CC BY
11УДК 619:579.887.11:573.6.086.83:57.083.3:616-074 М.В. Челышева, А.В. Щербаков
РАЗРАБОТКА НЕПРЯМОГО ВАРИАНТА ИФА НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА P65 ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE
Введение
В настоящее время Mycoplasma hyo-pneumoniae, как наиболее значимый в эпи-зоотологическом плане вид микоплазм, представляет серьезную угрозу здоровью свиней и имеет особое значение в условиях интенсивного содержания животных. M. hyopneumoniae вызывает энзоотическую пневмонию свиней - инфекционную хроническую болезнь, характеризующу-
юся катаральной бронхопневмонией, непостоянной лихорадкой, кашлем, задержкой роста поросят и прогрессирующим исхуданием при осложнениях [4, 5]. В сочетании с другими респираторными патогенами (вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней, вирус гриппа свиней, Pas-temetta multocida, ActinobacШш pleuropneu-moniae и т. д.) вызывает комплекс респираторных заболеваний свиней, что отягощает проявление основных симптомов пневмонии. Ранняя диагностика инфекции и изоляция инфицированных свиней из стада являются наиболее эффективными средствами предупреждения распространения и развития болезни.
Энзоотическую пневмонию диагностируют путем обнаружения у больных животных M. hyopneumoniae или антител к ней. Для выявления антител к M. hyopneu-moniae в сыворотках крови свиней используются такие методы диагностики, как реакция связывания комплемента, реакция непрямой гемагглютинации и иммуно-ферментный анализ (ИФА). Однако специфичность этих методов невысока из-за перекрестных реакций с другими микоп-лазмами свиней, что обусловлено наличием общих антигенов у M. hyopneumoniae, M.hyorhinis и M. flocculare [4, 6].
В связи с этим перспективным направлением в диагностике энзоотической пневмонии является разработка и использование ИФА на основе видоспецифичных белков M. hyopneumoniae. В настоящее время у M. hyopneumoniae идентифицированы несколько видоспецифичных иммунодо-минантных белков, среди них поверхностные протеины р46, р65 и р97 [4].
Цель данной работы состояла в получении рекомбинантного белка р65 и раз-
работке на его основе непрямого варианта ИФА для выявления антител к M. hyopneu-moniae в сыворотках крови свиней.
Материалы и методы
Микроорганизмы. Для клонирования использовали полевой изолят M. hyopneu-moniae, выделенный из легких больного поросенка.
Выделение бактериальной ДНК из суспензии осуществляли с использованием 6 М гуанидинтиоцианата и стекловолок-нистых фильтров GF/F [1].
ПЦР. Для проведения ПЦР собирали реакционную смесь, которая содержала 5 мкл 10Ч буфера для Taq-полимеразы, 3 мМ Mg2+, 0,2 мМ dNTPs, 2 ед. Taq-ДНК-полиме-разы, по 20 пмоль праймеров, 5 мкл раствора бактериальной ДНК и воду до конечного объема 50 мкл. Реакцию проводили на ДНК-амплификаторе Minicycler PTC-100 (MJ Research, США). Программа включала 35 циклов ПЦР при следующем температурном режиме: 30 сек денатурации при 94° С, 30 сек отжига праймеров при 55° С и 40 сек элонгации при 72° С. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в 2,0%-ном агарозном геле, содержащем 0,001% бромистого этидия, при силе тока 50 мА.
Молекулярное клонирование продуктов ПЦР осуществляли по общепринятым методикам [2].
Экспрессия рекомбинантного белка. Культивирование Е. coli проводили в орбитальном шейкере при 150 об/мин при 37° С. В дневную культуру клеток, достигшую логарифмической фазы роста, добавляли индуктор IPTG (Promega, США). Уровень экспрессии и размер рекомбинантных белков определяли с помощью вертикального электрофореза в 12%-ном ПАА1е.
Сыворотки крови свиней. В качестве положительного контроля использовали сыворотку крови, в которой антитела к M. hyopneumoniae были определены с помощью коммерческого набора «Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit» (IDEXX, США).
В качестве отрицательного контроля использовали нормальную сыворотку, полученную от здорового животного, не име-
ющего антител к M. hyopneumoniae.
Для определения специфичности метода использовали сыворотки крови от животных, имеющих антитела к вирусам реп-родуктивно-респираторного синдрома свиней, классической чумы свиней, болезни Ауески, трансмиссивного гастроэнтерита, цирковирусу свиней 2-го типа.
Для определения чувствительности метода применяли сыворотки крови от свиней с разным уровнем антител.
Все сыворотки были проверены в ИФА с использованием коммерческого набора «Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit» (IDEXX). Постановку и интерпретацию результатов реакции проводили в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.
Непрямой вариант ИФА. Метод последовательных разведений сывороток крови в ИФА проводили по общепринятой схеме с небольшими модификациями. Реком-бинантный белок (концентрация 5 мкг/мл) адсорбировали на 96-луночные полистироловые планшеты фирмы «Nunc» (Дания) в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6) по 100 мкл на лунку. Планшеты инкубировали в течение 16-18 ч при 4° С. Затем отмывали 3 раза буфером PBST (на 1 л раствора: NaCl - 29 г; KCl - 0,2 г; Na2HPO4 - 1,15 г; KjHPO4 - 0,2 г; Tween-20 — 0,1%; рН 7,0). Лунки планшетов блокировали 1% раствором молока в PBST, внося по 100 мкл раствора в каждую из них, и инкубировали 1 ч при 37° С. Планшеты отмывали трехкратно раствором PBST. Методом последовательных двукратных разведений одновременно с исследуемой сывороткой крови наносили отрицательную и положительную контрольные сыворотки, начиная с разведения 1:20. Инкубировали планшеты в термостатируемом шейкере 1 ч при 37° С. Повторяли отмывку планшетов. Затем вносили также по 100 мкл на лунку антивидовой конъюгат (Sigma, США) в рабочем разведении и инкубировали планшеты в аналогичных условиях. После отмывки добавляли субстрат ABTS в том же объеме. Реакцию останавливали через 10-15 мин добавлением 1% додецил-сульфата натрия. Учет результатов производили на спектрофотометре «Униплан» (г. Москва) при длине волны 405 нм.
Таким образом, методом последовательных двукратных разведений сывороток крови в ИФА определяли титр антител в пробах. Титром исследуемой сыворотки считали последнее ее разведение, в котором значение оптической плотности (ОП)
вдвое превышало среднее значение оптической плотности отрицательного контроля.
Непрямой вариант ИФА для выявления антител к M. hyopneumoniae по одному разведению сывороток крови проводили по вышеприведенной схеме, но исследуемые и контрольные сыворотки вносили в блокирующем буфере в разведении 1:40.
Методом одного разведения в ИФА определяли значение процента позитивности (ПП) по формуле:
(ОП пробы - ОП К-) / (ОП К+ - ОП К) х 100%, где ОП пробы — оптическая плотность исследуемой сыворотки, ОП К- — оптическая плотность отрицательной контрольной сыворотки, ОП К+ — оптическая плотность положительной контрольной сыворотки.
Диагностическую чувствительность и специфичность вычисляли по формулам, рекомендованным Международным эпизоотическим бюро: Дч = (ИП / ИП + Л0)х100%; Дспец = (ИО / ИЪ + ЛП)х100%, где ИП — истинно положительный результат, ЛО — ложноотрицательный результат, ИО — истинно отрицательный результат, ЛП — ложноположительный результат.
Результаты и обсуждение Разработка непрямого варианта ИФА
ДНК M. hyopneumoniae выделяли из 10% суспензии легких поросенка с признаками пневмонии. Ген, кодирующий белок р65, амплифицировали методом ПЦР. В реакции использовали праймеры, содержащие сайты рестрикции Bam HI и Hind III. После обработки соответствующими рес-триктазами ампликон клонировали в экс-прессирующий плазмидный вектор. В результате трансформации рекомбинантной плазмидой компетентных клеток E.coli получили клоны, экспрессирующие белок р65 M. hyopneumoniae, содержащий на N-конце шесть остатков гистидина. Очистку рекомбинантного белка проводили методом металл-хелатной хроматографии. Со 100 мл культуры E.coli было получено 2,5 мг рекомбинантного белка с концентрацией 2 мг/мл.
Антигенную активность белка проверяли в непрямом варианте ИФА с контрольными сыворотками свиней, взятыми в разведении 1:40. Рекомбинантный белок разводили от 1:100 (20 мкг/мл) до 1:6400 (0,313 мкг/мл). Зависимость средней оптической плотности контрольных сывороток от концентрации рекомбинантного ан-
Рисунок 1. Антигенная активность рекомбинантного белка в непрямом ИФА с контрольными сы-
воротками
тигена М. куорпеишотае представлена на рис. 1.
Максимальное разведение белка, при котором еще проявлялась его антигенная активность, составляла 1:1600 (1,25 мкг/мл). Таким образом, в ИФА с контрольными сыворотками белок р65 продемонстрировал высокую антигенную активность. Концентрация белка, равная 5 мкг/мл, была выбрана в качестве рабочей для ИФА.
Для определения рабочего разведения сывороток крови методом последовательного титрования в ИФА исследовали 105 сывороток крови свиней с разным уровнем антител. Для каждой сыворотки вычислили титр и процент позитивности. С помощью компьютерной программы определили коэффициент корреляции, стандартную ошибку, построили отдельные линии регрессии для разведений 1:20, 1:40, 1:80, соответственно. Результаты регрессионного анализа по всем данным представлены в табл. 1.
Из данных табл. 1 следует, что каждое из представленных разведений имеет сильную корреляционную связь, однако наибольшее значение коэффициента корреляции соответствует разведению 1:40 при одинаковых значениях стандартной ошибки 0,05.
Для определения позитивно-негативного порога (ПНП) реакции в ИФА исследовали 94 заведомо отрицательные сыворотки крови свиней в рабочем разведении. Получили среднее значение ОП отрицательных сывороток для разведения 1:40, равное 0,159 оптических единиц (о. е.). Прибавляя к данной величине два и три значения стандартного отклонения, рассчитали нижнюю и верхнюю границы ПНП, что составило
0,17 о.е. и 0,23 о.е. В качестве критерия для разграничения специфической и неспецифической реакций приняли процент позитивности, который вычислили для каждого из определенных значений (0,17 о. е. и 0,23 о. е.). Было установлено, что сыворотки следует считать отрицательными, если процент позитивности меньше 20%, и положительными, если процент позитивности больше 25%. Результаты реакции считались сомнительными, если значение полученного для сыворотки процента позитивности попадало в промежуточный интервал (20-25%).
Для получения достоверных результатов при определении уровня антител по одному разведению сыворотки необходимо было определить допустимые значения ОП контрольных сывороток, исследованных в разведении 1:40. Было показано, что оптимальными значениями ОП контрольных сывороток являются значения, лежащие в диапазоне: для положительного контроля — от 0,800 до 1,400, для отрицательного контроля — от 0,067 до 0,105.
В табл. 2 показаны результаты анализа значений оптической плотности контрольных сывороток, исследованных в разведении 1:40.
Если значения оптической плотности контрольных сывороток выходят за рамки допустимых значений, то результаты реакции будут считаться сомнительными, и пробы должны быть исследованы заново.
Специфичность ИФА на основе рекомбинантного белка определяли по результатам тестирования 153 пробы сывороток крови свиней, не имеющих антител к М. куорпеишотае. Для определения диагностической чувствительности протестировали
Таблица 1
Значения коэффициента корреляции и стандартной ошибки для различных разведений сывороток
Разведение Коэффициент корреляции Стандартная ошибка
1:20 0,87 0,05
1:40 0,91 0,05
1:80 0,90 0,05
Таблица 2
Допустимые значения ОП контрольных сывороток
Отрицательный контроль (N) Положительный контроль(P) Разница между контролями (P-N)
Среднее значение 0,086 1,100 1,014
Доверительный интервал 0,067 - 0,105 0,800 - 1,400 0,734 - 1,294
45 проб серопозитивных сывороток крови. Все сыворотки параллельно тестировались с использованием коммерческого набора «Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit» (IDEXX). Результаты исследования сывороток на наличие антител к M. hyopneumoniae представлены в табл. 3.
По результатам исследования 45 положительных сывороток чувствительность разработанной тест-системы относительно коммерческого набора составила 96,7% (2 ложноотрицательных результата).
При исследовании 153 отрицательных сывороток крови свиней относительная специфичность разработанной тест-системы составила 95,6% (4 ложноположитель-ных результата).
Согласованность двух тестов определяли по методу капа-статистики. Полученные данные представлены в табл. 4.
Абсолютная согласованность результатов ИФА (43+148)/197=0,97; случайная согласованность положительных результатов 0,23 х 0,24=0,055; случайная согласованность отрицательных результатов 0,77 х 0,76=0,585; обобщенная случайная вероятность
Результаты исследования сывороток крови системы и коммерческого набора «Mycoplas
согласованности результатов 0,055 х 0,585=0,032;
наблюдаемая согласованность результатов без учета случайностей 0,97-0,032=0,968;
неслучайная максимально возможная согласованность методов 1-0,032=0,968; k-критерий (капа-статистика):
0.938/0,968=0,97.
Полученное в нашем случае значение k-критерия, равное 0,97, свидетельствует об очень хорошей согласованности результатов двух тест-систем.
Таким образом, в результате проведенных исследований получен рекомбинан-тный белок р65, и на его основе разработан непрямой вариант ИФА для обнаружения антител к M. hyopneumoniae. Показано, что разработанный метод очень хорошо согласуется с коммерческим набором «Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit» (IDEXX, США) - значение k-крите-рия составляет 0,97.
Выводы
1. Методом молекулярного клонирования и экспрессии в Е. coli получен реком-бинантный белок р65 M. hyopneumoniae.
Таблица 3
иней с использованием разработанной тест-hyopneumoniae Antibody Test Kit» (IDEXX)
Статус животного Непрямой вариант ИФА «Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit» (IDEXX)
Животные, не инфицированные М. Нуорпвытотав (153 сыворотки) отр. — 148, пол. — 4, сомн. - 1 отр. — 153
Животные, подозреваемые в заражении М. Нуорпвытотав (45 сывороток ) пол. — 43, отр. — 2 пол. — 45
Таблица 4
Согласованность результатов двух иммуноферментных тест-систем для выявления антител к М. Муорпеитотае в сыворотках крови свиней
Сравниваемые тест-системы Результат в наборе «M. hyopneumoniae Antibody Test Kit» (IDEXX) Всего Выявленная пре-валентность в непрямом ИФА
положительно отрицательно
Результат в непрямом ИФА ВНИИЗЖ положительно 43 4 47 (43+4)/197=0,24
отрицательно 2 148 150 (2+148)/197=0,76
Всего 45 152 197
Выявленная превалентность в наборе «M. hyopneumoniae Antibody Test Kit» (IDEXX) (43+2)/197=0,23 (4+148)/197=0,77
2. На основе рекомбинантного антигена чувствительность разработанного теста p65 разработана иммуноферментная тест- относительно коммерческого набора «My-система для определения антител к M. hyo- coplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit» pneumoniae в сыворотках крови свиней. (IDEXX, США) составляет 95,6% и 96,7%,
3. Установлено, что специфичность и соответственно. РЕЗЮМЕ
Экспрессией в Е. coli получен рекомбинантный белок р65 Mycoplasma hyopneumoniae. На основе ре-комбинантного антигена разработан непрямой вариант иммуноферментного анализа для выявления антител к M. hyopneumoniae в сыворотках крови свиней. Установлена очень хорошая согласованность (k=0,97) разработанной тест-системы и коммерческого набора «Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit» (IDEXX, США).
ABSTRACT
Mycoplasma hyopneumoniae recombinant p65 protein was prepared by expression in E. coli. Indirect enzyme immunoassay has been developed on the basis of recombinant antigen, for the detection of antibodies to M. hyopneumoniae in porcine blood sera. Very good consistency (k=0.97) has been established between the developed test-system and commercial test kit "Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit" (IDEXX, USA).
Литература
1. О.Г. Грибанов, А.В. Щербаков, Н.А. Перевозчи-кова и др. Использование аэросила А-300 и фильтров GF/F (GF/C) для очистки фрагментов ДНК, ДНК-плазмид и РНК // Биохимия. 1996. Т. 21, № 6. С. 1064-1070.
2. Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 399 с.
3. S.N. Done. Enzootic pneumonia (mycoplasmosis) revisited // Pig J. 1996. V 38. P. 40-61.
4. K. Cheikh, IF Shareck, S. Dea. Monoclonal antibodies
to Escherichia coli — expressed p46 and p65 membraneous proteins for specific immunodetection of Mycoplasma hyopneumoniae in lungs of infected pigs // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003. V 10, № 3. P. 459-468.
5. EC Minion, E.J. Lefkowitz, M.L. Madsen et al. The genome sequence of Mycoplasma hyopneumoniae strain 232, the agent of swine mycoplasmosis // J. Bacteriol. 2004. V 186, № 21. P. 7123-7133.
6. E.L. Tracher. Diagnosis of Mycoplasma hyopneumoniae // Anim. Health Res. Rev. 2004. V 5. P 317-320.
УДК 619:616.98:579. 843. 95:578.74:616 - 097:470 О.И. Ручнова, О.В. Прунтова
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕННОГО РОДСТВА ИЗОЛЯТОВ PASTEURELLA МиЕТОСГОА, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Введение
Пастереллезы — остро и хронически протекающие инфекционные болезни сельскохозяйственных животных и птиц. Широко распространены во всех странах мира. Экономический ущерб особенно велик при остром течении болезни, когда проводят вынужденный убой больных животных [1].
Pastвыrвlla mыltocida является наиболее важным патогенным видом рода Pas-tвыrвUa, который имеет широкий круг хозяев, включая большинство млекопитающих, птиц, а также человека. Этот микроорганизм является возбудителем геморрагической септицемии животных (серова-риант В6), холеры птиц (серовариант А1 и А3), а также легочных пастереллезов (се-рогруппы А и Д), осложняющих респира-
торные инфекции вирусной и микоплаз-менной этиологии [2].
Основным звеном в системе мер борьбы с этим заболеванием является специфическая профилактика. Но для того, чтобы вакцины против пастереллеза были эффективны, в их состав должны входить те сероварианты пастерелл, которые вызывают вспышку заболевания.
Установлено, что антигенная структура пастерелл сложна и включает капсуль-ный и соматический антигены. По современной классификации представители вида P. mыltocida подразделяются на 5 кап-сульных серогрупп (А, В, D, Е и F) и 16 се-ровариантов по соматическому антигену (с 1 по 16) [1]. В настоящее время бульшая часть референтных штаммов различных серовариантов пастерелл находится толь-
