CC BY
100
DOI: 10.24411/0235-2451-2018-11116
УДК: 636.3.575
разработка мультиплексной БТР-панели для контроля достоверности происхождения и характеристики генетического разнообразия коз*
С. Н. ПЕТРОВ1, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник (e-mail: citelekle@ gmail.com)
В. Р. ХАРЗИНОВА1, кандидат биологических
наук, ведущий научный сотрудник (e-mail:
Е. А. ГЛАДЫРЬ1, кандидат биологических
наук, ведущий научный сотрудник (e-mail:
Ч. С. САМБУ-ХОО2, кандидат
сельскохозяйственных наук, старший научный
сотрудник (e-mail: [email protected])
Н. А. ЗИНОВЬЕВА1, доктор биологических наук,
академик РАН, директор (e-mail: [email protected])
всероссийский научно-исследовательский институт
животноводства им. Л. К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60,
Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская
Федерация
2Тувинский научно-исследовательский институт сельского хозяйства, ул. Бухтуева, 4, Кызыл, Республика Тыва, 667005, Российская Федерация
Резюме. Панели микросателлитов, известных также под названием STR-маркеров (short tandem repeats), находят широкое применение для контроля достоверности происхождения, оценки состояния аллелофонда, генетической структуры пород и популяций сельскохозяйственныхживотных. Исследования российских пород коз с их использованием ранее не проводили. Цель работы - разработка мультиплексной панели анализа микросателлитов коз и оценка ее информативности. Исследование проводили в 2018 г. Выборка включала коз пород советская шерстная (n=32, Республика Тыва), зааненская (n=42, Ленинградская область) и альпийская (n=23, Екатеринбург). Разработанная панель состоит из 8 STR-локусов: INRA006, ILSTS087, CSRD247, OarFCB020 INRA023, MCM527, SRCRSP024 и ILSTS011 и локуса амелогенина для идентификации половой принадлежности. В качестве биологического материала использовали образцы ткани уха. Полиморфизм девяти маркеров, сформированных в одну панель, определяли по собственным методикам на ДНК-анализаторе ABI3130xl (США). Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета MS Excel2007с плагином GenAlEx v. 6.5. Все микросателлитные локусы, включенные в панель, оказались полиморфными. Число аллелей в локусах варьировало от 4 (OARFCB20) у альпийских коз до 11 (ILSTS087и CSRD247) у коз советской шерстной породы. Вероятность совпадения генотипов индивидуумов (PI) была практически исключена, вероятность исключения в качестве родителей, если генотипы обоих известны (РХ1) для всех пород была выше 99 %. Козы советской шерстной породы имели наибольший уровень генетического разнообразия среди обследованных групп, оцененный по среднему числу аллелей, среднему числу эффективных аллелей в расчете на локус и индексу Шеннона (8,63±0,63, 4,65±0,42 и 1,73±0,08 соответственно ), и генетически относились к собственной породе. Полученные результаты подтвердили высокую информативность разработанной STR-панели, какдля контроля достоверности происхождения, так и для оценки биоразнообразия пород коз. Ключевые слова: микросателлиты, достоверность происхождения, генетическое разнообразие, козы. Для цитирования: Разработка мультиплексной STR-панели для контроля достоверности происхождения и характеристики генетического разнообразия коз/С. Н. Петров, В. Р. Харзинова, Е. А. Гладырь и др. // Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32. № 11. С. 60-63. DOI: 10.24411/0235-2451-2018-11116.
*Работа выполнена в рамках ГЗ -0600-2018-0014.
Анализ ДНК-маркеров позволяет получать информацию о состоянии аллелофонда и генетической структуре пород и популяций сельскохозяйственных животных, оценивать степень генетического родства между ними, выявлять неточности в сведениях о достоверности происхождения индивидуумов [1]. Для этого широко используют микросателлиты или STR (short tandem repeats) -высоко полиморфные короткие тандемные повторы с кодоминантным типом наследования [2].
Большой интерес представляет исследование аллелофонда коз как одного из значимых для человека видов сельскохозяйственных животных. С использованием микросателлитов изучено генетическое разнообразие аборигенных популяций коз восточной и юго-восточной Азии [3, 4], индийских [5, 6, 7, 8] и саудовских пород биши, джабали и тохами [9], китайских кашемировых [10, 11], англонубийской, альпийской, джамунапари, зааненской, тоггенбургской и нативных бразильских пород [12, 13], тибетских [14] и монгольских коз [15]. Исследования российских пород ранее не проводили.
Следует отметить, что информативность результатов исследований микросателлитов повышается с увеличением количества изучаемых локусов и степени их полиморфизма. Поэтому панели микросателлитов, пригодные для исследования одних пород, могут быть менее информативны для других. В этой связи проведению исследований с использованием микросателлитов должен предшествовать анализ информативности применяемых STR-панелей.
Цель исследования - разработка мультиплексной панели для анализа микросателлитов коз и оценка ее информативности.
Условия, материалы и методы. Работу проводили в 2018 г. Первоначально спектр локусов для включения в STR-панель определяли с учетом рекомендаций ISAG для контроля достоверности происхождения пород и популяций коз и возможности сравнения результатов, полученных в лабораториях разных стран. В итоге были отобраны 6 локусов: INRA006, ILSTS087, CSRD247, 0arFCB020, INRA023, MCM527. Кроме того, в мультиплексную панель для характеристики генетического разнообразия представителей рода Capra добавили локусы SRCRSP024 и ILSTS011, обладающие достаточной информативностью и приводимые в большинстве публикаций [16, 17, 18], а также локус амелогенина (AMEL) с целью идентификации половой принадлежности. При выборе локусов учитывали их полиморфный характер и возможность амплификации в одной реакции (близкие температуры плавления праймеров). Выбор красителя для мечения фрагментов осуществляли таким образом, чтобы область одного микросател-литного маркера не пересекалась с областью другого, меченного тем же красителем (рис. 1).
Оценку информативности STR-панели проводили на 97 козах трех пород: советская шерстная (SOV, n=32, МУП
106-128 1 136-158 L 221-251
INRA006 ILSTS087 CSRD247
1 350
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
96-108 145-173 196-216 271-285
1 OARFCB20 SRCRSP0024 INRA023 ILSTS011 350
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
155-173 202-264
МСМ527 AMEL
1 350
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Рис. 1. Схема мультиплексной STR-панели для исследования коз: фрагменты, меченные специфическими флуоресцентными красителями FAM, R6G и NED показаны соответственно в первом, втором и третьем рядах; минимальная и максимальная длины фрагментов соответствующих локусов показаны в парах оснований (п. о.).
«Ангорка», Республика Тыва), зааненская (ZAAN, n=42, ЗАО «Племенной завод Приневское», Ленинградская область) и альпийская (ALP, n=23, Уральский НИВИ и АО «Тепличное» «УГМК-Агро», Екатеринбург).
В качестве биологического материала использовали образцы ткани уха. Выделение ДНК осуществляли с помощью колонок Nexttec («Nexttec Biotechnologie GmbH», Германия) и набора ДНК-Экстран (ЗАО «Синтол», Россия) согласно протоколам фирм-изготовителей. Полимеразную цепную
реакцию (ПЦР) проводили в конечном объеме 15 мкл. Реакционная смесь состояла из 1,5 мкл 10хПЦР-буфера, 1,5 мкл 2мМ растовра dNTPs, 10 мМ смеси праймеров, 0,1 мкл (1UE) Таq-полимеразы («Диалат Лтд», Россия), к которой добавляли 1 мкл (50... 100 нг) геномной ДНК. Состав ПЦР буфера: 16,6 мМ (NH4)2SO4, 67,7 мМ Трис-HCl (pH = 8,8), 0,1 объема Tween 20. После начальной денатурации (95 °С, 7 мин.) проводили 40 циклов амплификации в следующем температурно-временном режиме: 95 °С, 60 с; 58 °С, 60 с; 72 °С, 60 с. Амплификацию выполняли на термоциклере Labcycler (SensoQuest, Германия). Фрагменты исследовали на генетическом анализаторе ABI3130xl («Applied Biosystems», США). Размеры аллелей определяли с помощью программного обеспечения Gene Mapper v. 4 («Applied Biosystems», США). Для обработки результатов анализа формировали матрицу генотипов в формате Microsoft Excel.
Информативность STR-панели оценивали по показателям доли полиморфных локусов, числу аллелей на локус, вероятности совпадения генотипов индивидуумов (PI) [19], вероятности исключения в качестве родителей (РХ1) [20, 21], доле особей, отнесенных к собственной популяции на основании assignment-теста [22, 23].
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов мультиплексной ПЦР локусов коз, включенных в разработанную STR-панель: фрагменты, меченные специфическими флуоресцентными красителями FAM, R6G и NED показаны соответственно в первом, втором и третьем рядах; длины фрагментов соответствующих локусов показана в парах оснований (п. о.).
Таблица. Генетическое разнообразие исследуемых пород коз по микро сателлитам
Показатель* Советская шерстная Зааненская Альпийская Вся выборка
Число голов 32 42 23 97
Na 8,63±0,63 7,12±0,44 5,38±0,26 7,04±0,38
Ne 4,65±0,42 4,07±0,35 3,26±0,32 3,99±0,23
I 1,73±0,08 1,58±0,07 1,32±0,09 1,54±0,06
Ho 0,738±0,051 0,742±0,034 0,629±0,033 0,703±0,025
He 0,771±0,022 0,740±0,023 0,671±0,033 0,727±0,017
Fis 0,047±0,054 -0,001±0,023 0,062±0,022 0,036±0,021
*Na - среднее число аллелей на локус, Ne - среднее число эффективных аллелей на локус, I - информационный индекс Шеннона, Ho - наблюдаемая гетерозиготность, He -ожидаемая гетерозиготность, Fis - коэффициент инбридинга.
Для характеристики генетического разнообразия исследуемых пород коз определяли среднее число аллелей (Na) и число эффективных аллелей (Ne) в расчете на локус, степень наблюдаемой (Ho) и ожидаемой гетеро-зиготности (He), информационный индекс Шеннона (I) и индекс фиксации (Fis) [24].
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета MS Excel 2007 с плагином GenAlEx v. 6.5.1 [25].
Результаты и обсуждение. Экспериментальная апробация предложенной тест-системы показала возможность ПЦР-амплификации всех локусов в одной реакции (рис. 2).
Все микросателлит-ные локусы, включенные в панель, оказались полиморфны. В отдельных породах число аллелей в локусах варьировало от 4 (OARFCB20) у альпийских коз до 11 (ILSTS087 и CSRD247) у коз советской шерстной породы. В целом по исследуемой выборке наименее полиморфными оказались локусы OAR-FCB20 и ILSTS011, в которых было выявлено 7 аллелей, наиболее полиморфным - локус SRCRSP024, в котором идентифицировали 13 аллелей. Вероятность совпадения генотипов (PI) исследуемых пород коз была практически исключена: значения PI варьировали от 8,3х10-7 у зааненских коз до 1,4х10-9 у коз советской шерстной породы. Вероятность исключения в качестве родителей, если генотипы обоих известны (РХ1), для всех пород была выше 99 %: РХ1 = 99,1 %, 99,9 и 99,9 % для альпийской, зааненской и советской шерстной пород коз соответственно. Результаты исследования подтверждают высокую информативность разработанной STR-панели для оценки биоразнообразия и контроля достоверности происхождения пород коз. По своим функциональным характеристикам она сопоставима с панелями STR-маркеров, рутинно используемыми для исследований других видов животных - крупного рогатого скота, свиней, овец [1].
Советская шерстная порода коз характеризовалась наибольшим уровнем генетического разнообразия, оцененным по среднему числу аллелей, среднему числу эффективных аллелей в расчете на локус (8,63±0,63 и
4,65±0,42 соответственно) и информационному индексу Шеннона (1,73±0,08), по сравнению с исследованными зарубежными породами (см. табл.).
Уровень наблюдаемой ге-терозиготности в группе коз советской шерстной породы сопоставим с зааненской (0,738±0,051 и 0,740±0,023 соответственно) и превышал величину этого показателя у альпийской. Исследованная группа коз советской шерстной породы характеризовалась некоторым дефицитом гетерозигот (4,7 %), что, по всей видимости, связано с использованием в разведении ограниченного количества козлов-производителей.
Результаты assignment-теста показали возможность идентификации породной принадлежности коз советской шерстной породы на основании исследований STR-маркеров: в пространстве двух измерений все исследованные особи формировали обособленный массив и были генетически отнесены к собственной породе (рис. 3).
Рис. 3. Локализация индивидуумов коз исследованных пород в пространстве двух измерений на основании их генотипа по STR-маркерам: Д - Зааненская; • - Советская шерстная; □ - Альпийская.
Выводы. В результате проведённых исследований разработана мультиплексная тест-система, позволяющая одновременно анализировать восемь STR-локусов и локус амелогенина, показана ее высокая функциональная емкость не только для контроля достоверности происхождения, но и для характеристики биоразнообразия пород коз. Анализ основных внутрипопуляционных параметров показал, что наибольшим уровнем аллельного разнообразия, оцененным по среднему числу аллелей ^а) и среднему числу эффективных аллелей ^е) в расчете на локус, характеризовались козы советской шерстной породы, в сравнении с козами зааненской и альпийской пород: NaSOV=8,63±0,63 и NeSOV=4,65±0,42 против NaZAAN=7,12±0,44, NeZAAN=4,07±0,35 и NaALP=5,38±0,26,
Ne
=3,26±0,32 соответственно. Дальнейшее при-
менение тест-системы позволит усовершенствовать селекционно-племенную работу в овцеводстве и выяснить историю происхождения, границы и пути распространения отдельных пород и популяций коз.
Литература.
1. Зиновьева Н. А., Гладырь Е. А. Генетическая экспертиза сельскохозяйственных животных: применение тест-систем на основе микросателлитов //Достижения науки и техники АПК. 2011. № 9. С. 19-20.
2. Tautz D., Renz M. Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes // Nucleic Acids Research. 1984. Vol. 12. Pp. 4127-4138.
3. Microsatellite DNA markers indicate three genetic lineages in East Asian indigenous goat populations / K. Nomura, K. Ishii, H. Dadi, etc.//Anim Genet. 2012. Vol. 43 (6). Pp. 760-767.
4. Genetic variation within and relationship among populations of Asian goats (Capra hircus)/J. S. F. Barker, S. G. Tan, S. S. Moore, etc. // J Anim Breed Genet. 2001. Vol. 118. Pp. 213-233.
5. Genetic diversity and relationship among Indian goat breeds based on microsatellite markers / S. P. Dixit, N. K. Verma, R. A. K. Aggarwal, etc. // Small Rumin Res. 2012. Vol. 105. Pp. 38-45.
6. Genetic diversity and relationship among southern Indian goat breeds base on microsatellite markers / S. P. Dixit, N. K. Verma, R. A. K. Aggarwal, etc.// Small Rumin Res. 2010. Vol. 91. Pp. 153-159.
7. Analysis of genetic structure of Jamunapari goats by microsatellite markers / D. S. Gour, G. Malik, S. P. S. Ahlawat, etc. // Small Rumin Res. 2006. Vol. 66. Pp. 140-149.
8. Genetic characterization of Barbari goats using microsatellite markers / J. Ramamoorthi, K. Thilagam, S. N. Sivaselvam, etc. // J Vet Sci. 2009. Vol. 10 (1). Pp. 73-76.
9. Aljumaah R. S., Alobre M. M., Al-Atiyat R. M. Use of microsatellite markers to assign goats to their breeds // Genet Mol Res. 2015. Vol. 7. No. 14 (3). Pp. 9071-9080. DOI: 10.4238/2015.
10. Genetic diversity of five Chinese goat breeds assessed by microsatellite markers / J. Y. Li, H. Chen, X. Y. Lan, etc. // J Anim Sci. 2008. Vol. 53. Pp. 315-319.
11. Microsatellite analysis revealed genetic diversity and population structure among Chinese cashmere goats / R. Di, S. M. Vahidi, Y. H. Ma, etc. //Anim Genet. 2011. Vol. 42 (4). Pp. 428-431.
12. Microsatellite Analysis of the Genetic Diversity and Population Structure in Dairy Goats in Thailand / S. Seilsuth, J. H. Seo, H. S. Kong, etc. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 2016. Vol. 29 (3). Pp. 327-332. DOI: 10.5713/ajas.15.0270.
13. Genetic diversity between herds of Alpine and Saanen dairy goats and the naturalized Brazilian Moxoto breed / M. A. Adriana, S. E. F. Guimaraes, T. M. M. Machado, etc. // Genet Mol Biol. 2006. Vol. 29. Pp. 67-74.
14. Genetic diversity of Tibetan goats of plateau type using microsatellite markers / Y. Wang, J. Wang, X. D. Zi, etc. // Arch Tierz. 2011. Vol. 54. Pp. 188-197.
15. Genetic structure of Mongolian goat populations using microsatellite loci analysis/H. Takahashi, D. Nyamsamba, B. Mandakh, etc. //Asian Australas J Anim Sci. 2008. Vol. 21. Pp. 947-953.
16. Caprine microsatellite dinucleotide repeat polymorphisms at the SR-CRSP21, SR-CRSP22, SRCRSP26 and SR-CRSP27 loci / C. C. Yeh, J. K. Kogi, M. T. Holder, etc. //Anim Genet. 1997. Vol. 28. Pp. 380-381.
17. Analysis of genetic diversity and relationships of Korean native goat populations by microsatellite marker/ S. Sangwon, B. Mijeong, K. Young-Sin, etc. // Journal of Life Science. 2012. 22 (11). Pp. 1493-1499. DOI: http://dx.doi.org/10.5352/JLS.2012.22.11.1493.
18. Genetic characterization of the Mascaruna goat, a Sicilian autochthonous population, using molecular markers / S. Mastrangelo, M. Tolone, M. T. Sardina, etc.//African journal of biotechnology. 2013. Vol. 12 (24). Pp. 3758-3767. DOI: 10.5897/ajb2013.12401.
19. Waits L. P., Luikart G., Taberlet P. Estimating the probability of identity among genotypes in natural populations: cautions and guidelines//Mol. Ecol. 2001. Vol. 10. Pp. 249-256. DOI: 10.1046/j.1365-294X.2001.01185.x.
20. Jamieson A. The effectiveness of using co-dominant polymorphic allelic series for (1) checking pedigrees and (2) distinguishing full-sib pair members //Anim. Genet. 1994. Vol. 25 (1). Pp. 37-44. DOI: 10.1111/j.1365-2052.1994.tb00401.x.
21. Jamieson A., Taylor S. C. S. Comparisons of three probability formulae for parentage exclusion //Anim. Genet. 1997. Vol. 28. Pp. 397-400. DOI: 10.1111/j.1365-2052.1997.00186.x.
22. Paetkau D., Calvert W., Stirling I., Strobeck C. Microsatellite analysis of population structure in canadian polar bears // Molecular Ecology. 1995. 4. Pp 347-354. DOI: 0.1111/j.1365-294X.1995.tb00227.x
23. Genetic assignment methods for the direct, real-time estimation of migration rate: a simulation-based exploration of accuracy and power/D. Paetkau, R. Slade, M. Burden, etc. // Molecular Ecology. 2004. 13. Pp 55-65. DOI: 10.1046/j.1365-294X.2004.02008.x
24. Hartl D. L., Clark A. G. Principles of population genetics. 3-rd edition. Sunderland: Sinauer Associates Inc., 1997. Pp. 519.
25. Peakall R., Smouse P. E. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research-an update // Bioinformatics. 2012. Vol. 28. Pp. 2537-2539. DOI: 10.1093/bioinformatics/bts460.
Development of a Multiplex STR Panel for the Parentage Control and Characteristics of Genetic Diversity of Goats
S. N. Petrov1, V. R. Kharzinova1, E. A. Gladyr1, C. S. Sambu-Khoo2, N. A. Zinovieva1
1L. K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, pos. Dubrovitsy, 60, Podol'skii r-n, Moskovskaya obl., 142132, Russian Federation
2Tyva Agricultural Research Institute, ul. Bukhtueva, 4, Kyzyl, Respublika Tyva, 667005, Russian Federation
Abstract. Panels of microsatellite markers, which are also known as STRs (short tandem repeats), are widely used for the parentage control, as well as an assessment of the allele pool state and the genetic structure of breeds and populations of farm animals. However, the studies of Russian goat breeds using this type of DNA markers have not been carried out to date. The goal of this work was to develop a multiplex panel for goat microsatellites analysis and to evaluate its information capacity. This work was carried out in 2018. The studied sample set included three breeds of goats: Soviet Wool (n = 32, the Republic of Tuva), Saanen (n = 42, Leningrad region) and Alpine (n = 23, Ekaterinburg). The developed panel consisted of 8 STR-loci (INRA006, ILSTS087, CSRD247, OarFCB020 INRA023, MCM527, SRCRSP024, and ILSTS011 ) and the amelogenin locus for sex identification. Ear tissue samples were used as biological material. Polymorphism of nine markers, grouped into one panel, was determined by the authors' protocol using ABI 3130xl DNA analyzer (USA). Statistical analysis was performed in MS Excel 2007 with GenAlEx v. 6.5 plugin. All microsatellite loci, included in the panel, were polymorphic. The number of alleles in the loci varied from 4 (OARFCB20) in Alpine goats to 11 (ILSTS087 and CSRD247) in Soviet Wool goats. The probability of matching genotypes of individuals (PI) was practically excluded; the probability of exclusion as parents if the genotypes of both were known (РХ1) was more than 99% for all breeds. Soviet Wool goats had the highest level of genetic diversity, estimated by the average number of alleles and the average number of effective alleles per locus and by Shannon index: 8.63 ± 0.63, 4.65 ± 0.42 and 1.73 ± 0.08, respectively. The obtained results confirmed the high information capacity of the developed STR panel, both for the parentage control and for the estimation of the biodiversity of goat breeds. Keywords: microsatellites; parentage validity; genetic diversity; goats.
Author Details: S. N. Petrov, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow (e-mail: [email protected]); V. R. Kharzinova, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow (e-mail: [email protected]); E. A. Gladyr, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow (e-mail: elenagladyr@ mail.ru); C. S. Sambu-Khoo, Cand. Sc. (Agr.), senior research fellow (e-mail: [email protected]); N. A. Zinovieva, D. Sc. (Biol.), member of the RAS, director.
For citation: Petrov S. N., Kharzinova V. R., Gladyr E. A., Sambu-Khoo C. S., Zinovieva N. A. Development of a Multiplex STR Panel for the Parentage Control and Characteristics of Genetic Diversity of Goats. Dostizheniya nauki i tekhnikiAPK. 2018. Vol. 32. No. 11. Pp. 60-63 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2018-11116.
