CC BY
68
medical news of north caucasus
2016. Vоl. 11. Iss. 4
© Коллектив авторов, 2016
УДК 579.61:616-078:579.852.11
DOI - http://doi.org/10.14300/mnnc.2016.11135
ISSN 2073-8137
РАЗРАБОТКА МЕТОДА АНАЛИЗА ЕДИНИЧНЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОЛИМОРФИЗМОВ BACILLUS ANTHRACIS С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИНИСЕКВЕНИРОВАНИЯ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
Е. И. Еременко, В. В. Воропаев, Е. А. Котенева, А. Г. Рязанова, Л. Ю. Аксенова, О. И. Цыганкова, Н. П. Буравцева, А. Н. Куличенко
Ставропольский противочумный институт, Россия
DEVELOPMENT OF THE METHOD FOR ANALYSIS
OF BACILLUS ANTHRACIS SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS
USING THE MINI SEQUENSING AND MASS SPECTROMETRY
Eremenko E. I., Voropayev V. V., Kotenyova E. A., Ryazanova A. G., Aksyonova L. Yu., Tsygankova O. I., Buravtseva N. P., Kulichenko A. N.
Stavropol Anti-Plague Institute, Russia
Цель исследования: разработка метода SNP-генотипирования B. anthracis с использованием минисекве-нирования и MALDI TOF MS.
Материал и методы: исследовали ДНК штаммов B. anthracis, масс-спектры олигонуклеотидов с использованием реактивов для ПЦР, масс-спектрометрии, амплификатора ДНК, MALDI TOF масс-спектрометра, методов ПЦр-амплификации, ДНК-секвенирования и MALDI TOF масс-спектрометрии, компьютерных программ, on line ресурса BLASTn и баз данных GenBank.
Результаты: сконструированы праймеры для минисеквенирования 13 канонических SNP B. anthracis, подобран состав нуклеозидтрифосфатов для реакций, отработаны параметры реакций минисеквенирования и MALDI TOF масс-спектрометрии, проверена воспроизводимость и корректность получаемых результатов методами аллель-специфической ПЦР-амплификации в режиме реального времени и прямого секвенирования.
Заключение: впервые разработан метод SNP-генотипирования B. anthracis на основе минисеквенирования и MALDI TOF масс-спектрометрии.
Ключевые слова: B. anthracis, генотипирование, минисеквенирование, MALDI TOF масс-спектрометрия
Objective: development of the method for the B. anthracis SNP-genotyping using the mini sequencing and MALDI TOF MS.
Material and methods: DNA of B. anthracis strains, oligonucleotides mass specters using regents for PCR, mass spectrometry, DNA amplifier, MALDI TOF mass spectrometer, methods for PCR amplification, DNA sequencing and MALDI TOF mass spectrometry, computer hardware, BLASTn on line resource and GenBank data base were used.
Results. Primers for the 13 B. anthracis canonical SNPs mini sequencing and nucleoside triphosphates composition were designed, parameters for mini sequencing reaction were developed, reproducibility and correctness of obtained results by methods of real time allele-specific PCR amplification and direct sequencing were checked.
Conclusion: method for the SNP-genotyping using the mini sequencing and MALDI TOF MS has been developed.
Keywords: B. anthracis, genotyping, mini sequencing, MALDI TOF mass spectrometry
ßacШus ап^га^ является возбудителем особо опасной зоонозной инфекции, сибирской язвы, имеющей глобальное распространение и значимой для здравоохранения и ветеринарии. при эпидемиологическом расследовании вспышек инфекции как природного происхождения, так и обусловленных преднамеренным применением В. ап^га^ в качестве средства биотерроризма важно определить происхождение штаммов и пути распространения инфекции. это позволяет сделать анализ генетических маркеров штаммов, сре-
ди которых особое место занимают единичные нуклеотидные полиморфизмы (SNP) в силу их консерватизма. м. Van Ert и соавт. описали систему генотипирования B. anthracis с анализом 13 так называемых «канонических» SNP (canSNP) [8]. Система дает возможность без исследования всего генома на основании анализа небольшого количества маркеров точно определить принадлежность штамма к одной из основных групп молекулярного разнообразия сибиреязвенного микроба, сделать предварительное заключение о его географическом про-
исхождении и подтвердить идентичность изо-лятов из одной вспышки. SNP-генотипирование B. anthracis стало востребованным подходом в микробиологии и эпидемиологии сибирской язвы. Сравнение результатов, полученных в разных лабораториях, реально благодаря наличию поддерживаемых on line баз данных, таких как MLVA bank for Microbes Genotyping (http:// mlva.u-psud.fr/mlvav4/genotyping/). в этом ресурсе есть раздел SNP-типирования сибиреязвенного микроба, позволяющий соотнести свои данные с имеющимися в базе, классифицировать их и провести филогенетический анализ.
Предложено несколько методов SNP-гено-типирования - аллель-специфическая ПЦР-ампли-фикация, ПЦР-амплификация с анализом температуры плавления ампликонов высокого разрешения (HRM), технология SnaPshot, секвенирование и мини-секвенирование локусов с SNP. Принцип минисекве-нирования состоит в ферментативном достраивании праймера, непосредственно за З'-концом которого следует единичный нуклеотидный полиморфизм в комплементарной матрице, на тот или иной один или несколько нуклеотидов в зависимости от варианта аллеля SNP. Детекция результатов может осуществляться по флуоресцентной метке (SNaPshot) или по различиям в массе между исходным и удлинившимся праймером методом времяпролетной масс-спектрометрии с матрично активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS). Последний подход имеет преимущества перед вышеперечисленными методами, так как не требует флуоресцентно-меченых ну-клеотидов или зондов с модифицированными нуклеотида-ми, наличия автоматических анализаторов ДНК, позволяет провести детекцию в мультиплексном варианте с меньшими затратами. Метод мини-секвенирования в сочетании с MALDI-TOF MS разработан для анализа SNP возбудителя туберкулеза [4], нейссерий [2,6], вируса гепатита С [5], однако для возбудителя сибирской язвы он не описан.
Целью исследования была разработка метода SNP-генотипирования B. anthracis с использованием минисеквенирования и MALDI-TOF MS.
материал и методы. Исследовали штаммы B. anthracis из музея живых культур института. Культуры B. anthracis выращивали на агаре по Хоттинге-ру, pH 7,2. Использовали ацетонитрил и 3-гидрокси-пиколиновую кислоту (Bruker Daltonics, Германия), дезокси- и дидезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTPs и ddNTPs соответственно), цитрат аммония двухосновного, щелочную креветочную фосфатазу (активность 1 ед/мкл) и х10 буфер для щелочной фосфата-зы (Thermo Scientific, США), катионообменную смолу W50-x8 (Bio-Rad, США), SNPase-ДНК полимеразу с антителами и х5 ПЦР-буфер для SNPase-ДНК по-лимеразы («Биолинк», РФ), набор «ДНК-СорбВ», х5 смесь dNTP, х5 ПЦР-буфер (15 мМ MgCl2) и DiaTaq-полимеразу (2 ед/мкл) (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, РФ).
ORiGiNAL RESEARCH
■ Experimental medicine
Для выделения ДНК использовали 18-часовые культуры, выращенные при 37 оС. Все работы по про-боподготовке и обеззараживанию штаммов сибиреязвенного микроба проводили в соответствии с СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». Выделение ДНК набором «ДНК-сорб-В» проводили согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенности». Олиго-нуклеотидные праймеры для ПЦР-амплификации областей с SNP, описанные М. Van Ert и соавт. [8] (табл. 1) и разработанные нами для минисеквени-рования, синтезированы НПО «ДНК-синтез» (РФ). ПЦР и реакцию минисеквенирования проводили в термоциклере C-1000 DuoFast 48/48 (Bio-Rad, США). Масс-спектрометрическое определение размеров олигонуклеотидов после минисеквенирования проводили методом MALDI TOF-MS в приборе время-пролетный масс-спектрометр с матрично-активиро-ванной лазерной десорбцией/ионизацией Microflex LRF (Bruker Daltonics, Германия) в линейном режиме, используя азотный лазер с длиной волны 337 нм и частотой импульса 9 Hz в режиме положительных ионов. Время задержки анализатора - 200 нсек, напряжения на электроде ускорителя - 20,0 kV, накапливающем электроде - 17,1 kV, на фокусирующей линзе - 9,4 kV.
Последовательность праймеров для минисеквенирования выбирали с использованием компьютерных программ UniproUGENE (РФ) и PerlPrimer (Австралия) v1.1.21, корректность их последовательностей проверяли, пользуясь on line Internet-ресурсом NCBI BLASTn.
результаты и обсуждение. Разработка дизайна праймеров и реакционных смесей. Праймеры для удлинения в реакции минисеквенирования сконструировали, исходя из расположений 13 canSNP в геноме B. Anthracis [8], таким образом, чтобы единичный нуклеотидный полиморфизм локализовался непосредственно у З'-конца праймера и температуры отжига праймеров не отличались более чем на 2 °С (табл. 2). Правильность гибридизации праймеров проверили в программе BLASTn (NCBI) в сравнении с геномом штамма Ames (код доступа GenBank AE016879.1).
Таблица 1
праймеры для амплификации областей генома с SNP
SNP Нуклеотидная последовательность праймера, 5'^3'
Прямой Обратный
A.Br.001 caagcggaaccaaatttaatcttt ttcaccgtacgtcattgtataatacg
A.Br.002 aacgatacctaaaatcgataaag ggcagaaggagcaagtaatgtt
A.Br.003 gctactgtcattgtataaaaacctccttt cgcttgccaagctttttttc
A.Br.004 ccgataccagtaaacgacgacat ctggaattggtggagctatgga
A.Br.006 ccggaaattgctattagaacgaa tcccaatctagcgtttttaagttca
A.Br.007 ttggtaacgagacgataaactgaataa gccttggattggcgattg
A.Br.008 ttcgcaactacgctatacgttttagat caaacggtgaaaaagttacaaatatacg
A.Br.009 ggcaatcggccactgttt gggtttctactgtgtatgttgttaataaaaag
B.Br.001 tgcatgcttcttcttacagagtagttaat cggtcataaaagaaatcggtacaa
B.Br.002 tgttgcaccttctgtgttcgtt gtagtggcttcaccgaatgga
B.Br.003 catttattcgcatagaagcagatga tgtgccatcaaataactctttctcaa
B.Br.004 gaagttaagtatcaaccagcagaagaaa ccgccgccttgagctt
A/B. Br.001 gaaggtctccaatttggatttaaaat cgtgtgaacctttcggtaaatagtc
MEDicAL NEws of NoRTH cAucAsus
2016. Vоl. 11. iss. 4
Таблица 2
Состав праймеров, реакционных смесей для реакций минисеквенирования и молекулярные массы исходных и удлиненных праймеров
SNP Замены оснований Состав реакционной смеси Праймер Аллель 1 Аллель 2
Последовательность праймера, 5'-3' Мол. масса, Да (Обозначение) и мол. масса, Да (Обозначение) и мол. масса, Да
A.Br.001 C~T dT ddG ddC atttaatctttaaaggaaaaccgaaa 7994 (C) 8267 (T)9220
А.Вг.002 G^A com dA ddG ddC TAAAGCGACTGCCGCCCA 5454 (G) 5767 (A) 6040
A.Br.003 G^A com dA ddG ddC AAACCICCIIIIICIACCICAA 6564 (G) 6894 (A)7151
A.Br.004 C~T dT ddC CGCCGTCATACTTTGGAATG 6108 (C) 6381 (T) 6685
А.Вг.006 A~C dC ddA ddG TTGTTGATCATTCCATCGCCT 6338 (A) 6635 (C) 6947
A.Br.007 T^C com dT ddA ddC gataaactgaataataccatcctta 7617 (T) 8218 (C) 7890
A.Br.008 T^G com dG ddT ddC CGI I I IAGAI GGAGAIAAI ICIIC 7373 (T) 7661 (G)7975
A.Br.009 A~G dG ddC ddA CCACIGIIIIIGAACGGCI I I 6378 (A)6675 (G) 6981
B.Br.001 T^C com dC ddT TATGATACCGATACCTTCTTATC 6949 (T) 7237 (C) 7526
B.Br.002 T^C com dT ddC ddG TGTGTTCGTTGTTAACGTTACT 6737 (T) 7315 (G)7051
В.Вг.003 G~A dA ddC ddG AAGCAGATGAGCTTACATATCC 6727 (G) 7041 (A)7318
B.Br.004 C~T dT ddC I I GGGIAACCI ICIIIACIICIA 6971 (C) 7244 (T) 7548
A/B. Br.001 A~G dG ddA AI CGCI GCACI CI IMAM IAG 6666 (A) 6964 (G)7293
Изучили два варианта удлинения праймера - в реакциях минисеквенирования с набором из всех четырех терминирующих ddNTPs и с набором из определенных dNTPs и ddNTPs в зависимости от контекста нуклеотидных последовательностей в области SNP. В первом случае теоретические различия в молекулярных массах удлиненных праймеров для двух возможных аллелей SNP не превышали 15-30 Да, во втором же варианте они были в пределах от 257 до 993 Да, что повышало дискриминирующие возможности анализа, поэтому предпочли вариант с составом реакционных смесей с набором из определенных dNTPs и ddNTPs (см. табл. 2). Корректность разработанных праймеров и генерируемых в реакции минисеквенирования с данным набором dNTPs аллелей SNP подтвердили проверкой in silico в программе BLASTn (NCBI) в сравнении с геномами 38 штаммов из базы GenBank.
Описание разработанного метода. Последовательность операций метода начиналась с выделения ДНК штаммов B. anthracis, которую проводили набором «ДНК-сорб-В» в соответствии с инструкцией производителя. Затем следовала ПЦР-амплификация 13 областей генома, содержащих SNP, с выделенной ДНК-матрицей и праймерами, описанными в таблице 1. Реакционные смеси в объеме 25 мкл содержали 5 мкл *5 ПЦР-буфера, 2,5 мкл *5 dNTP mix, по 0,2 мкл прямого и обратного праймера с концентрацией 100 пМ, 0,5 мкл ДиаTaq полимеразы, 10 мкл ДНК-матрицы и 6,6 мкл деионизованной воды. ПЦР проводили по программе: 95 °С - 5 мин ^ (95 °С -10 с, 58 °С - 20 с, 72 °С - 15 с) - 40 циклов ^72 °С -3 мин. Следующий этап состоял в очистке продуктов амплификации от не включившихся нуклеозидтри-фосфатов. 10 мкл амплификата переносили в пЦр-пробирки объемом 0,2 мл и смешивали с раствором щелочной креветочной фосфатазы, приготовленной на льду (х10 буфер для щелочной фосфатазы -
2 мкл, щелочная фосфатаза - 1 мкл, деионизованная вода - 7 мкл). Реакцию проводили 30 мин при температуре 37 °С и затем останавливали прогреванием при 90 °С в течение 20 мин. Очищенные таким образом амплификаты использовали для проведения реакции минисеквенирования. В состав реакционных смесей объемом 10 мкл входило 2 мкл *5 буфера для SNPase ДНК полимеразы, смесь dNTPs и dNTPs по 2 мкмоль каждого и по 5 пмоль каждого праймера (см. табл. 2), 5 ед SNPase ДНК полимеразы, 5 мкл очищенного амплификата и деионизованная вода до конечного объема. Реакционные смеси центрифугировали 3 мин при 2000 об/мин и проводили реакцию минисеквенирования по программе: 95 °С - 1 мин ^ (95 °С - 30 с, 59 °С - 30 с, 72 °С - 20 с) - 35 циклов ^72 °С - 5 мин. По окончании минисеквенирования продукты реакции обессоливали катионообменной смолой. В пробирку с 10 мкл продуктов минисеквенирования вносили 20 мкл деионизованной воды и 20 мкл суспензии активированной катионообменной смолы W50-x8. Смесь перемешивали на вортексе в течение 30 мин и центрифугировали 4 мин при 2000 об/мин. Для проведения анализа использовали су-пернатант.
На следующем этапе готовили матрицу для масс-спектрометрии, растворяя 3-гидроксипиколиновую кислоту до насыщения в 50 % водном растворе аце-тонитрила, и раствор цитрат аммония двухосновного из расчета 1 г на 10 мл деионизованной воды. Смешивали 9 объемов раствора 3-гидроксипиколиновой кислоты и 1 объем раствора цитрат аммония двухосновного, перемешивали на вортексе 1-2 мин.
Затем наносили на мишень АпсогСЫр 0,5 мкл матрицы и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Равный объем образца (0,5 мкл) наносили на высушенную матрицу. После высыхания образца мишень помещали в MALDI-TOF масс-спектрометр для анализа.
oRiGiNAL RESEARCH
■ Experimental medicine
Параметры масс-спектрометра оптимизировали для диапазона m/z от 4500 до 12000, используя для определения калибровочных констант масс-спектры пептидов. Каждый масс-спектр олигонуклеотидов получали при 30 накоплениях с постоянной мощностью лазерного излучения на уровне порогового значения для увеличения разрешения. На суммарном масс-спектре фиксировали пик, соответствующий массе праймера, пик, соответствующий массе продукта, и ориентировались также на разницу в их массах (см. табл. 2).
Результаты регистрировали в виде записи буквенных обозначений аллелей всех 13 canSNP в том порядке, как они перечислены в таблице 2. Например, полный SNP генотип штамма B. anthracis 1295/357, результат определения SNP A.Br.002 которого приведен на рисунке, выглядел следующим образом:
T G A T C T T A T T A T A, что соответствовало генотипу B.Br.001/002, исходя из предложенных обозначений [8].
Оценка эффективности метода. Воспроизводимость и корректность получаемых результатов проверили троекратным повторением типирования 10 штаммов B. anthracis, отобранных по признаку разного географического происхождения, и сравнением их с результатами, полученными методом прямого сек-венирования амплификатов с праймерами из таблицы 1, а также методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени с LNA-модифицированными зондами [3]. Во всех случаях получено полное совпадение результатов SNP-генотипирования.
Сравнивая разработанный метод с известными, отметим, что система SNP-генотипирования B. anthracis на основе аллель-специфической Rеal time PCR с флуоресцентными MGB-зондами [8], технология которых в РФ не используется, требует наличия амплификатора для ПЦР в режиме реального времени. Метод SNP-генотипирования B. anthracis на основе набора SNaPshot Multiplex Kit
(Applied Biosystems, USA) [1] требует наличия этого набора и автоматического ДНК-анализатора той же фирмы. Это же относится и к методу CUMA (capillary electrophoresis universal-tail mismatch amplification mutation assay) [7]. Поэтому при наличии MALD-TOF масс-спектрометра, универсального прибора для анализа многих макромолекул, включая белки, нуклеиновые кислоты, липиды, предлагаемый метод становится хорошей альтернативой или дополнением других методов SNP-генотипирования.
заключение. Для определения SNP-генотипов штаммов B. anthracis впервые предложен методический подход, состоящий в последовательном использовании минисеквенирования областей генома, содержащих 13 «канонических» единичных нуклеотидных полиморфизмов, и определения аллелей по разнице в величине молекулярных масс секвенированных фрагментов ДНК MALD-TOF масс-спектрометрией.
SNP-генотипирование возбудителя сибирской язвы незаменимо в эпидемиологии как быстрый способ установления принадлежности выделенных в ходе вспышки инфекции штаммов к одной из узловых групп глобального молекулярного разнообразия вида B. anthracis. Это дает возможность сделать предварительное предположение о географическом происхождении штамма, исключить интродукцию не эндемичных вариантов и установить или отвергнуть общий источник инфекции.
В теоретических исследованиях SNP-генотипи-рование позволяет проследить эволюцию сибиреязвенного микроба в целом и в масштабах разных территорий.
Разработанный метод SNP-генотипирования B. anthracis имеет преимущества перед другими методами благодаря возможности мультиплексирования анализов, меньшим материальным затратам и, таким образом, может быть полезным в работе профильных микробиологических лабораторий.
Литература
1. Афанасьев, М. В. Сравнительный мультилокусный VNTR и SNP-анализ вакцинных штаммов Bacillus anthracis / М. В. Афанасьев, Е. В. Кравец, З. Ф. Ду-гаржапова [и др.] // Молекулярная генетика микробиология и вирусология. - 2014. - № 2. - C. 36-40.
2. Верещагин, В. А. Использование масс-спектрометрии MALDI TOF для выявления в генах gyrA и parC Neisseria gonorrhoeae однонуклеотидных замен, определяющих формирование устойчивости к фторхинолонам / В. А. Верещагин, Е. Н. Ильина, М. М. Зубков [и др.] // Молекулярная биология. -2005. - Т. 39, № 6. - С. 923-932.
3. Котенева, Е. А. Анализ canSNP генотипов штаммов Bacillus anthracis, выделенных на территории Северного Кавказа и Закавказья / Е. А. Котенева, О. И. Цыганкова, Е. И. Еременко // Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины : материалы VI Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора. - Ставрополь, 2014. - С. 57-58.
4. Afanas'ev, M. V. Molecular characteristics of rifampicin-and isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Russian Federation / M. V. Afanas'ev, L. N. Ikryannikova, E. N. Il'ina [et al.] // J. Antimicrob.
Chemother. - 2007. - Vol. 59. - P. 1057-1064. doi: 10.1093/jac/dkm086
5. Nina, E. N. Matrix-Assisted Laser Desorption lonization-Time of Flight (Mass Spectrometry) for Hepatitis C Virus Genotyping / E. N. Ilina, M. V. Malakhova, E. V. Generozov [et al.] // J. Clin. Microbiol. -2005. - Vol. 43, № 6. - P. 2810-2815. doi: 10.1128/ JCM.43.6.2810-2815.2005
6. Lowe, C. A. A single nucleotide polymorphism identification assay for the genotypic characterization of Neisseria meningitidis using MALDI-TOF mass spectrometry / C. A. Lowe, M. A. Diggle, S. C. Clarke // Br. J. Biomed. Sci. - 2004. - Vol. 61, № 1. - P. 8-10.
7. Price, E. P. Cost-effective interrogation of single-nucleotide polymorphisms using the mismatch amplification mutation assay and capillary electro-phoresis / E. P. Price, M. A. Matthews, J. A. Beaudry [et al.] // Electrophoresis. - 2010. - Vol. 31, № 23-24. -P. 3881-3888. doi: 10.1002/elps.201000379
8. Van Ert, M. N. Global Genetic Population Structure of Bacillus anthracis / M. N. Van Ert, W. R. Easterday, L. Y. Huynh [et al.] // PLoS ONE. - 2007. - Vol. 2, № 5. -e461. doi: 10.1371/journal.pone.0000461
References
1. Afanas'ev M. V., Kravets E. V., Dougarzhapova Z. F., Takaishvili V. E. Molekulyarnaya genetika mikrobiologiya i virusologiya. - Molecular genetics Microbiology and Virology. 2014;2:36-40.
2. Vereschagin V. A., Il'ina S. V., Zubkov M. M., Priputne-vitch T. V. Molekulyarnaya biologiya. - Molecular biology. 2005:39(6):923-932.
3. Kotenyova E. A., Tsygankova O. I., Eremenko E. I. Aktualnye problemy epidemiologii i profilakticheskoy
MEDicAL NEws of NoRTH cAucAsus
2016. Vоl. 11. iss. 4
meditsiny: Materialy VI Vserossyskoy nauchno-prakticheskoy konferentsii molodykh uchenykh i spetsialistov Rospotrebnadzora. 2014. Р. 57-58.
4. Afanas'ev M. V., Ikryannikova L. N., Il'ina E. N., Sidorenko S. V., Kuz'min A. V., Larionova E. E., Smirnova T. G., Chernousova L. N., Kamaev E. Yu., Skorniakov S. N., Kinsht V. N., Cherednichenko A. G., Govorun V. M. J. Antimicrob. Chemother. 2007;59:1057-1064. doi: 10.1093/jac/dkm086
5. Ilina E. N., Malakhova M. V., Generozov E. V., Niko-laev E. N., Govorun V. M. J. Clin. Microbiol. 2005;43(6):2810-2815. doi: 10.1128/JCM.43.6.2810-2815.2005
6. Lowe C. A., Diggle M. A., Clarke S. C. Br. J. Biomed. Sci. 2004;61(1):8-10.
7. Price E. P., Matthews M. A., Beaudry J. A., Allred J. L., Schupp J. M., Birdsell D. N., Pearson T., Keim P. Electrophoresis. 2010;31(23-24):3881-3888. doi: 10.1002/elps.201000379
8. Van Ert M. N., Easterday W. R., Huynh L. Y., Okinaka R. T., Hugh-Jones M. E., Ravel J., Zanecki S. R., Pearson T., Simonson T. S., U'Ren J. M., Kachur S. M., Leadem-Dougherty R. R., Rhoton S. D., Zinser G., Farlow J., Co-ker P. R., Smith K. L., Wang B., Kenefic L. J., Fraser-Liggett C. M., Wagner D. M, Keim P. PLoS One. 2007;2(5):e461. doi: 10.1371/journal.pone.0000461
Сведения об авторах:
Еременко Евгений Иванович, доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории сибирской язвы; тел.: (8652)260312, 89614549626; e-mail: [email protected]
Воропаев Владимир Владимирович, младший научный сотрудник лаборатории постгеномных технологий; тел.: (8652)260312, 89197493123; e-mail: [email protected]
Котенева Елена Анатольевна, кандидат биологических наук, заведующая лабораторией; тел.: (8652)260312, 89054125473; e-mail: [email protected]
Рязанова Алла Геннадьевна, кандидат медицинских наук, заведующая лабораторией сибирской язвы; тел.: (8652)260312, 89097646158; e-mail: [email protected]
Аксенова Людмила Юрьевна, кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник; тел.: (8652)260312, 89054192575; e-mail: [email protected]
Цыганкова Ольга Ивановна, доктор медицинских наук, доцент, ведущий научный сотрудник; тел.: (8652)260312, 89054697529; e-mail: [email protected]
Буравцева Нина Пантелеймоновна, доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник; тел.: (8652)260312, 89054965463; e-mail: [email protected]
Куличенко Александр Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, директор; тел.: (8652)260312, 89624403373; e-mail: [email protected]
© З. А. Кисиева, В. Б. Брин, 2016 УДК 616-003.821.001.6
DOI - http://doi.org/10.14300/mnnc.2016.11136 ISSN 2073-8137
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПРОФИЛАКТИКА РАЗВИТИЯ МОДЕЛИ АМИЛОИДОЗА У СИРИЙСКИХ ХОМЯКОВ
З. А. Кисиева, В. Б. Брин
Северо-Осетинская государственная медицинская академия, Владикавказ, Россия
EXPERIMENTAL PREVENTION OF AMYLOIDOSIS IN SYRIAN HAMSTERS
Kisieva Z. A., Brin V. B.
North Ossetian State Medical Academy, Vladikavkaz, Russia
Целью исследования явилось изучение профилактического влияния милдроната и ацизола с первых дней введения нативной овечьей плазмы на морфофункциональные показатели почек у животных.
Установлено, что одновременное введение ацизола и милдроната опытным животным с первых дней введения нативной овечьей плазмы способствует развитию менее выраженных нарушений, характерных для амилоидной нефропатии, обусловленных меньшим нарушением фильтрационной способности и уменьшением канальцевой реабсорбции воды, значительным повышением экскреции натрия, снижением калий и каль-цийуреза, значительным снижением степени протеинурии, а также менее выраженной гистологически подтвержденной картиной повреждения изученных органов, выражающихся в уменьшении накопления амилоида в стромально-сосудистых структурах исследуемых органов (почки, сердце, печень, селезенка).
Ключевые слова: амилоидная нефропатия, калий и кальцийурез, фильтрационная способность почек, ка-нальцевая реабсорбция воды
