХ) полимеров могут быть рассчитаны про-грамным модулем с наибольшей точностью. Необходимо отметить, что для образцов с временем элюирования менее 8 мин наблюдаются отклонения при определении молекулярной массы (ММ). Об этом свидетельствуют как отклонение калибровочной зависимости от линейной, так и отклонения от Гауссового распределения [9] хроматографического пика полимера с наибольшей ММ (пик 1, рис. 2).
Необходимо отметить, что возможности метода ГПХ не ограничиваются лишь определени-
166
Е.В. Гераськина, Ю.Л. Кузнецова, Н.Б. Валетова, О.А. Таранкова и др.
ем ММХ. Данный метод позволяет проводить в тографическое определение концентрации по-
7 0 9 10 11 12 13 14
Рис. 1. Калибровочная кривая колонки Tosoh Bioscience TSKgel G3000SWxl, полученная с использованием узко дисперсных образцов декстрана
4
1
17
19
5 7 9 11 13 15
Время удерживания, мин Рис. 2. Хроматограмма смеси коллагеновых белков с различной молекулярной массой 70
0
1 во
<и
^ сг
I «50
40
I ^
S3 @ 2
у = 11.30б3х R' = 0.99
0 1 2 3 4 5 6
С (коллагена), масс.%
Рис. 3. Градуировочный график для проведения количественного анализа с применением методов гель-проникающей хроматографии и гравиметрии
том числе и количественные исследования. Нами было предложено определение концентрации растворов коллагена, что может быть весьма актуальным при внедрении хроматогра-фического метода контроля.
На рис. 3 представлен градуировочный график, построенный на основании данных по гравиметрическому и хроматографическому определению концентрации коллагеновых белков в образце.
Немаловажным является тот факт, что при наличии в образце нелетучих примесей хрома-
лимера становится более удобным и точным методом. Наличие этих примесей также может быть установлено с применением ГПХ, а их идентификация проведена с применением двойного детектирования или путем аналитической оценки предыстории образца.
Рассмотрим более подробно хроматограмму раствора биополимера (рис. 4). Исходя из времен элюирования, следует отнести пики 1 и 2 к биополимерам с разными молекулярными массами, в то время как пики 3, 4 и 5 лежат вне
диапазона элюирования высокомолекулярных соединений.
Так как выделение коллагена проводилось из натурального сырья, предполагалось, что обра-
зец может содержать какое-то количество жира. Путем хроматографического анализа образца рыбьего жира было установлено, что пики 4 и 5 принадлежат триглицеридам различной молекулярной массы.
Аналогичным образом была установлена природа и пика 3. Определено, что он принадлежит акорбиновой кислоте, используемой наряду с уксусной при извлечении коллагена из сырья. Метод дополнительного введения этого
компонента показал увеличение интенсивности сигнала в данной области.
В отдельных случаях при длительном хранении биологического сырья в нем могут образо-
вываться и накапливаться токсичные вещества. В связи с тем, что растворы природных полимеров преимущественно применяются в биомедицинских целях, определение их стабильности является достаточно актуальным.
В связи с тем, что в процессе хранения молекулы белка подвержены гидролизу (схема), протекающему с образованием в том числе аминокислот, ди- и трипептидов, предполагалось, что данный процесс будет сказываться прежде всего на ММХ коллагена [10].
Рис. 4. Хроматограмма образца коллагена, выделенного
из неочищенного сырья с применением смеси уксусной Рис. 5. Хроматограммы образца коллагена, зареги-
и аскорбиновой кислот. (Хроматограмма II соответству- стрированные в течение пяти недель хранения (пояс-
ет образцу с добавкой аскорбиновой кислоты) нение в тексте)
о о о
n2n - сн - с - NH - сн - с - - nh - сн - с - он гадролиз
I I I -
R1 R2 Rn
+Н20
о
+Н,0
©
+пн2о
H2N-CH-C-NH-CH-C-...-NH-CH-C-OH + NH2-CH-C-oh 111 1 R1 R2 Rn, Rn
H2N-CH -C -NH -CH -C- ... -NH-CH-C-OH
1 1 I
о
о
+ H2N-CH-C-NK-CH-C-. -NH-CH-C-OH
I I
Rn-m Rn-nui Rn
NH2-CH-C-OH + NH2-CH-C-OH + +NH2-CH-C-OH
©I I I
Ri R2 Rn
Схема
168
Е.В. Гераськина, Ю.Л. Кутнецива, Н.Б. Валетива, О.А. Таранкива и др.
На рис. 5 представлены хроматограммы растворов полимеров непосредственно после выделения (1), а также после хранения в течение двух (2) и пяти недель (3). Показано, что с увеличением времени хранения в отсутствие консервантов наблюдается деструкция коллагена, сопровождаемая снижением молекулярной массы полимеров и ростом их коэффициентов полидисперсности.
Об этом однозначно свидетельствуют смещение времен эксклюзии коллагеновых белков из колонки в область больших времен удерживания и уширение хроматографического пика соответственно.
Выводы
Показана возможность применения метода гель-проникающей хроматографии в качестве экспресс-метода контроля молекулярно-массовых параметров и чистоты коллагена в растворе.
Установлено, что способ гель-прони-кающей хроматографии практически удобен как экспресс-метод количественного определения коллагена в растворе и позволяет проводить мониторинг стабильности растворов коллагена. Это имеет важное значение и может получить развитие как при разработке методик контроля качества получаемой продукции на основе коллагена, так и при проведении входного контроля сырья.
Работа выполнена в Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского при поддержке
References
1. Zemlyakova E.S., Mezenova O.B. Biologicheski aktivnye kompozicii osteotropnogo i hondroprotektornogo dejstviya na osnove vtorichnogo syr'ya gidrobiontov.
Министерства образования и науки РФ (задание М 2014/134, соглашение от 27 августа 2013 г. М 02.В.49.21.0003) с использованием оборудования ЦКП «Новые материалы и ресурсосберегающие технологии» (проект RFMEFI59414X0005)
Список литературы
1. Землякова Е.С., Мезенова О.Б. Биологически активные композиции остеотропного и хондропро-текторного действия на основе вторичного сырья гидробионтов. Калининград: КГТУ, 2011. 169 с.
2. Воробьев В.И. Использование рыбного коллагена и продуктов его гидролиза // Изв. КГТУ. 2008. № 13. С. 55-58.
3. Титов А.О., Титов О.П., Титова И.И. Способ обработки коллагенсодержащего сырья Патент РФ № 2314352. Заявлено: 10.04.2006 (№ 2006111664). Опубликовано: 10.01.2008.
4. Золотов Ю.А., Дорохова Е.Н., Фадеева В.И. и др. Основы аналитической химии / Под ред. Ю. А. Золотова. М.: Высш. шк., 1996. 383 с.
5. www.prochrom.ru/ru/?idp=130 (дата обращения: 10.03.2014).
6. www.rts-engineering.ru/Med/Gilson/EqpHromat/ lbGI_ELS.html (дата обращения: 10.03.2014).
7. www.millipore.com/lab_filtration/flx4/lab-filtra-tion-research-capability (дата обращения: 02.04.2014).
8. www.mn-net.com/tabid/5509/default.aspx (дата обращения: 02.04.2014).
9. Детерман Г. Гель-хроматография / Пер. с нем., М.: Мир, 1970. 252 с.
10. Иен Н.Х., Новиков М.В. Молекулярно-массовое распределение фракций ферментативных гидролизатов из дрейссены и мидий // Рыбпром. 2009. № 1. С. 43-44.
Vyssh. shk., 1996. 383 s.
5. www.prochrom.ru/ru/?idp=130 (data obrashcheniya: 10.03.2014).
6. www.rts-engineering.ru/Med/Gilson/EqpHromat/
DEVELOPMENT OF APPROACHES TO EXPRESS ANALYSIS OF THE COLLAGEN PROTEINS USING THE METHODS OF SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY
E.V. Geraskina, Yu.L. Kuznetsova, N.B. Valetova, O.A. Tarankova, Yu.O. Matkivskaya, E.P. Chukhmanov, M. V. Astanina, L.L. Semenycheva
We propose to use size exclusion chromatography with a light scattering detector for the rapid determination of the collagenous proteins on the qualitative and quantitative levels.
Keywords: collagen, biopolymers, size exclusion chromatography.
Kaliningrad: KGTU, 2011. 169 s.
2. Vorob'ev V.I. Ispol'zovanie rybnogo kollagena i produktov ego gidroliza // Izvestiya KGTU. 2008. № 13. S. 55-58.
3. Titov A.O., Titov O.P., Titova I.I. Sposob obrabotki kollagensoderzhashchego syr'ya Patent RF № 2314352. Zayavleno: 10.04.2006 (№ 2006111664), Opublikovano: 10.01.2008.
4. Zolotov Yu.A., Dorohova E.N., Fadeeva V.I. i dr. Osnovy analiticheskoj himii / Pod red. Yu.A. Zolotova. M.:
lbGI_ELS.html (data obrashcheniya: 10.03.2014).
7. www.millipore.com/lab_filtration/flx4/lab-filtra-tion-research-capability (data obrashcheniya: 02.04.2014).
8. www.mn-net.com/tabid/5509/default.aspx (data obrashcheniya: 02.04.2014).
9. Determan G. Gel'-hromatografiya / Per. s nem., M.: Mir, 1970. 252 s.
10. Ien N.H., Novikov M.V. Molekulyarno-massovoe raspredelenie frakcij fermentativnyh gidrolizatov iz drejs-seny i midij // Rybprom. 2009. № 1. S. 43-44.
