CC BY
95
УДК 616-006-092.6:615.2/.3
D.V. Filonenko, N.V. Andronova, E.M. Treshalina, E.V. Stepanova, A.Yu. Baryshnikov
DEVELOPMENT OF TUMOR MODELS FOR PRECLINICAL INVESTIGATION OF THE NEW TARGET DRUGS AGAINST HER2/NEU
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
ABSTRACT
HER2/neu is the one from epidermal growth factor receptors family, which plays the important role in the etiology and pathogenesis of different kind of tumors. The most important significance this receptor has for the breast and ovarian cancer. The drug Herceptin, which are blocking this receptor, has been used at the clinical practice by the patients with breast cancer.
The development of the new effective and chip drugs against HER2/neu are perspective now. For testing of these drugs is necessary to have adequate tumor models in vivo. The purpose of this investigation was to receive the tumor models positive of HER2/neu on immunodeficient mice for the preclinical evaluation in vivo of the new drugs against HER2/neu. There are presented the results of subcutaneous transplantation of two human cell lines of breast cancer SKBR3 and ovarian SKOV3 to the mice Balb/c nude breaded in Blokhin Russian Cancer Research Center. So presented the results of HER2/neu testing in the tumor passages in vivo.
Key words: receptor HER2/neu, subcutaneous xenografts of human cancer SKBR3 and SKOV3, mice Balb/c nude, adapt of models.
Д.В. Филоненко, Н.В. Андронова, Е.М. Трещалина, Е.В. Степанова, А.Ю. Барышников
РАЗРАБОТКА МОДЕЛЕЙ ДЛЯ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ НОВЫХ АДРЕСНЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ HER2/NEU
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
РЕЗЮМЕ
HER2/neu - представитель семейства рецепторов эпидермального фактора роста, роль которого в этиологии и патогенезе ряда опухолей, в том числе рака молочной железы и рака яичников человека, считается доказанной. Препарат герцептин, блокирующий данный рецептор, внедрен в клиническую практику и с успехом применяется при лечении РМЖ. Перспективным является создание более эффективных и дешевых препаратов, направленных на данный рецептор. Для тестирования подобных препаратов необходимы адекватные модели. Целью данной работы была отработка моделей опухолевого роста на иммунодефицитных мышах для доклинического изучения in vivo новых препаратов против HER2/neu. Представлены результаты подкожной трансплантации 2 линий рака яичников и молочной железы человека SKOV3 и SKBR3 мышам Balb/c nude разведения ГУ РОНЦ, а также результаты тестирования экспрессии HER2/neu в полученных ксе-нографтах.
Ключевые слова: рецептор HER2/neu, подкожные ксенографты опухолей человека SKBR3 и SKOV3, мыши Balb/c nude, адаптация модели.
ВВЕДЕНИЕ
Благодаря успехам молекулярной биологии на клетках различных злокачественных опухолей выявлен новый антиген семейства рецепторов эпидермального фактора роста HER2/neu (ErbB2), участвующий в этиологии и патогенезе ряда опухолей, в том числе рака молочной железы (РМЖ) и рака яич-
ников (РЯ) человека [2; 3; 7; 8; 14]. Благодаря этому создан адресный противоопухолевый препарат гер-цептин, представляющий собой гуманизированное полноразмерное моноклональное антитело против HER2/neu. Препарат герцептин (трастузумаб), выпускаемый фирмой «Roche», применяется при лечении рака молочной железы c гиперэкспрессией HER2/neu.
В результате достигается положительная динамика опухолевого процесса с увеличением выживаемости пациенток [1; 4; 5; 9; 10; 12]. Поиски новых препаратов против Her2/neu ведутся интенсивно во многих странах, в том числе и в нашей.
Для доклинического изучения препаратов, адресованных HER2/neu, используются адаптированные к росту у иммунодефицитных мышей клеточные линии опухолей человека с гиперэкспрессией рецептора (HER2+), среди которых наиболее широко используются 2 линии рака молочной железы SKBR3 и BT474 и рак яичников SKOV3 [6; 11; 13].
В ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН в рамках Программы Правительства г. Москвы ведутся исследования по разработке новых противоопухолевых препаратов, ориентированных на Her2/neu.
Целью исследования была отработка моделей опухолей человека, положительных по HER2 у мышей Balb/c nude.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Лабораторные животные
Для трансплантации культур клеток опухолей человека использованы конвенциональные мыши-самки Balb/c nude 8-10 нед массой тела 18-21 г. Мышей содержали в SPF-зоне специализированного кондиционированного бестимусного отсека при нормированном температурно-влажностном режиме на стерильном экструдированном корме («МЭСТ», РФ), стерильной воде и стерильной бумажной подстилке.
Линии клеток опухолей человека с гиперэкспрессией HER2/neu
1. SKOV3 - аденокарцинома яичника человека, содержащая на своей поверхности до 8х105 рецепторов HER2/neu на клетку. Эта линия клеток формирует подкожные ксенографты у nude мышей и отличается отсутствием рецепторов эстрогенных и прогестероно-вых гормонов. В связи с этим для ее трансплантации и роста не требуется создания гормонального фона, резко сниженного у мышей nude.
2. SKBR3 - аденокарцинома молочной железы человека, содержащая на своей поверхности до 1,6х106 рецепторов HER2/neu на клетку. Линия также формирует подкожные ксенографты у nude мышей и не требует создания гормонального фона для роста in vivo.
Трансплантация ксенографтов
Первый пассаж выполняли из культуры клеток в стандартных прививочных дозах, повторные - взвесью опухолевой ткани из полученных подкожных ксенографтов. Эта модификация предпринята с целью получения достаточного количества опухолевого материала для возможности постановки длительных химиотерапевтических экспериментов с использованием одного культурального пассажа. Для определения особенностей кинетики роста ксе-нографтов при повторном пассировании выполнено по 2 пассажа.
1-й пассаж из культуры клеток. Под кожу бока мышей nude (n=2) инокулировали по 1х107 клеток SKBR3 или по 7х106 кл. SKOV3.
2-й пассаж из подкожных ксенографтов 1-го пассажа. Под кожу бока мышей (n=2) инокулировали взвесь опухолевых клеток по 60 мг/мышь в 0,3 мл питательной среды 199.
3-й пассаж из подкожных ксенографтов 2-го пассажа. Под кожу бока мышей (n=5-6) инокулиро-вали взвесь опухолевых клеток по 60 мг/мышь в 0,3 мл питательной среды 199.
Для приготовления опухолевой взвеси опухоли выделяли, измельчали с помощью медицинских ножниц и ex tempore готовили взвесь клеток в питательной среде 199.
О стандартности моделей у мышей судили по 100%-ной прививаемости опухолей. Для выявления опухолевых узлов под кожей у мышей проводили визуальное наблюдение и пальпацию места трансплантации. За кинетикой опухолевого роста наблюдали в течение месяца после трансплантации по размерам опухолевых узлов. Пальпируемые узлы многократно измеряли и рассчитывали объем в динамике (V=axbxc, мм3). Проведенные в разные сроки после трансплантации измерения опухолей позволили рассчитать средние объемы опухолей (Vcp) и соотношение последующего объема к предыдущему (Vn/Vn-1, где n - номер измерения). По этим параметрам построены кривые роста, которые использованы для определения длительности отдельных фаз. Анализ кривых использован для расчета стандартных показателей роста опухолей: длительности латентного периода (отсутствие пальпируемых опухолей), экспоненциальной фазы (>3-кратное увеличение размеров), стационарной фазы (отсутствие динамики роста или менее, чем 3-кратное увеличение размеров) и оценки скорости роста опухоли. Сроки гибели мышей от опухоли служили конечной точкой определения длительности стационарной фазы. Продолжительность жизни мышей с опухолью была дополнительным показателем стандартности модели.
Контроль экспрессии HER2/neu
Экспрессию HER2+ контролировали предварительно в культурах клеток, использованных для первых пассажей опухолей, а также во всех пассажах опухолей у животных. Для этого из удаленной опухоли выделяли часть ткани, которую фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине в течение 24-48 ч, затем промывали в проточной водопроводной воде, фиксировали в 5 сменах этанола в течение 1-2 ч в каждой, в 2 сменах ксилола по 20 мин в каждой и в смеси ксилол/парафин 1 ч. Готовые срезы пропитывали парафином в течение 2 ч и заливали в парафин. Заключенные в парафин срезы опухоли подвергали ИГХ-исследованию.
Иммуногистохимическое исследование
ИГХ проводили по стандартной пероксидазной методике с использованием стрептавидин-биотиновой
системы визуализации. Для выявления антигенных детерминант обрабатывали срезы в 10 мМ цитратном буфере в течение 30 мин при 95-99 °С. Эндогенную пероксидазу блокировали 15 мин 3%-ной перекисью водорода, неспецифическое связывание - 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина. Инкубацию с первичными антителами А0485 [«Dako», Дания] проводили в течение 18 ч при +4 °С. В качестве системы детекции выбран набор EnVision+ [«Dako», Дания], в качестве хромогена - ДАБ+ [«Dako», Дания]. Срезы докрашивали гематоксилином. Результаты окрашивания оценивали с использованием общепринятых критериев (Food and Drug Administration, FDA, США) (табл. 1).
Статистическая обработка данных
Статистическая обработка выполнена с использованием компьютерной программы Microsoft Excel. Достоверными считали отличия при p<0,05. Все результаты фиксировали в специальных протоколах и оформляли в виде графиков.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Отработка модели ксенографта SKBR3 in vivo
При 1-м пассаже 1х107 клеток на мышь пальпируемый опухолевый узел SKBR3 появился на 9-й день (латентная фаза) у обеих взятых в опыт мышей. Объемы опухолей у них резко различались и составили соответственно 2 и 24 мм3. У1-й мыши опухоль быстро исчезла, у 2-й - 3-кратно увеличивалась до 72 мм3 от 9го до 15-го дня (экспоненциальная фаза 6 дней). В период от 15-го до 30-го дня объем опухоли увеличился соответственно в 1,8 и 2,3 раза (стационарная фаза 15 дней). Максимальный объем опухоли на 30-е сут достиг 300 мм3 (табл. 2).
Анализ результатов показал, что инокуляция культуры клеток SKBR3 в стандартной прививочной дозе мышам Balb/c nude не приводит к 100%-ной прививаемости и вызывает образование медленно растущего ксенографта с длинной латентной, стационарной и короткой экспоненциальной фазами роста.
При 2-м пассаже взвесью опухоли подкожные уз-
лы одинакового объема 12 мм3 пальпировались у обеих мышей на 7-й день (латентная фаза). Затем от 7-го до 19-го дня опухоли увеличились в 5 раз и достигли на 15-й день объема 64 мм3, а на 19 день - 288 и 264 мм3 (экспоненциальная фаза 12 дней). Далее рост стабилизировался, и к 30-му дню увеличение объемов опухолей не превышало 2,6 и 1,8 раз, достигнув соответственно объемов 756 и 480 мм3 (стационарная фаза 11 дней).
Анализ результатов показал, что повторное пассирование опухоли взвесью клеток, полученных из подкожного ксенографта, приводит к 100%-ной прививаемости при более высокой скорости роста опухоли. При этом в сравнении с первым пассажем произошло укорочение латентной и стационарной фаз с 2-кратным увеличением длительности экспоненциальной фазы роста.
На 3-м пассаже 5 мышам трансплантировали по 60 мг опухолевой ткани 2-го пассажа. Достигнута 100%-ная прививаемость с выходом опухолей среднего объема 147 [114+180] мм3 к 6-му дню (латентный период). К 12-му дню объем опухолей возрос в 3,8 раз и продолжал расти в
2-4-кратном размере вплоть до 30-го дня опыта (экспоненциальная фаза 18 дней). В результате к концу наблюдения объем опухолей увеличился почти в 28 раз и достиг 4140 [2754+5526] мм3 (рис. 1).
Анализ результатов трансплантации показал, что 3-й пассаж вызвал образование стандартных подкожных ксенографтов SKBR3. При этом в сравнении со 2-м пассажем произошло дальнейшее укорочение латентной фазы с 3-кратным увеличением длительности экспоненциальной фазы без стационарной фазы роста.
Отработка модели ксенографта SKOV3 in vivo
При 1-м пассаже 9х106 клеток на мышь пальпируемый опухолевый узел SKOV3 появился на 8-й день (латентная фаза) у обеих взятых в опыт мышей (100%-ная прививаемость). Объемы опухолей у этих мышей были близки и составили соответственно 70 и 80 мм3. Затем в период от 12-го по 21-й день опухоли росли относительно медленно и достигли объема соответственно 120 и 135 мм3 и 216 и 288 мм3.
Таблица 1
Критерии оценки экспрессии HER2/neu в ткани опухолей
Уровень экспрессии
0 + ++ +++
Отсутствие окрашивания Слабое окрашивание мембраны опухолевых клеток Средняя и слабая интенсивность окрашивания полной мембраны более 10 % опухолевых клеток Сильная степень окрашивания более 10 % опухолевых клеток
Отрицательная опухоль Положительная опухоль
36 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОТЕРАПИЯ
Таблица 2
Кинетика роста 3 пассажей п/к ксенографтов SKBR3 у мышей-самок Balb/с nude
Инокулят, доза на мышь Номер пассажа Размеры опухоли на сутки после перевивки
1-е измерение* 2-е измерение 3-е измерение 4-е измерение
Lxhxs (мм) V (мм3) Lxhxs (мм) V (мм3) Lxhxs (мм) V (мм3) Lxhxs (мм) V (мм3)
1х107 клеток 1 2х1х1 2 Отс. 0 Отс. 0 Отс. 0
4х3х2 24 6x4x3 72 8x4x4 128 10x6x5 300
60 мг 2 4х3х1 12 8x4x2 64 12x6x4 288 14x9x6 756
4х3х1 12 8x4x2 64 11x6x4 264 12x8x5 480
60 мг 3 10х5х3 150 10x6x6 360 12x10x8 960 27x13x12 4212
7х5х3 105 12x8x6 576 18x10x8 1440 18x20x15 5400
10х6х3 180 10x8x7 560 12x10x8 960 19x18x14 4788
7х6х4 168 14x7x5 490 15x7x5 525 24x12x10 2880
8х5х3 120 13x8x6 624 14x10x9 1260 19x15x12 3420
Среднее значение 147 [114+180] 522 [377+667] 1029 [526+1532] 4140 [2754+5526]
Vn/Vn-1 1,0 3,8 2,0 4,0
*Сутки после перевивки: 1-е измерение - 6-9; 2-е измерение - 12-15; 3-е измерение - 19-21; 4-е измерение - 29-30
а
х liflM S tOQDLi
Сутки после трансплантации о пуке ли
Рис. 1. Динамика роста клеток рака молочной железы человека SKBR3 Her2+ под кожей у мышей-самок Balb/с nude (3-й пассаж)
Кратность увеличения объема не превышала 2,1 (стационарная фаза 9 дней). Лишь к 29-му дню объем опухолей значительно вырос до 960 и 1190 мм3 (экспоненциальная фаза 7 дней) (табл. 3).
При 2-м пассаже, выполненном по 60 мг опухолевой ткани на мышь, опухоли возникли у обеих мышей на 7-й день (латентная фаза), а их объемы существенно различались и составили 18 и 60 мм3 соответственно. Затем от 7-го до 15-го дней опухоли резко, в 7-24 раза увеличились в размерах и достигли объемов 432 и 440 мм3 (начало экспоненциальной фазы), а на 19-21-й дни
- 1296 и 1344 мм3, прирост опухолей составил 3,0-3,1 раза (экспоненциальная фаза 15 дней). Далее рост от-
носительно стабилизировался и к 30-му дню их объемы составили 1960 и 2156 мм3, прирост опухолей соответственно 1,5—1,6 раз (стационарная фаза 9 дней).
3-й пассаж проведен взвесью клеток, полученных из опухолей 2-го пассажа. У 6 мышей, которым трансплантировали по 60 мг, опухоли достигли среднего объема 191 [97+372] мм3 уже к 7-му дню (латентный период). К 13-му дню объем опухолей возрос в 3,6 раз и составил 696 [484+908] мм3 (экспоненциальная фаза 6 дней). Затем рост опухолей снизился и в период от 15-го до 21-го дня составил соответственно 1536 [1166+1906] мм3 (увеличение в 2,2 раза), а от 22го по 30-й день - 3576 [2436+4716] мм3 (увеличение в 2,3 раза) (стационарная фаза 15 дней) (табл. 3, рис. 2).
Анализ результатов показал, что культура клеток SKOV3 отличается 100%-ной прививаемостью и вызывает при всех видах трансплантации образование подкожных ксенографтов. При этом только при 2-м пассаже кинетика роста опухолей имела достаточно короткую латентную фазу и длительную фазу экспоненциального роста.
Полученные характеристики роста п/к ксенографтов SKBR3 и SKOV3 позволяют считать, что в течение 2 пассажей адаптация клеточных культур к росту in vivo завершена, опухоль достигает стандартных размеров в стандартные сроки и на 3-м пассаже пригодна для изучения противоопухолевой активности агентов длительного применения (герцептин и т.п.), т.к. длительность экспоненциальной фазы роста соответствует их терапевтической схеме.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОТЕРАПИЯ 37
Таблица 3
Кинетика роста п/к ксенографтов SKOV3 у мышей-самок Balb/с nude
Прививочная доза на мышь Номер пассажа Размеры опухоли на сутки после перевивки
1-е измерение* 2-е измерение 3-е измерение 4-е измерение
Lxhxs (мм) Vcp (мм3) Lxhxs (мм) Vcp (мм3) Lxhxs (мм) Vcp (мм3) Lxhxs (мм) Vcp (мм3)
7х106 клеток 1 7x5x3 70 8x5x3 120 12x6x3 216 16x10x6 960
8x5x2 80 9x5x3 135 12x6x4 288 17x10x7 1190
60 мг 2 3x3x2 18 9x8x6 432 12x12x9 1296 14x14x10 1960
5x4x3 60 11x8x5 440 14x12x8 1344 14x14x11 2156
60 мг 3 9x6x5 270 19x8x6 912 20x11x9 1980 26x15x12 4680
8x7x5 280 11x11x7 847 16x11x10 1760 24x14x14 4704
8x6x4 192 11x9x7 693 16x10x10 1600 21x16x12 4032
11x5x4 220 13x9x7 819 15x12x9 1620 21x15x12 3780
8x4x3 84 14x6x5 420 16x10x7 1120 19x12x9 2052
12x4x2 96 14x7x5 490 18x9x7 1134 23x12x8 2208
Среднее значение 191 [97+372] 696 [484+908] 1536 [1166+1906] 3576 [2436+4716]
Vn/Vn-1 1,0 3,6 2,2 2,3
*Сутки после перевивки:1-е измерение - 6-9; 2-е измерение - 12-15; 3-е измерение - 19-21; 4-е измерение - 29-30
| wro
s
•£ ЗИЧ'
S
1 А 11 16 21 ас
t') IKII исклг исренникгн OIIVlKin
Рис. 2. Динамика роста клеток рака яичника человека SKOV3 Her2+ под кожей у мышей-самок Balb/с nude (3-й пассаж)
Определение экспрессии HER2/neu в подкожных ксенографтах SKOV3 и SKBR3 у мышей-самок BALB/c nude
Исследование показало, что на клетках подкожных ксенографтов SKOV3 и SKBR3 имеется гиперэкспрессия HER2/neu на «+++», что соответствует данным предварительного иммуноцитохимического анализа клеточных линий in vitro. В обеих опухолях наблюдается сильное окрашивание мембран клеток, некоторые из которых также имеют небольшое цитоплазматическое окрашивание. Прилегающие стро-мальные клетки не окрашены. Гиперэкспрессия
HER2/neu в опухолевых клетках сохраняется на протяжении всех 13 пассажей. В качестве отрицательного контроля при оценке экспрессии HER2/neu были использованы штаммы рака молочной железы РМЖ-3, РМЖ-4 и РМЖ-ч из банка ГУ РОНЦ (рис. 3).
ВЫВОДЫ
При инокуляции мышам-самкам Balb/c nude разведения ГУ РОНЦ:
1. Первый пассаж 1,0х107 клеток линии рака молочной железы SKBR3 или 9,0х106 клеток линии рака яичников SKOV3 с гиперэкспрессией HER2/neu не
А ь
Рис. 3. Экспрессия HER2/neu на клетках ксено-графтов опухолей человека у мышей BALB/c nude:
А - SKOV3 - гиперэкспрессия HER2/neu+++;
Б - РМЖ-4 - отсутствие гиперэкспрессии HER2/neu.
дает 100%-ной прививаемости и приводит к опухолевому росту с относительно длинной латентной фазой 8-9 дней, короткой экспоненциальной фазой 6-9 дней и стационарной фазой 7-15 дней.
2. Повторная инокуляция SKBR3 или SKOV3 взвесью клеток из опухолей 1-го пассажа по 60 мг/мышь приводит к 100%-ной прививаемости с образованием в течение 30 дней подкожных ксенографтов максимального объема 756-2156 мм3, характеризующихся относительно короткой латентной фазой 7 дней, относительно длинной экспоненциальной фазой 12-15 дней и стационарной фазой 9-11 дней.
3. Третий пассаж SKBR3 или SKOV3 взвесью клеток из опухолей 2-го пассажа по 60 мг/мышь приводит к 100%-ной прививаемости с образованием в течение 30 дней подкожных ксенографтов среднего объема 4140 и 3576 мм3, характеризующихся относительно короткой латентной фазой 6-7 дней, в случае SKOV 3 - короткой, а в случае SKBR3 - длинной экспоненциальной фазами 6 и 18 дней соответственно. Стационарная фаза в случае SKBR3 отсутствовала, а для SKOV3 составила 15 дней.
4. Подкожные ксенографты SKOV3 2-го пассажа и SKBR3 Her2+ 3-го пассажа на мышах-самках Balb/c nude разведения ГУ РОНЦ по скорости роста (короткий латентный период и длинная экспоненциальная фаза) и размерам опухолевых узлов пригодны для экспериментальной оценки моноклональных антител, блокирующих рецептор HER2/neu.
Финансирование исследований обеспечено Научно-технической программой «Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств диагностики и лечения онкологических и других заболеваний» на 2004-2006 гг., утвержденной Мэром г. Москвы Ю.М. Лужковым, Министром Промышленности, науки и технологий РФ А.Н. Дондуковым и Президентом РАН Ю.С. Осиповым.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ганьшина И.П., Личиницер М.Р. Герцептин в лечении рака молочной железы с гиперэкпресси-ей HER2 // Фарматека. - Онкология ASCO. - 2006.
- С. 7-9.
2. Имянитов Е.Н., Князев П.Г. Активация онкогена ERBB-2 и прогноз течения рака молочной железы
у человека // Вопросы онкологии. - 1991. - Т. 37, № 5.
- С. 527-34.
3. Имянитов Е.Н., Черница О.И., Иванова О.А. и др. Амплификация онкогена ERBB-2(HER-2/NEU) в опухолях молочной железы - прогностический маркер вероятности рецидива // Экспер. онкол. - 1992. - Т. 14, № 4. - С. 25-9.
4. Bangemann N., Burstein H., Harvey V. et al. Trastuzumab. A Review of its Use in the Treatment of Metastatic Breast Cancer Overexpressing HER2 // Drugs.
- 2002. - Vol. 62, supp. 1. - P. 209-43.
5. Bangemann N., Kuhle A., Ebert A et al. Capecit-abine combined with Trastuzumab in the therapy of intensively pretreated HER2-overexpressing metastatic breast cancer [abstract] // Ann. Oncol. - 2000. - Vol. 11, supp. l.
- № 4. - P. 143.
6. Fogh J. et al. One hundred and twenty-seven cultured human tumor cell lines producing tumors in nude mice //J. Natl. Cancer Inst. - 1997. - Vol. 59. - P. 221-6.
7. Harari D, Yarden Y. Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in breast cancer // Oncogene. - 2000. - Vol. 19. - P. 6102-14.
8. Harries M., Smith I. The development and clinical use of trastuzumab (Herceptin) // Endocrine-Related Cancer. - 2002. - Vol. 9. - P. 75-85.
9. Jahanzeb M., Mortimer J.E., Yunus F. et al. Phase II Trial of Weekly Vinorelbine and Trastuzumab as First-Line Therapy in Patients with HER2+ Metastatic Breast Cancer // The Oncologist. - 2002. - Vol. 7, No 5. - P. 410-7.
10. Miller K.D., Sisk J., Ansari R. et al. Gemcitabine, paclitaxel, and trastuzumab in metastatic breast cancer // Oncology. - 2001. - Vol. 15(2), suppl. 3. - P. 38-40.
11. Morimoto H. et al. Synergistic effect of tumor necrosis factor-alpha and diphtheria toxin mediated cytotoxicity in sensitive and resistant human ovarian tumor cell lines // J. Immunol. - 1991. - Vol. 147. - P. 2609-16.
12. Slamon D.J. Update on Taxoter/Platinum/Herceptin combinations // Satellite meeting of the 24th San Antonio Breast Cancer Symposium. San Antonio, TX, USA, 2001.
13. Trempe G.L. Human breast cancer in culture // Resent Results Cancer Res. - 1976. - Vol. 57. - P. 33-41.
14. Yu D., Hung M.C. Overexpression of ErbB2 in cancer and ErbB2-targeting strategies // Oncogene. -2000. - Vol. 19. - P. 6115-21.
Поступила 20.11.2006.
