CC BY
85
УДК 615.32
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ ПИРЕТРУМА ДЕВИЧЬЕГО И ЕЁ ВАЛИДАЦИЯ
Д.А. КОНОВАЛОВ
Д.С. КОНОВАЛОВА Разработана методика количественного определения фла-
воноидов в траве пиретрума девичьего и дана ее валидация.
Пятигорская государственная Ключевые слова: пиретрум девичий, флавоноиды, диффе-
фармацевтическая академия ренциальная спектрофотометрия, валидация.
e-mail: [email protected]
Пиретрум девичий (Pyrethrumparthenium (L). Smith, сем. Asteraceae) - это популярное в последнее время за рубежом растение. Оно используется для профилактики и лечения мигрени. Основными биологически активными веществами травы пиретрума девичьего являются сесквитер-пеновые лактоны и флавоноиды. Именно с данными классами природных соединений и связывают противовоспалительную, антимигренозную, противораковую, анальгетическую, фунгицидную и другие виды биологической активности, которые проявляет трава пиретрума девичьего [1, 2].
Отечественное сырье с научной точки зрения изучено мало, хотя в народной медицине растение применяется для лечения головных болей, артрита, ревматизма и других заболеваний, связанных с воспалительным процессом [2].
Целью работы является разработка методики дифференциальной спектрофотометрии позволяющей проводить оценку качества сырья пиретрума девичьего по содержанию флавоноидов.
Материалы и методы. Сырье пиретрума девичьего заготавливалось нами с 2009 по 2011 год с дикорастущих популяций, произрастающих на территории Кавказских Минеральных Вод.
Разработанная нами методика определения флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии основана на способности флавоноидов образовывать комплексы с алюминия (III) хлоридом. При этомнаблюдается батохромный сдвиг полосы поглощения флавоноидов от 330-350 к 390-410 нм в видимую область спектра.
В качестве стандарта использовали раствор стандартного образца (СО) рутина в 95% спирте этиловом.
Методика количественного определения: аналитическую пробу сырья измельчают до величины частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм. Около 1,0 (точная навеска) измельченной травы помещают в колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл 70% спирта этилового и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа с момента закипания спиртоводной смеси в колбе.
После охлаждения полученное извлечение фильтруют через беззольный бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят 70% спиртом этиловым до метки. Далее
3 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 5 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% спирте этиловом, через 5 минут добавляют 0,2 мл раствора кислоты уксусной разведенной (33%). Объем раствора доводят до метки спиртом этиловым 95% и оставляют на 40 минут. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 410 нм, используя кювету с толщиной слоя 10 мм.
В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 3 мл извлечения и 0,2 мл раствора кислоты уксусной разведенной (33%), доведенный спиртом этиловым до метки в колбе вместимостью 25 мл.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора комплекса СО рутина с алюминия хлоридом. Для этого в мерную колбу на 25 мл помещают 3 мл раствора СО рутина, прибавляют
5 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% спирте этиловом, через 5 минут добавляют 0,2 мл раствора кислоты уксусной разведенной. Объем раствора доводят до метки спиртом этиловым 95%, оставляют на 40 минут и измеряют оптическую плотность при длине волны 410 нм.
В качестве раствора сравнения использовали раствор СО рутина, приготовленный в тех же условиях, только без добавления алюминия хлорида.
Расчет содержания суммы флавоноидов в траве пиретрума девичьего проводят в точках максимума оптического поглощения испытуемого извлечения и раствора СО рутина, обработанных алюминия хлоридом.
Содержание суммы флавоноидов в процентах в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
х = Ах Х т<т х 100 ч х 100%, гДе
Аст х тх х(100 - Ш) х - содержание суммы флавоноидов, в процентах;
Ах - оптическая плотность извлечения, обработанного алюминия хлоридом; Аст - оптическая плотность раствора комплекса СО рутина с алюминия хлоридом; тх - масса сырья, г; теп- масса СО рутина, г;
Ш - потеря в массе при высушивании сырья, в процентах (9,1%).
Результаты и их обсуждение. Статистическая обработка полученных результатов (п=6, Р=0,95) представлена в табл. 1.
Содержание суммы флавоноидов в траве пиретрума девичьего в фазу конца бутонизации-начала цветения составляет 2,29±0,07%. Кроме того нами проводилось определение содержания флавоноидов в образцах травы пиретрума девичьего, заготовленных в разные годы (табл. 2). Как видно из табл. 2, относительная погрешность определения (е) не превышает 5%.
Таблица 1
Результаты определения суммы флавоноидов в траве пиретрума девичьего в фазу конца бутонизации-начала цветения
№ п/п Навеска Оптическая плотность X." 1 (X - х) (X - X )2 Метрологические характеристики
0* 0,0500 0,559 - - -
1 1,0179 0,244 2,36 0,07 0,0049
2 1,0912 0,248 2,24 0,05 0,0025
3 0,9546 0,216 2,23 0,06 0,0036 Ях =0,069
4 0,9986 0,238 2,35 0,06 0,0036 Sx: =0,028
5 1,1035 0,263 2,34 0,05 0,0025 Дх =0,07 е=3,06%
6 1,0065 0,226 2,21 0,08 0,0064
Среднее значение, X 2,29
Сумма значений, ^ (х. - х)2 0,0235
Примечание: * - СО рутина; ** - содержание (%) в пересчете на абсолютно-сухое сырье.
Таблица 2
Количественное определение флавоноидов в траве пиретрума девичьего, заготовленной в разные годы
Год заготовки Навеска сырья, г Оптическая плотность, А Содержание флавоноидов, (%) XI Метрологические характеристики
2009 0,9735; 0,9463; 0,8519; 1,0486; 1,0368; 1,0094 0,248; 0,247; 0,207; 0,275; 0,268; 0,243 2,42; 2,47; 2,30; 2,49; 2,48; 2,29 х =2,41; Ях =0,091; Sx =0,037 Ах =0,09; е =3,73%
2010 1,0572; 0,9964; 1,0187; 1,0253; 1,1045; 0,9628 0,268; 0,247 0,236; 0,251; 0,265; 0,234 2,45; 2,40; 2,23; 2,37; 2,32; 2,35 х =2,35; Ях =0,075; Sx =0,031 Ах =0,08; е =3,40%
2011 1,0179; 1,0912; 0,9546; 0,9986; 1,1035; 1,0065 0,244; 0,248; 0,216; 0,238; 0,263; 0,226 2,36; 2,24; 2,23; 2,35; 2,34; 2,21 х =2,29; Ях =0,069; Sx =0,028 Ах =0,07; е =3,06%
Примечание: * - содержание (%) в пересчете на абсолютно-сухое сырье.
Валидация методики количественного определения суммы флавоноидов пиретрума девичьего.
Для подтверждения пригодности методики по контролю качества сырья пиретрума девичьего проводили ее валидационную оценку по параметрам линейность и точность (прецизионность на уровне повторяемости методики и правильность методом добавок).
Для разработки оптимальной методики была установлена область линейной зависимости оптической плотности от концентрации анализируемого вещества (суммы флавоноидов). Определение линейности проводили на 6 уровнях концентраций анализируемого извлечения (табл. 3, рис. 1). Растворы готовили путем разбавления аликвоты и увеличения аликвоты для измерения количественного содержания суммы флавоноидов травы пиретрума девичьего.
Таблица 3
Определение линейности зависимости оптической плотности от концентрации анализируемых веществ
С 0,0078 0,0113 0,017 0,0227 0,0283 0,0341
А 0,08 0,142 0,22 0,291 0,367 0,436
где С - концентрация суммы флавоноидов, г/мл; А - оптическая плотность.
Рис. 1. Зависимость оптической плотности от концентрации флавоноидов в извлечении из травы пиретрума девичьего
На рис. 1 видно, что почти все экспериментальные точки (за исключением первой), лежат на линии тренда. Следовательно, область линейной зависимости наблюдается при концентрациях 0,0113-0,0341 г/мл. Вычисление коэффициента корреляции проводили с помощью программы М1сговоА:Ехсе1 2002. Величина коэффициента корреляции составила 0,99, что считается удовлетворительной корреляцией.
Определение прецизионности методики (на уровне повторяемости) проводили на одном образце сырья на шести параллельных измерениях. Результаты определений представлены в табл. 4.
Результаты установления прецизионности на уровне повторяемости (сходимости) валидируемой методики
Таблица 4
№ опыта Навеска сырья, г Оптическая плотность, А X. * 1 ( X. — X ) ( X1 — X )2 Метрологические характеристики
0. 0,0500 0,603 - - - Sx = 0,058 SX = 0,024 Дх = 0,066 е = 3,13% RSD =2,75%
1. 0,9863 0,226 2,09 0,02 0,0004
2. 1,0911 0,258 2,15 0,04 0,0016
3. 0,9658 0,214 2,02 0,09 0,0081
4. 1,1042 0,265 2,19 0,08 0,0064
5. 0,9947 0,230 2,11 0 0
6. 1,0234 0,234 2,09 0,02 0,0004
Среднее значение X 2,11
Сумма значений ^ (X. — X)2 0,0169
Примечание: * - содержание (%) в пересчете на абсолютно-сухое сырье.
Относительное стандартное отклонение равно 2,75%, это говорит о том, что методика позволяет получить удовлетворительные по сходимости результаты.
Правильность методики устанавливали путем измерения количественного содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин в растворах, полученных путем добавления стандартного образца (СО рутина) к навеске сырья. Результаты определений представлены в табл. 5.
Таблица 5
Определение правильности методики (результаты опытов с добавками)
№ п/п Навеска сырья, г Добавка рутина, г А* Содержание** (%) R, % Метрологические характеристики
Расчетное Полученное
1. 1,0062 0 0,246 2,36 - - R^= 101,40 Sx = 2,70 S- = 1,02 x ' Дх = 2,50 e = 2,47% RSD =2,66%
2. 1,0143 0,0051 0,292 2,87 2,78 96,86
3- 0,9851 0,0112 0,350 3,49 3,43 98,28
4- 0,9864 0,0171 0,433 4,08 4,24 103,92
5- 0,9877 0,0275 0,538 5,12 5,27 102,93
6. 1,1095 0,0294 0,626 5,30 5,46 103,01
7- 1,0238 0,0365 0,655 6,02 6,18 102,66
8. 0,9891 0,0379 0,642 6,12 6,29 102,11
Примечание: * - оптическая плотность 0,05% раствора СО рутина 0,569;
** - содержание суммы флавоноидов в абсолютно сухом сырье; А - значение оптической плотности образцов сырья; Я - открываемость.
Критерий приемлемости - средний процент открываемое™, скорректированный на 100%, и его средняя величина должна находиться в пределах 97-103% (согласно рекомендациям американской ассоциацией аналитической химии (АОАС) при содержании анализируемого вещества больше 1%). В разработанной методике средний процент открываемости составил 101,40%, а относительное стандартное отклонение не превышает 3%, что соответствует величине RSD, оптимальной для данного метода анализа.
Выводы. Разработанная методика позволяет определить содержание суммы флавоноидов в траве пиретрума девичьего в присутствии других соединений, проста в исполнении и не требует дорогостоящей аппаратуры. А проведенная валидационная оценка методики свидетельствует о её пригодности для контроля качества сырья пиретрума девичьего.
Литература
1. Knight, D.W. Feverfew: chemistry and biological activity / Knight D.W. // Nat. Prod. Rep. Vol. 12, N 3. - P. 271-276.
2. Anti-inflammatory activity of parthenolide-depleted Feverfew (Tanacetum parthenium) [et al.] // Inflammopharmacology. - 2009. - Vol. 17, N 1. - P. 42-49.
3. Коновалова, Д.С. Сесквитерпеновые лактоны пиретрума девичьего как биологически вещества (обзор) / Д.С. Коновалова, Д.А. Коновалов // Экология человека. - 2008. - № 3. - С. 3-7.
DEVELOPMENT AND VALIDATION OF QUANTITATIVE METHOD OF DETERMINATION OF FLAVONOIDS IN PYRETHRUM PARTHENIUM HERB
The technique of quantitative definition of flavonoids in Pyrethrum parthenium herb is developed and given it's vaidation.
Key words: Pyrethrum parthenium, flavonoids, spectrophotometry, validation.
- 1995- -/ Sur R. активные
D.A. KONOVALOV D.S. KONOVALOVA
Pyatigorsk State Pharmaceutical Academy
e-mail: [email protected]
