CC BY
48
Ростовской области весной 2004 г. Эктопаразиты, собранные на территории, неэндемичной по КГЛ, представлены клещами вида Ixodes persulcatus.
Проведенные на втором этапе исследования показали, что испытуемая тест-система выявляла 7 (20,6 %) положительных проб клещей. При исследовании этого же материала методом иммунофер-ментного анализа (ИФА) специфический антиген выявлен в 6 случаях (17,6 %). Все положительные в ПЦР пробы были положительными в ИФА и сформированы из клещей, собранных на территории Астраханской области.
Таким образом, показано, что сконструированная тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР обеспечивает высокую точность анализа и может быть использована для проведения эпизоотологического мониторинга природных очагов КГЛ. Отчет о проведенных государственных испытаниях одобрен Ученым советом ГИСК им. Л.А.Тарасевича и утвержден Комитетом МИБП.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Аристова В. А., Колобухина Л.В., Щелканов М.Ю., Львов Д.К. // Вопр. вирусол. - 2001. - № 4. - С. 715. - 2. Бутенко А.М. // РЭТ-инфо. - 2005. - № 2. - С. 5256. - 3. Бутенко А.М., Ларичев В.Ф. //. Изменение климата и здоровья населения России в XXI веке: Матер. междунар.
симпоз. - М., 2004. - С. 134-138. - 4. Здоровье населения и среда обитания. - 2005. - № 4. - С. 56. - 5. Карань Л.С., Шипулин Г.А., Платонов А.Е. // Клин. лаб. диагностика. - 2003. - № 10 - С. 50-54. - 6. Колобухина Л.В., Щелканов М.Ю., Львов Д.К. // Инфекционные болезни и антимикробные средства: Тез. докл. - М., 2005. - С. 19-20. -7. Черкасский Б. Л. Руководство по общей эпидемиологии. -М.: Медицина, 2001. - 8. Яшина Л.Н., Петров В.С., Вы-шемирский О.И. и др. // Вопр. вирусол. - 2002. - № 4. -С. 11-15.
E.V.Naidenova, I.N.Sharova, S.A.Scherbakova, Yu.I.Yashechkin, N.V.Khutoretskaya, V.F.Larichev, K.A.Sarkisyan, M.S.Vorobyova, A.M.Butenko, A.N.Kulichenko, D.K.L’vov, V.V.Kutyrev
A Test System to Reveal RNA of the Congo-Crimean Hemorrhagic Fever Virus Using RT-PCR Procedure
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov;
D.I.Ivanovsky Virology Research Institute,
LA.Tarasevich State Institute of Control and Standardization, Moscow
Described in the paper is the development and approbation of a testsystem, “GenCongo”, designed for the detection of CCHF virus RNA using the method of reverse transcription combined with polymerase chain reaction. The efficacy of the test-system was verified by the state trials realized at L.A.Tarasevich SICS.
Key words: CCHF virus, laboratory diagnosis, PCR testing.
nocTynu^a 30.05.06.
БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 616.981.452+616.981.455:576.809.7
С.А.Еремин, О.А.Волох, И.А.Шепелев, С.М.Дальвадянц, И.А.Дятлов
РАЗРАБОТКА НОВЫХ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СХЕМ И МАСШТАБИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ ЧУМНОГО И ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБОВ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Описаны различные способы культивирования микроорганизмов и рассмотрены их преимущества и недостатки. Представлены основные направления масштабирования процессов получения антигенов чумного и туля-ремийного микробов, включающие в себя поиск перспективных штаммов продуцентов, выбор способов культивирования, концентрирования, выделения и очистки антигенов.
Ключевые слова: масштабирование, культивирование, химическая вакцина.
С задачами масштабирования исследователи и практики, работающие с вакцинными штаммами, сталкиваются постоянно. Под масштабированием целесообразно понимать теоретически и экспериментально обоснованную совокупность приемов и методов, обеспечивающих создание оптимальных условий при переносе процесса культивирования вакцинных штаммов в пробирке к культивированию их в колбах, бутылях и далее в ферментерах. Для того чтобы процесс был использован в практике, необходимо также обеспечить соответствующий уровень выделения и очистки антигенов, их сушки и стерилизации.
При планировании производства вакцинных
препаратов существенную роль играет выбор процесса культивирования, который сразу должен быть нацелен на конечную цель и соответствовать будущим масштабам производства.
Известно множество способов культивирования. Они различаются по состоянию питательной среды - поверхностные и глубинные, наличию или отсутствию перемешивания - динамичные и статичные, способу действия - закрытые (чаще периодические) и открытые (чаще непрерывные), способу управления - хемостатные, турбидостатные, рН-статные и т. д.
Современный способ культивирования микроорганизмов - это управляемое глубинное культиви-
рование. Управление может быть частичным или полным, осуществляться вручную или автоматически по заданной программе. Средствами управления или управляющими воздействиями являются: концентрация субстрата, рН среды, температура, скорость вращения мешалки, подача газа, содержание растворенного в среде кислорода и др.
Простейшая классификация глубинных управляемых систем или процессов культивирования микроорганизмов в ферментерах включает: периодическое культивирование (лаг-фаза, фаза ускорен -ного роста, экспотенциальная фаза, фаза замедления роста, стационарная фаза и фаза отмирания); продленный периодический процесс с подпиткой; многоциклическое культивирование; полунепрерывное культивирование (при таком культивировании скорость роста постоянна, а концентрация микроорганизмов колеблется около постоянной величины); непрерывное культивирование, при котором концентрация микроорганизмов и скорость роста являются постоянными величинами.
Схематично эти процессы выглядят следующим образом:
1. Периодическое культивирование осуществляется в одном ферментере, в который вносится питательная среда и посевная культура. Простая периодическая культура содержит ограниченное первоначальное содержание питательного субстрата и служит примером закрытой системы. В закрытой системе скорость роста стремится к нулю либо из-за недостатка субстрата, либо за счет ингибирующего действия конечного продукта или метаболитов. Для простых периодических систем характерен режим питания экстремального типа, т.е. рост при избытке субстрата внезапно меняется голоданием. Микроорганизмы в такой системе не успевают адаптировать свою структуру для оптимальной скорости роста.
Основным недостатком закрытой системы является ее неустойчивость и плохая управляемость. Эти недостатки возможно преодолеть с помощью специально разработанной системы управления и с введением стимулирующих добавок, как, например, при производстве холерной химической вакцины -используется периодическое культивирование с подкормкой глюкозой и внесением раствора аммиака для коррекции рН.
2. Одним из вариантов периодического культивирования является полунепрерывное культивирование - сливно-доливной метод (1 ферментер слив культуры в экспотенциальной фазе 0,5 объема и долив такого же количества свежей среды). Этот метод позволяет получать большее количество биомассы и продукта за меньший промежуток времени.
3. Непрерывное культивирование или хемостат представляет собой культуру, в которую с постоянной скоростью непрерывно подается свежая среда, а объем культуры при этом поддерживается на одном уровне. Для определения скорости подачи среды могут использоваться различные способы - определение концентрации биомассы (фотоэлемент), рН, кислорода, субстрата и др. Основным достоинством метода непрерывного культивирования является возможность управления скоростью роста.
4. Возможно объединение 2 ферментеров в однопоточную систему. Такие системы используются,
когда применяется сложная среда с несколькими источниками углерода или азота, чтобы обеспечить использование всех субстратов. Непосредственный контроль за состоянием популяции и субстрата при непрерывном культивировании осуществляется с помощью многоканальных световых зондов и трассеров, лазерных установок, световолоконной оптики и биочипов. Контролирующие аппараты подключены к компьютеру, что позволяет делать процесс культивирования микроорганизмов не только управляемым, но и полностью автоматизированным.
Таким образом, можно сделать вывод, что наиболее прогрессивным способом является непрерывное культивирование.
Однако, несмотря на все преимущества непрерывного способа культивирования, периодическое культивирование все еще является основным способом выращивания бактерий при производстве вакцин и анатоксинов, так как требует меньших капиталовложений на ферментационное оборудование и системы контроля.
Для масштабирования производства чумной химической вакцины необходимо подобрать перспективные штаммы-продуценты, определить оптимальный способ их культивирования и применить современные методы выделения и очистки основных антигенов чумного микроба.
Разработанная в институте «Микроб» С.М.Даль-вадянцем с соавт. [3, 5] чумная химическая вакцина для ревакцинации людей против чумы состоит из антигена Ф1 чумного микроба, выделенного из штамма Yersinia pestis EV, и основного соматического антигена (ОСА), полученного из штамма псевдотуберкулезного микроба 53. Первые лабораторные и экспериментально-производственные серии вакцины получены при культивировании штаммов продуцентов на твердых питательных средах на АКМШ. Работа на этих аппаратах довольно сложная - основная проблема заключается в обеспечении стерильности твердой питательной среды во время подготовки аппарата и в период выращивания. Как уже говорилось выше, выращивание на твердых питательных средах не позволяет управлять процессом культивирования, кроме того твердые питательные среды весьма дорогостоящие.
Способы выделения Ф1 (из ацетонвысушенных клеток) [12] и ОСА (экстракция треххлоруксусной кислотой) [1], использованные при производстве первых экспериментальных серий вакцины, довольно трудоемки, занимают много времени и нетехнологичны. Предложенный В.И.Вейнблатом с соавт. [2] способ получения Ф1 из культуральной жидкости бульонной культуры штамма Y. pestis EV путем последовательного осаждения сульфатом аммония также имеет ряд недостатков - троекратное осаждение сульфатом аммония и последующий диализ делают процесс выделения очень длительным (до 12 сут), что делает его малопригодным для внедрения в производство.
Перед нами стояла задача - применить в условиях масштабируемого производства чумной химической вакцины глубинный способ культивирования штаммов-продуцентов и современные щадящие способы выделения антигенных компонентов вакцины.
В результате проведенных исследований были
определены условия периодического культивирования штаммов продуцентов Ф1 и ОСА сначала на малых объемах (в колбах 250 мл на термостатируе-мой качалке), а затем в 10 л ферментере «New Brunswik М-19». Выращивание осуществляли на бульоне Хоттингера (рН 7,2), с добавлением цистеина, с дробной подкормкой глюкозой при 37 °С в течение 27 ч. В качестве штамма-продуцента Ф1 использовали штамм Y. pestis EV, штамм Y. pestis КМ277, любезно предоставленный О. А. Проценко, содержащий в своем геноме одну плазмиду pFra и бесплаз-мидный вариант штамма Y. pestis EV, несущий в своем геноме плазмиду pFSK3, кодирующую синтез Ф1 [7]. Основным достоинством этого штамма является способность расти при 28 °С и отсутствие собственных плазмид.
Выделение Ф1 чумного микроба из культуральной жидкости осуществляли осаждением в изо-электрической точке по методу М.М.Титенко с соавт. [9] в модификации И. А. Дятлова [4].
Культивирование штамма Yersinia рseudotuber-culosis 53 также осуществляли на бульоне Хоттин-гера (рН 7,2) при 28 °С в условиях периодического культивирования на пилотном ферментере без добавления цистеина и без подкормки глюкозой.
ОСА выделяли из культуральной жидкости осаждением сульфатом аммония (при конечной концентрации 55 и 75 %) и из клеток бульонной культуры экстракцией треххлоруксусной кислотой. Из клеток агаровой культуры (с 30 л агаровой среды) получено 300 мг сухого препарата ОСА; из клеток бульонной культуры (с 30 л бульонной среды) -180 мг ОСА; из центрифугата бульонной культуры - 200 мг Оса.).
В результате проведенных исследований разработана новая технология получения антигенных компонентов ХЧВ с использованием управляемого глубинного метода культивирования штаммов-продуцентов и более современных и технологичных методов выделения Ф1 и ОСА. Были сконструированы 3 серии вакцины: 1-я - Ф1 выделена из бульонной культуры Y. pestis EV, ОСА получен из бульонной культуры Y. рseudotuberculosis 53; 2-я - Ф1 выделена из бульонной культуры Y. pestis КМ 277, ОСА получен из бульонной культуры Y. рseudotu-berculosis 53; 3-я - Ф1 выделена из агаровой культуры Y. pestis EV, ОСА получен из агаровой культуры Y. рseudotuberculosis 53.
Протективность полученных препаратов изучали в тесте активной защиты мышей. В результате установлено, что по специфической активности серия ХЧВ 1, сконструированная из препаратов Ф1 и ОСА, полученных из бульонных культур с использованием элементов новой технологии, не отличалась от серии ХЧВ, полученной из агаровых культур традиционными методами, и не превышала 1/2 человекодозы. 2-я серия вакцины с Ф1, выделенной из штамма Y. pestis КМ 277, обеспечивала защиту от заражения чумой с такой же активностью, как 1-я и 3-я серии ХЧВ.
Таким образом, проведенные исследования позволят внедрить в производство ХЧВ новые, более совершенные, схемы культивирования и выделения антигенов чумного микроба.
Следующий этап исследования направлен на
разработку новых технологических схем культивирования туляремийного микроба и выделения его антигенных комплексов.
В оригинальных статьях В.С.Хлебникова с со-авт. сообщалось о выделении из вакцинного штамма Francisella tularensis 15 антигенного комплекса, обладающего высокой протективной способностью, и перспективного в качестве основы для химической вакцины против туляремии [10]. Выращивание вакцинного штамма туляремийного микроба осуществляли на L-бульоне, а выделение антигенного комплекса проводили из разрушенных клеток на ультрацентрифуге при 100 тыс. об/мин.
L-бульон богатая, но дорогостоящая среда и ее использование в производственных целях экономически не выгодно. Метод выделения антигенного комплекса с использованием ультрацентрифуги также не приемлем для масштабируемого производства. В связи с этим нами был проведен сравнительный анализ жидких питательных сред (L-бульон, BHI, Т-среда, FT-агар) для культивирования туля-ремийного микроба [11]. Наиболее оптимальной по цене и качеству оказалась среда FT-агар на основе рыбного гидролизата.
Культивирование туляремийного микроба осуществляли на 10 л ферментере «New Brunswik М-19». За 12 ч культивирования концентрация биомассы достигала 12-14 млрд м.к./мл. Подкормка глюкозо-витаминной добавкой в процессе роста не дала существенного увеличения биомассы.
Для увеличения выхода биомассы нами был применен сливно-доливной способ культивирования [8]. Слив 0,5 объема культуры и добавление свежей среды осуществляли через каждые 4 ч по достижении концентрации 11-12 млрд м.к./мл, в период экспотенциального роста культуры. В результате за 28 ч культивирования получено 14 л культуры с концентрацией 12 млрд м. к./мл при начальном объеме 4 л.
Данный способ культивирования может быть успешно использован в условиях производства вакцины, так как не требует сложной дополнительной технологической аппаратуры.
Для получения С-комплекса биомассу туляре-мийного микроба инактивировали фенолом (до конечной концентрации 1 %). Освобождение от клеточной массы осуществляли центрифугированием или на сепараторе АСГ 3М при 9000 об./мин. Выделение поверхностного антигенного комплекса из культуральной жидкости проводили методом изопреципитации. Для уменьшения рабочего объема жидкости рН доводили до 4,2, осадок отделяли центрифугированием, суспендировали в дистиллированной воде (рН 7,0), а затем освобождались от балластных веществ при постепенном понижении рН. Концентрирование препарата проводили переосаж-дением в изоэлектрической точке (рН 4,3±0,1). С поверхности клеток С-комплекс получали гидродинамическим смывом с последующим поэтапным осаждением в изоэлектрической точке [6].
Для оптимизации процесса получения антигенного комплекса из больших объемов биомассы проведены эксперименты по мембранной фильтрации на всех этапах выделения продукта. Использовали мембраны с размером пор от 2 до 0,22 мкм, а также
«ядерные» мембраны и фильтры для грубой очистки (картон, фильтровальная бумага). В работе применяли фильтрационную ячейку «Ашюоп», ^рабочее давление воздуха составляло 0,8-1,0 кгс/см2. В результате были подобраны мембраны для освобождения от балластных веществ в процессе поэтапного выделения С-комплекса. Кроме того, мы попытались применить ультрафильтрационный волоконный аппарат для концентрирования биомассы, полученной в ходе глубинного культивирования. Для этого 14 л культуральной жидкости, полученной при выращивании туляремийного микроба в ферментере, сконцентрировали на ультрафильтрационном волоконном аппарате марки УВА-ПС-17-1040 (предел исключения 17 кДа) с диаметром пор от 35-45 микрон. Скорость фильтрации составила 240 мл/мин при давлении 0,01 мПа, время фильтрации 1 ч 45 мин. Объем полученного концентрата - 1,5 л. Использование метода ультрафильтрации на полых волокнах позволяет за короткое время получать 10-кратный концентрат культуральной жидкости, что упрощает дальнейшее выделение антигенного препарата.
Из всех испытанных методов наиболее перспективным для внедрения в производство является метод получения антигенного комплекса в изоточке, так как он не требует больших временных затрат и дорогостоящего оборудования.
В результате проведенных исследований разработана новая технология получения антигенного комплекса туляремийного микроба с использованием сливно-доливного метода культивирования на среде БТ-агар, более совершенного и технологичного метода выделения антигенного комплекса -изоэлектрической преципитации и концентрации с использованием баромембранной технологии.
Таким образом, использование новых штаммов продуцентов, более совершенных способов культивирования и более технологических способов выделения антигенов позволило усовершенствовать и масштабировать технологию получения антигенов чумного и туляремийного микробов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бахрах Е.Э., Вейнблат В.И. // Пробл. особо опасных инф. - 1970. - Вып. 1 (11). - С. 109-115. - 2. Вейнблат В.И., Дальвадянц С.М., Веренков М.С. // Лаб. дело. -1983. - № 12. - С. 37-39. - 3. Дальвадянц С.М., Кутырев
B.В., Дятлов И.А., Еремин С.А. // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2003 - Вып. 85. - С. 157-163. - 4. Дятлов И. А. Разработка технологий экспериментального и производственного аппаратного культивирования чумного микроба: Дис. ... док. мед. наук. - Саратов, 1992. - 407 с. - 5. Евстигнеев В.И., Кутырев В.В., Дальвадянц С.М. и др. // Диагн., лечение и профилакт. опасных инф. забол. Биотехнология. Ветеринария: Матер. Юбил. науч. конф. - Киров, 1998. -
C. 86-87. - 6. Жемчугов В.Е., Дятлов И.А., Кутырев В.В., Волох О.А. Способ получения препарата для активной иммунизации против туляремии. Патент на изобретение РФ № 2221591. Зарегистрирован в Гос. реестре изобретений РФ 20.01.2004 г. - 7. Никифоров А.К. Конструирование штаммов суперпродуцентов капсульного антигена Yersinia pestis: Дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 1995. - 143 с. - 8. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. - М.: Мир, 1978. - 131 с. - 9. Титенко М.М., Вейнблат В.И., Веренков М. С., Васенин А. С. // Диагн. и профилакт. особо опасных инф. - Саратов, 1983. - С. 34-39. - 10. Хлебников В.С., Головлев И.Р., Кулевацкий Д.П. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. - 1991. - № 7. - С. 15-20. - 11. Шепелев И. А., Дятлов И. А., Волох О. А. и др. // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2003. - Вып. 85. - С. 157-163. -12. Baker E.E., Sommer H., Foster L.E. et al. // J. Immunol. - 1952. - Vol. 68, N 2. - P. 131-145.
S.A.Yeremin, O.A.Volokh, I.A.Shepelev, S.M.Dalvadyants, I.A.Dyatlov
Designation of New Technological Patterns and Ranging the Processes of Deriving the Antigens from the Plague and Tularemia Microbial Agents
Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe ", Saratov
Considered in the work are various processes of microbe culturing with their advantages and disadvantages. The main ways of scaling the processes to obtain the plague and tularemia microbial agents’ antigens are described including the search for promising producer strains, the choice of cultivation techniques, antigen concentration, isolation, and purification procedures.
Key words: scaling, cultivation, chemical vaccines.
Поступила 09.12.05.
УДК 616.981.455
И.А.Шепелёв, О.А.Волох, С.А.Ерёмин, И.А.Дятлов
ОПТИМИЗАЦИЯ СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕКТИВНОГО «С»-КОМПЛЕКСА ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА
Российский научно-исследовательский институт «Микроб», Саратов
В работе представлены данные по усовершенствованию способа выделения протективного «С»-комплекса как с поверхности клеток штамма-продуцента туляремийного микроба, так и из культуральной жидкости. Установлено, что препарат «С»-комплекса, выделенный из культуральной жидкости, не уступает по своему составу и основным иммунохимическим свойствам антигенному комплексу, полученному с поверхности клеток туляремийного микроба независимо от способа выращивания. Показана возможность усовершенствованя процесса выделения «С»-комплекса с помощью ультрафильтрации. Применение ультрафильтрационного волоконного аппарата позволяет за короткое время получать концентрат культуральной жидкости и является перспективным в плане масштабирования технологии получения «С»-комплекса.
Ключевые слова: Егапсіі'еііа їиіагетіі', антиген, иммуногенность, ультрафильтрация.
Вакцины, используемые до настоящего времени в большинстве стран мира, содержат практически полный набор антигенов, свойственных данному возбудителю при культивировании на пита-
тельных средах. Причем, наряду с веществами, определяющими протективный эффект, вакцины содержат также компоненты, обуславливающие реак-тогенность препарата или являющиеся балластом, и
