Разработка метода получения бетулиновой кислоты региоселективным окислением бетулина растущими культурами микроорганизмов Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 579.66:547.94

Д.В. Митрофанов, Н.И. Петухова, Э.Р. Мухитдинов, Ф.З. Галин, В.В. Зорин

Разработка метода получения бетулиновой кислоты региоселективным окислением бетулина растущими культурами микроорганизмов

Уфимский государственный нефтяной технический университет 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел.: (3472) 43-19-35; Е-mail: [email protected]

Исследована трансформация бетулина растущими культурами микроорганизмов. Предложен метод получения бетулиновой кислоты из бетулина с помощью бактерий Mycobacterium sp. 1-4-1 с выходом 45—50 % в течение 24—36 ч. Ключевые слова: тритерпеноиды, бетулин, бе-тулиновая кислота, биотрансформация, микроорганизмы

Бетулиновая (3ß-гидрокси-20(29)-лупаен-28-овая) кислота — пентациклическая тритер-пеновая оксикислота лупанового ряда, а также ее природные или полусинтетические производные, полученные химической, ферментативной или микробиологической трансформацией, обладают широким спектром биологической активности (противовоспалительной, противораковой, противовирусной, инсектицидной, антиплазмодиальная, противогель-минтная, рострегулирующей и др.) 1-7. Это ставит бетулиновую кислоту в ряд ценных лекарственных средств и аллелохимикалий.

Ранее нами был предложен биокаталитический метод региоселективного окисления бе-тулина в хлороформе, позволяющий получать бетулиновую кислоту с выходом 38% 8.

В настоящей работе исследован новый метод региоселективного окисления бетулина в бетулиновую кислоту с помощью растущих культур микроорганизмов.

В качестве потенциальных биокатализаторов были использованы ранее найденные штаммы почвенных бактерий (Pseudomonas sp. H-43, Mycobacterium sp. 1-4-1 и неиденти-фицированные штаммы Т-12 и У3-2б).

Было обнаружено, что покоящиеся клетки этих микроорганизмов, выращенные на среде без бетулина 1, осуществляют региосе-лективное окисление этого соединения в бету-линовую кислоту 3 c образованием в качестве промежуточного продукта бетулинового альдегида 2 (рис. 1, путь 1).

O

CH2OH

O /

O /

COOH

5

4

---► путь 1; -► путь 2

Рис. 1 - Гипотетические пути окисления бетулина микроорганизмами: 1 — бетулин; 2 — бетулиновый альдегид; 3 — бетулиновая кислота; 4 — бетулоновый альдегид; 5 — бетулоновая кислота Дата поступления 20.02.06

Также при исследовании штамма Pseudomonas sp. H-43 было обнаружено, что региоселективность окисления тритерпеноида зависит от условий выращивания микроорганизма, а именно от наличия или отсутствия бетулина в ростовой среде. При использовании для трансформации тритерпеноида покоящихся клеток этих бактерий, выращенных в присутствии в среде бетулина, в качестве дополнительных продуктов окисления образуются 3-кетосодержащие тритерпеноиды — бету-лоновый альдегид 4 и бетулоновая кислота (5) (рис. 1, путь 2). Это указывает на индуцибель-ный характер синтеза специфической дегидро-геназы, ответственной за окисление 3-оксиг-руппы бетулина, у данного штамма.

Способность штамма Pseudomonas sp. Н-43 окислять 3-оксигруппу тритерпеноидов ограничивает возможность его использования для получения бетулиновой кислоты в ростовых условиях. Для реализации данного процесса требуются микроорганизмы, окисляющие бетулин региоселективно.

При исследовании трансформации бету-лина в неростовых условиях с помощью биомассы других микроорганизмов, полученной на среде с этим соединением, было обнаружено, что Mycobacterium sp. 1-4-1 и штаммы Т-12 и У3-2б сохраняют свои региоселективные свойства. Однако, в реакционных смесях этих штаммов накапливаются побочные продукты А, Б и К (табл.).

Таблица

Образование побочных продуктов микроорганизмами в ростовых условиях

Штаммы Побочные продукты

А Б К

Т-12 + - +

Mycobacterium sp. 1-4-1 - - +

УЗ-2б + + +

Наименее активно в ростовых условиях образовывал побочные продукты штамм Mycobacterium sp. 1-4-1, что делает его наиболее перспективным для получения бетулино-вой кислоты.

Было установлено, что для интенсивной трансформации бетулина этим штаммом в целевой продукт необходимо использовать трехсуточную культуру, характеризующуюся высокой концентрацией биомассы (около 5 г/л) и наиболее высокой трансформирующей активностью (рис. 2 и 3).

Суточные и двухсуточные культуры, имеющие более низкие концентрации менее активной биомассы, работают значительно медленнее. При использовании четырехсуточной био-

массы также имеет место снижение скорости трансформации субстрата вследствие уменьшения трансформирующей активности биомассы по сравнению с трехсуточной культурой.

6 л

4 5 5 -

1а и 4

ig 3 -

й

и се 2

м

о S 1 -

-0

0 HF-1-1-1-

0 24 48 72 96

Время, ч

Рис. 2. Динамика роста биомассы штамма Mycobacterium sp. 1-4-1: Условия роста: жидкая питательная среда на основе панкреатического гидроли-зата рыбной муки, 30 оС, аэрация перемешиванием на качалке 150 об/мин

Время, ч

■ скорость конверсии □ удельная активность Рис. 3. Изменение относительной скорости конверсии бетулина и относительной удельной трансформирующей активности в зависимости от возраста культуры Mycobacterium sp. 1-4-1: Условия трансформации: культура микроорганизмов — 20 мл; ацетон — 8%; бетулин - 0,75 мг/мл; 30 оС; 150 об/мин

Время, ч

- -О- - - бетулин —■— бетулиновая кисл<

—а-бетулиновый альдегид —О— продукт К

Рис. 4. Трансформация бетулина штаммом Mycobacterium sp. 1-4-1 в ростовой среде. Условия реакции: питательная среда - 20 мл; биомасса 5,0 мг(асв)/мл; бетулин — 0,75 мг/мл; 30 оС; 150 об/мин

Максимальный выход бетулиновой кислоты достигался между 24 и 36 часами трансформации и составляет 45—50 %. В этот период трансформации побочные продукты (бетули-новый альдегид и продукт К) присутствуют в наименьшем количестве.

Экспериментальная часть

Культуры микроорганизмов для исследований трансформации в ростовых условиях выращивали на среде следующего состава (г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки — 15; глюкоза — 1; КН2Р04 — 0.8; Ка2НР0442Н20 - 1.2; MgS04•7H20; - 0.2, (КН4)Б04 - 1.0; FeS04•7H20 - 0.01; М^04-7Н20 - 0.002; (КН4)2Мо04-2Н20 -0.001; вода водопроводная - 1000 мл; рН 7.0.

Выращивание микроорганизмов и трансформацию бетулина осуществляли в колбах объемом 250 мл на термостатируемых качалках в течение 1-4 сут. при 150 об/мин и температуре 30 °С. Бетулин вводили в среду в виде ацетонового раствора до конечной концентрации 0.75 мг/мл после того, как концентрация биомассы достигнет величины 4.5-5 г (асв)/л.

Концентрацию биомассы микроорганизмов оценивали измерением оптической плотности клеточных суспензий на спектрофотометре <^ресо1-221» с нефелометрической приставкой при I = 520 нм (длина оптического шага кюветы - 10 мм).

Продукты трансформации и остаточный субстрат экстрагировали хлороформом (1:1) из реакционной смеси, предварительно подкисленной 5%-ным раствором соляной кислоты до рН 1-2. Качественный анализ хлороформных экстрактов выполняли методом тонкослойной хроматографии с использованием в качестве стандартных меток тритерпеноидов (бетулина, бетулинового и бетулонового альдегидов, бетулиновой и бетулоновой кислот). Тонкослойную хроматографию проводили на

пластинках «Sorbfil» АФ-Ф-УФ, используя систему растворителей хлороформ-метанол в соотношении 100:2—1 (v/v). Хроматограммы проявляли свежеприготовленным раствором п-анисового альдегида (100 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл концентрированной серной кислоты, 1 мл анисового альдегида) при 90—110 °С в течение 3—5 мин.

Для количественного анализа тритерпено-идов хлороформенные экстракты, содержащие продукты трансформации и остаточный субстрат, разделяли на пластинах в слое силика-геля в той же системе растворителя. Разделенные тритерпеноиды элюировали хлороформом, после чего оценивали содержание этих соединений в элюатах спектрофотометрически на приборе «СФ-26» при 254 нм 8.

Литература

1. Kim, Darrick, S. H. L.; Chen, Zhidong; Nguyen, van Tuyen; Pezzuto, John M.; Qiu, Shengxiang; Lu, Zhi-Zhen. // Synth.Commun.- 1997.- V. 27.- P. 1607.

2. Pisha E, Chai H, Lee IS, Chagwedera TE, Farnsworth NR, Cordell GA, Beecher CW, Fong HH, Kinghorn AD, Brown DM, et al. // Nat. Med.- 1995.- V. 10.- P. 1046.

3. De Clercq E. // Mini Rev Med Chem.- 2002.-V. 2.- P. 163.

4. Holz-Smith SL, Sun IC, Jin L, Matthews TJ, Lee KH, Chen CH. // Antimicrob. Agents Chemother.- 2001.- V. 45.- P. 60.

5. Zhang Z, ElSohly HN, Jacob MR, Pasco DS, Walker LA, Clark AM. // Planta Med.- 2002.-V. 68.- P. 49.

6. Enwerem NM, Okogun JI, Wambebe CO, Okorie DA, Akah PA. // Phytomedicine.- 2001.-V. 8.- P. 112.

7. Kouzi SA, Chatterjee P, Pezzuto JM, Hamann MT. // J. Nat. Prod.- 2000.- V. 63.- P. 1653.

8. Митрофанов Д.В., Петухова Н.И., Флехтер О.Б., Галин Ф.З., Зорин В.В. // Баш. хим. ж.-2004.- Т. 11, № 1.- С. 42.

9. Ахрем А.А., Кузнецова А.И. Тонкослойная хроматография.- М.: «Наука», 1965.