CC BY
45
Биология и экспериментальная медицина
УДК 616-002.5-085-092.4:615.015.8
разработка оптимальных схем терапии лекарственно-устойчивого туберкулеза в эксперименте
Т. И. Виноградова, Н. В. Заболотных, С. Н. Васильева, М. Л. Витовская,
Е. И. Малыгина
Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии,
г. Санкт-Петербург
Изучено сочетание различных комбинаций основных и резервных противотуберкулезных препаратов с новым препаратом «Перхлозон» и с патогенетическими средствами (бестим, глутоксим, исла-цет) в лечении генерализованного лекарственно-устойчивого туберкулеза у 1300 беспородных белых мышей. Эффективными оказались композиции НАЕОА и RbAEOfl в высших терапевтических дозах. Замена перхлозоном Н или Rb в четырехкомпонентных схемах привела к снижению показателей тяжести течения инфекции. Бестим на фоне двух трехкомпонентных комбинаций RbOflZ и RbCsPt способствовал снижению тяжести туберкулезного процесса и восстановлению поглотительной и переваривающей способности макрофагов, угнетенной длительной массированной этиотропной терапией. Глутоксим в комплексе с НАЕОА достоверно улучшил результаты лечения. Его действие на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей имело ту же направленность, что и при использовании бестима. Ислацет в схемах НАЕОА и RbAEOA привел к уменьшению показателей пораженности органов и существенно повысил поглотительную и переваривающую способность макрофагов.
Ключевые слова: лекарственно-устойчивый туберкулез, противотуберкулезные препараты, перхло-зон, бестим, глутоксим, ислацет.
Введение
За последнее десятилетие снизилась эффективность лечения больных туберкулезом: по показателям прекращения бактериовыде-ления - с 87,4°% в 1991 г. до 73,5% в 2007 г., по закрытию полости распада — с 78,6 до 50% соответственно [2]. На крайне низком уровне находятся показатели эффективности лечения больных с лекарственно-устойчивыми формами микобактерий туберкулеза (МБТ) к противотуберкулезным препаратам (ПТП), среди которых излечение достигается лишь
на 11,8% чаще, чем наступает летальный исход [3].
Химиотерапия лекарственно-устойчивого туберкулеза (ТБМЛУ) проводится с использованием противотуберкулезных препаратов второго ряда, в результате затраты на лечение в сотни раз превышают стоимость стандартного режима лечения больных лекарственно-чувствительным туберкулезом [4]. Важно отметить, что режимы химиотерапии ТБМЛУ и длительность назначения препаратов второго ряда еще полностью не разработаны в контролируемых клиниче-
ских испытаниях и до сих пор носят, в основном, эмпирический характер [1].
Лекарственная устойчивость микобакте-рий предъявляет повышенные требования к иммунному статусу больного, формирующему варианты клинического течения туберкулеза. Вынужденная полихимиотерапия снижает функциональную активность систем защиты макроорганизма, что обусловливает затяжное течение и хронизацию воспалительных процессов, вызванную персистиро-ванием микобактерий в организме. Поэтому чрезвычайно необходим постоянный поиск новых средств и методов патогенетической терапии, в первую очередь, способствующих повышению защитных свойств организма и ускоряющих репаративные процессы.
Цель работы — сравнительная оценка результативности использования комбинаций основных и резервных ПТП, в том числе оригинального препарата «Перхлозон», а также патогенетических средств различного механизма действия (бестима, глутоксима и ислацета) при экспериментальном лекарственно-устойчивом туберкулезе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена на 1300 беспородных белых мышах-самцах (питомник «Рапполо-во» РАМН) при моделировании генерализованного туберкулеза путем введения в латеральную хвостовую вену взвеси 1*107 КОЕ клинического изолята M. tuberculosis № 5419 СПбНИИФ, устойчивого к изониази-ду (10 мкг/мл), рифампицину (40 мкг/мл), стрептомицину (10 мкг/мл) и этионамиду (30 мкг/мл). Лечение начинали на фоне распространенного специфического поражения легких (как правило, через 2 недели от момента заражения). Исследовали следующие противотуберкулезные препараты (ПТП): изониазид (H, 25 мг/кг, подкожно), рифа-
бутин (Rb, 15 мг/кг, per os), этамбутол (Е, 50 мг/кг, per os), пиразинамид (Z, 25 мг/кг, per os), амикацин (А, 30 мг/кг, подкожно), офлоксацин (Ofl, 20 мг/кг, per os), цикло-серин (Cs, 8 мг/кг, per os), протионамид (Pt, 20 мг/кг, per os), капреомицин (Cap, 20 мг/кг, внутримышечно), перхлозон (30 мг/кг, per os). Бестим назначали в дозе 0,1 мкг/кг внутрибрюшинно, 10 инъекций; глутоксим — в дозах 20 и 40 мг/кг, подкожно, в течение 4 и 8 недель; ислацет — в дозе 120 мг/мг, per os, 11 недель. Группами сравнения являлись здоровые животные, зараженные нелеченные (контроль заражения), а также мыши, получавшие только этиотроп-ную терапию (контроль лечения).
Для оценки эффективности терапии использовали следующие показатели: летальность, коэффициенты массы внутренних органов, индексы поражения легких и высевае-мость МБТ из гомогенатов легких и селезенки.
Фагоцитоз исследовали в культуре пери-тонеальных макрофагов (пМф) в отношении клеточной взвеси дрожжей рода Saccharo-myces cerevisiae, опсонизированных сывороткой мышей. Учитывали параметры поглотительной (фагоцитарная активность, фагоцитарное число) и переваривающей (показатель и индекс завершенности фагоцитоза) способности пМф.
Статистическую обработку данных проводили с использованием параметрического теста Стьюдента — Фишера и непараметрического метода Вилкоксона — Манна — уитни.
Результаты и их обсуждение
Результаты исследований показали, что наиболее активными являлись композиции HAEOfl и RbAEOfl при введении препаратов в высших терапевтических дозах. К окончанию курса лечения (11 недель) зарегистри-
рованы сокращение летальности животных, достоверное снижение коэффициентов массы легких в 1,85—2 раза (р<0,001) и индексов их поражения — в 1,3—1,6 раза (р<0,001), коэффициентов массы селезенки — в 1,4— 1,6 раза (р<0,01), повышение клиренса легких от МБТ на 63,6—65,5% (р<0,02) по сравнению с зараженными нелеченными животными.
Замена одного из базовых препаратов (Н или Rb) в вышеуказанных композициях на пиразинамид привела к снижению лечебного эффекта за счет достоверного увеличения обсемененности легких МБТ и индекса их поражения (р<0,02) при сопоставимых показателях коэффициентов массы внутренних органов. Малоэффективной оказалась композиция CapPtEOfl, при использовании которой достоверно снизились только два из четырех параметров: коэффициент массы легких — в 1,4 раза (р<0,002), селезенки — в 1,2 раза (р=0,05).
Включение пятого противотуберкулезного препарата не оказало существенного влияния на эффективность лечения мышей, а добавление Н к наиболее активной композиции RbAEOfl снизило ее терапевтическое действие на 11,6—24%.
Ранее на классических моделях экспериментального туберкулеза показана сопоставимость терапевтического действия известных ПТП (Е, Ой) и оригинального препарата «Перхлозон» (патент РФ № 1621449), разработанного нами совместно с Иркутским институтом химии СО РАН. При экспериментальном туберкулезе с множественной лекарственной устойчивостью замена Н или Rb в четырехкомпонентных схемах на перхло-зон показала высокую результативность. Критерии тяжести туберкулезного процесса у мышей, получавших перхлозон, оказались сравнимы, а некоторые (летальность, индекс поражения легких, бактериовыделение) в 1,2—1,75 раза (р<0,05) ниже, чем при назна-
чении НАЕОЙ или RbAEOfl. Установлена равноценность лечебного действия композиций CapPtE + перхлозон и CapPtEOfl.
Изучена эффективность этиотропной терапии при включении препаратов с различными механизмами патогенетического действия (бестим, глутоксим и ислацет).
Результаты применения бестима (отечественный синтетический стимулятор дифференциации Т-клеток и продукции интерлей-кина-2) оценивали на фоне двух трехкомпо-нентных комбинаций ПТП: RbOflZ и RbCsPt. Лечебный эффект этих этиотропных схем отмечен только по отдельным показателям и лишь после 6 недель терапии. С целью повышения результативности лечения применяли два курса бестима (по 5 инъекций с перерывом два дня, всего 10 инъекций). В этих условиях бестим способствовал снижению тяжести туберкулезного процесса по коэффициенту массы легких, высеваемости МБТ из селезенки, достоверному уменьшению индекса поражения (на 20%, р<0,001) и распространенности альтеративного компонента специфического воспаления легочной ткани. Выявлен существенный стимулирующий эффект бестима на фагоцитарную функцию пе-ритонеальных макрофагов (пМф) мышей. Восстанавливающее действие бестима на поглотительную и переваривающую способность пМф проявилось на всех сроках наблюдения выраженным повышением всех четырех показателей фагоцитоза (на 57— 84%, р<0,05), ингибированных как в ходе прогрессирования инфекции, так и под влиянием длительной массивной этиотропной терапии (рис. 1).
Улучшение результатов химиотерапии наблюдали и при назначении регулятора метаболических процессов глутоксима на фоне оптимальной комбинации HAEOfl, что проявилось через месяц его использования (рис. 2а), а максимальное — к двум месяцам (рис. 2б). При этом глутоксим снизил леталь-
Интактные ПТП ПТП + бестим
ЕШЙ фагоцитарная активность ^^показатель завершенности фагоцитоза
Рис. 1. Влияние бестима на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов ( — достоверность различий по сравнению с интактной группой; ** — достоверность различий по сравнению с контролем лечения)
О 50 100 150
ЕВ контроль заражения
О изониазид+амикацин +офл<жсацин+этамбутол ■ ГГТП + глутоксим
б I I
О 25 50 1«)
Рис. 2. Влияние глутоксима на показатели тяжести лекарственно-устойчивого туберкулеза у мышей: а — через один месяц терапии; б — через два месяца (в % к контролю лечения). I — высеваемость МБТ из селезенки; II — индекс
поражения легких; III — коэффициент массы легких; IV—летальность (' — достоверность различий по сравнению с группой контроля заражения; ** — достоверность различий по сравнению с мышами, получавшими НЛЕ0/1)
ность в 4 раза, высеваемость МБТ — в 2,2 раза (р<0,05), индекс поражения легких — на 23% (р<0,001), коэффициент их массы — на 25% (р<0,05).
Действие глутоксима на фагоцитарную активность пМф мышей имело ту же направленность, что и при использовании бестима. Так, по сравнению с достоверно ингибиро-ванными показателями фагоцитоза у мышей, получавших НЛЕОА, под влиянием глутокси-ма фагоцитарная активность пМф увеличилась в 1,3 и 1,7 раза (соответственно через месяц и через два месяца терапии, р<0,05, р<0,001); фагоцитарное число — в 1,5 и 1,8 раза (р<0,001); показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) — в 1,3 и 2,4 раза (р<0,05, р<0,001); индекс завершенности фагоцитоза — в 2 и 2,5 раза (р<0,01, р<0,001). Таким образом, параметры активности фагоцитоза пМф у мышей, леченных глутоксимом, сохраняли стабильные значения на протяжении всего курса терапии.
Ислацет — сухой экстракт из слоевищ цетрарии исландской, по нашим данным, обладает прямым ингибирующим эффектом на ростовые свойства штаммов МБТ с различным спектром лекарственной чувствительности, а также выраженным активирующим действием на пролиферацию спленоцитов и продукцию ими интерлейкина-2, стимулирует фагоцитоз и генерацию супероксиданио-на пМф.
В условиях назначения ислацета на фоне НЛЕОА или КЬЛЕОЙ при экспериментальном МЛУ туберкулезе наблюдали значительное уменьшение показателей пораженности органов. Так, применение ислацета в составе НАЕОА приводило к снижению в 1,6 раза среднего суммарного показателя поражен-ности за счет достоверного уменьшения коэффициента массы легких и индекса их поражения (р<0,05), а также сокращения в 1,6 раза высеваемости МБТ из селезенки (р<0,05). На фоне использования МэАЕОА
биология и экспериментальная медицина
ислацет снизил средний суммарный показатель пораженности в 1,7 раза, уменьшив коэффициент массы легких и индекс их поражения в 1,2—1,4 раза (р<0,05), а также обсе-мененность селезенки МБТ в 1,7 раза (р<0,05) (рис. 3).
Активирующая роль ислацета на иммунную систему установлена при тестировании фагоцитарной функции пМф мышей, что проявилось в его стимулирующем действии по всем тестам фагоцитарной функции пМф, причем более выраженном — на показатели их переваривающей способности (рис. 3). Под влиянием ислацета поглотительная активность на фоне HAEOfl достоверно увеличилась в 1,4 раза (р<0,01), переваривающая — в 2,2 раза (р<0,01) по сравнению с показателями базовой композиции.
I.
ПТ П 1+ м с л а ц е т
|высеиеиость мбт
-показатель завершенности iterouHTûîi
Рис. 3. Влияние ислацета на высеваемость МБТ из селезенки
(КОЕ) и завершенность фагоцитоза (ПЗФ) макрофагов при экспериментальном лекарственно-устойчивом туберкулезе на фоне противотуберкулезной терапии (* — достоверность различий по отношению к контролю лечения)
При включении ислацета в состав RbAEOfl наблюдали достоверное повышение поглотительной способности пМф в 1,3 раза (р<0,01), переваривающей — в 2,2 раза (р<0,01) по сравнению с параметрами контроля лечения.
Выводы
При экспериментальном лекарственно-устойчивом туберкулезе оптимальными являлись комбинации этиотропной терапии HAEOfl и RbAEOfl. В этих режимах химиотерапии замена Н и Rb на оригинальный этиотропный препарат «Перхлозон» давала сопоставимый результирующий лечебный эффект, что, вероятно, обусловлено применением в опытах штаммов МБТ с лекарственной устойчивостью к Н и R. Эти данные свидетельствуют о возможности расширения спектра ПТП резервного ряда для использования во фтизиатрии за счет перхлозона. Эффективность лечения МЛУ туберкулеза значительно усиливалась за счет введения в схемы химиотерапии препаратов, различными путями стимулирующих активность иммунной системы макроорганизма. Использование бестима, глутоксима и ислацета существенно повышает поглотительную и переваривающую способность основных эли-минаторов МБТ — макрофагов, угнетенную в ходе развития туберкулезного процесса и под влиянием длительной терапии противотуберкулезными препаратами.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Мишин В. Ю. Эффективность лечения туберкулеза легких, вызванного микобакте-риями с множественной лекарственной устойчивостью/В. Ю. Мишин, В. И. Чука-нов, И. А Васильева//Пробл. туберкулеза.— 2002.— № 12.— С. 18—23.
2. Туберкулез в Российской Федерации/ Н. Б. Найговзина, В. Б. Филатова, В. В. Еро-
хин, В. В. Пунга^//Эпидемиология и инфекционные болезни.— 2009.— № 3.— С. 4—11.
3. Шилова М. В. Эпидемическая обстановка по туберкулезу в Российской Федерации к началу 2009 г./М. В. Шилова //Туберкулез и болезни легких.— 2010.— № 5.— С. 14—21.
4. Rieder H. L. Socialization patterns are key to transmission dynamics of tuberculosis/ H. L Rieder//]. Tuberc. Lung Dis.— 1993.— № 3.— P. 177—178.
T. I. Vinogradova, N. V. Zabolotnykh, S. N. Vasilyeva, M. L. Vitovskaya, E. I. Malygina
development of optimal schemes
of drug-resistant tuberculosis
therapy in experiment
The main and reserve antituberculous drugs combined with new preparation perchlosone as well as pathogenetic remedies (bestim, glutoxim, islacet) in treatment of generalized drug-resistant tuberculosis were investigated in 1300 outbred white mice. HAEOfl and RbAEOfl compositions in the highest therapeutic doses occurred to be
effective. Substitution of H or Rb for perchlosone in the four-component schemes led to reduction of indices showing severity of infectious course. Bestim, against the background of two three-component RbOflZ and RbCsPt combinations, promoted decline in tuberculosis severity and restoration of absorbing and digestive ability of macrophages inhibited by long concentrated etiotropic therapy. Glutoxim combined with HAEOfl reliably improved results of treatment. Its effect on phagocytic activity of mice peritoneal macrophages was of the same direction as that of bestim. Islacet in HAEOfl and RbAEOfl schemes led to lowering of organ affection indices and essentially elevated absorbing and digestive ability of macrophages.
Keywords: drug-resistant tuberculosis, anti-TB drugs, perchlosone, bestim, glutoxim, islacet.
Контактная информация: Виноградова Татьяна Ивановна, доктор мед. наук, профессор, ученый секретарь Санкт-Петербургского научно-исследовательского института фтизиопульмонологии, 191036, г. Санкт-Петербург,Лиговский пр., 2—4, тел./факс (812) 579-25-84
Материал поступил в редакцию 05.08.2010
