CC BY
56
moobюlogy
коллектив авторов, 2018
УДК 616.98:579.873.21]-078
Сароянц Л.в.1, Арнаудова К.Ш.1, Абрамов Д.Д.2, Трофимов Д.Ю.2
РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛЕПРЫ С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
1ФГБУ «НИИ по изучению лепры» Минздрава РФ, 414057, Астрахань, Россия; 2ООО «НПФ ДНК-Технология», 115478, Москва, Россия
Цель исследования — разработка методов лабораторной диагностики лепры на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Отработаны методы экстракции ДНК из различного клинического материала (биоптаты и скарификаты кожи, соскобы со слизистой поверхности носа и с трофических язв, сыворотки крови). Сконструированы системы олигону-клеотидов к 16S рРНК и зонда для идентификации Mycobacterium leprae в формате Real-time для амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия), отработан оптимальный режим амплификации. Для контроля за ходом ПЦР вводили систему внутреннего контроля. Оценка специфичности и чувствительности тест-системы проводилась на 17 штаммах различных видов микобактерий и клинических образцах от 32 больных лепрой и 15 здоровых лиц, находящихся в семейном контакте с больными лепрой. Установлена 100% чувствительность обнаружения Mycobacterium leprae в биоптатах кожи методом ПЦР по сравнению со стандартным бактериоскопическим методом (88,9%). Во всех других клинических образцах также определялась более высокая чувствительность разработанной тест-системы на основе ПЦР. Предложенная тест-система обладает высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет решить вопрос быстрой идентификации Mycobacterium leprae, и может быть использована в эпидемиологических исследованиях при изучении распространения возбудителя заболевания.
Ключевые слова: Mycobacterium leprae; тест-система; Real-time ПЦР; биоптаты; скарификакты. Для цитирования: Сароянц Л.В., Арнаудова К.Ш., Абрамов Д.Д., Трофимов Д.Ю. Разработка лабораторной диагностики лепры с помощью полимеразной цепной реакции. Клиническая лабораторная диагностика. 2018;63 (1): 55-59. DOI:http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-1-55-59
SaroyantsL.V.1, ArnaudovaK.Sh.J, AbramovD.D.2, TrofimovD.Yu.2
the development of laboratory diagnostic of leprosy using polymerase chain reaction
1Leprosy research institute of Minzdrav of Russia, 414057 Astrakhan, Russia
2DNA-Technology LLC, 115478 Moscow, Russia
The purpose of study is to develop techniques of laboratory diagnostic of leprosy on the basis ofpolymerase chain reaction. The techniques were worked through such as extraction of DNA from various clinical material (bioptates and scarificate of skin, scrapes from mucous surface of nose and trophic ulcers, blood serum). The systems of oligonucleotides were constructed to 16S pRNA and probe for identification of Mycobacterium leprae in real-time format for amplifier DT-96 ("The DNA-Technology", Russia). The optimal regimen of amplification was worked out. To control polymerase chain reaction processing a system of internal control was introduced. The evaluation of specificity of test-system was implemented using 17 strains of various types of mycobacteria and clinical samples from 32 patients with leprosy and 15 healthy individuals being in family contact with patients with leprosy. The 100% sensitivity was established concerning detection of Mycobacterium leprae in bioptates of skin using polymerase chain reaction technique as compared with standard bacterioscopic technique (88.9%). In all other clinical samples, a higher sensitivity of developed test-system on the basis ofpolymerase chain reaction was detected too. The proposed test-system has higher sensitivity and specificity that permits to resolve an issue of fast identification of Mycobacterium leprae. It can be applied in epidemiological studies at investigation of prevalence of agent of disease.
Keywords: Mycobacterium leprae; test-system; polymerase chain reaction in real-time; bioptate; scarificate
For citation: Saroyants L.V, Arnaudova K.Sh., Abramov D.D., Trofimov D.Yu. he development of laboratory diagnostic of leprosy using polymerase chain reaction. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2018; 63 (1): 55-59. (inRuss.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-1-55-59
For correspondence: Saroyants L.V, doctor of medical sciences, leading researcher, the head of the laboratory experimental department of the Federal state budget scientific institution "Leprosy Research Institute ". e-mail: [email protected] Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. Acknowledgment. The study had no sponsor support
Received 31.07.2017 Accepted 01.08.2017
Для корреспонденции: Сароянц Людмила Валентиновна, д-р мед. наук, вед. науч. сотр., зав. лабораторно-экспериментальным отделом ФГБУ «НИИ по изучению лепры» Минздрава РФ; е-mail: [email protected]
Введение. Лепра — инфекционное заболевание, вызываемое микобактериями лепры, отличающееся упорным хроническим, прогрессирующим течением и характеризующееся поражением кожи, периферической нервной системы и внутренних органов. Несмотря на долгую историю заболевания, известную с библейских
микробиология
времен [1], ранняя диагностика лепры по-прежнему остается серьёзной проблемой из-за низкой чувствительности стандартных методов диагностики и невозможности культивирования микобактерий лепры.
Возбудителем заболевания является Mycobacterium leprae, открытая Хансеном в 1874 г. [2], она относится к роду Mycobacterium, семейству Mycobacteriaceae, порядку Actinomycetales и классу Actinomycetes [3]. Наружный слой представлен электронно-плотной микрокапсулой толщиной от 5 до 15 нм, состоящей из мукополисахари-дов, что определяет антигенность M. leprae и формирование лекарственной устойчивости. Под микрокапсулой находится трехслойная клеточная стенка толщиной от 8 до 20 нм, к которой примыкает трехслойная цитоплазма-тическая мембрана. Способ размножения M.leprae, как правило, поперечное деление, скорость одного деления около 12 сут. Основной путь распространения лепры — воздушно-капельный.
Попытки культивирования M. leprae и заражение лепрой экспериментальных животных начались сразу после открытия возбудителя и продолжаются до настоящего времени. Особое место среди экспериментальных моделей заняла модель, предложенная С. Shepard в 1960 г. [4]. Моделирование заключалось в заражении мышей дозированным количеством M. leprae в подушечки лапок и дальнейшим размножением микобактерий в месте инокуляции. После завершения эксперимента (период 8—12 мес) подсчитывалось число микобактерий в лапке по методу С. Shepard и D. McRae [5] и сравнивалось с числом введенных микобактерий. Несмотря на то что данная модель общепризнана и занимает значимое место в экспериментальной лепрологии, особенно при изучении новых лекарственных препаратов и получении антигенного материала, она имеет и ряд недостатков: длительность эксперимента из-за медленного локального размножения микобактерий, а также отсутствие генерализации процесса. Кроме того, при моделировании лепрозной инфекции не было возможности с достаточной степенью достоверности подтвердить, что микобактерии, пассируемые на животных, идентичны микобактериям, выделенным от больного лепрой. Поэтому вопрос идентификации микобактерий при смене организма-хозяина является актуальным.
Лепра представляет собой сложный спектр клинических форм, которые развиваются после инкубационного периода длительностью от 2 до 30 лет [6]. В клинической практике диагноз основывается на оценке кожных проявлений, гистологическом исследовании образцов кожи и положительном бактериоскопическом анализе (мазок по Цилю—Нильсену). Однако чувствительность бакте-риоскопического анализа невелика, что существенно затрудняет диагностику лепры на ранних стадиях болезни и при малобактериальных формах заболевания.
Многие из методов, используемых в диагностике других микобактериальных инфекций, недоступны при лепре [7], что связано с невозможностью культивирования M. leprae на искусственных питательных средах и с тем, что единственным признанным природным резервуаром являются девятипоясные броненосцы (Dasypus novemcinctus) [8, 9], обитающие в Южной Америке.
По данным ВОЗ ежегодно в мире регистрируются около 300 тыс новых случаев заболевания лепрой [10]. В нашей стране в последние годы отмечается значительное снижение числа зарегистрированных больных лепрой, при этом поток мигрантов из эндемичных по ле-
пре стран увеличивается. Значительный полиморфизм клинических проявлений, разнообразный характер течения, а также длительный инкубационный период практически исключают возможность постановки диагноза на ранних стадиях болезни. В связи с этим диагностика лепры остаётся актуальной проблемой для общественного здравоохранения. Решению проблем идентификации возбудителя инфекционных заболеваний, особенно некультивируемых форм, помогли разработанные в последнее время молекулярно-генетические методы, которые открыли принципиально новые возможности для создания высокочувствительных и специфичных методов диагностики вирусных и бактериальных заболеваний, в том числе и лепры [11—15].
Цель данного исследования — сконструировать систему олигонуклеотидов для идентификации M. leprae, отработать методы пробоподготовки, экстракции ДНК из различного клинического материала, режимы ПЦР-амплификации ДНК, и апробировать чувствительность и специфичность разработанной тест-системы.
Материал и методы. Для оценки чувствительности и специфичности разработанной тест-системы использовали ДНК из клеток различных видов организмов: M. intracellular, M. Кедровского (белый штам), M. avium, M. vaccae, M. clegg, M. duvalli, M. kansasii, M. phlei, M. marinum, M. scrofulaceum, M. gastri, M. gordonal, M. lufu, M. Кедровского (розовый штамм), M. smegmatis, M. bo-vis, M. paratuberculosis.
Выделение ДНК проводили тремя методами: М1 — с помощью комплекта реагентов «ПРОБА-НК» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия); М2 — использовали комплект реагентов «ПРОБА-ГС» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия); М3 — автоматический методом выделения ДНК набором реагентов (GXT DNA/RNA GenoExtraction Kit, «Hain Lifescience», Германия) на станции GenoXtract («Hain Lifescience», Германия), при котором микобактерии связываются с магнитными частицами, происходит лизис и осаждение ДНК на частицах, с последующей магнитной сепарацией и удалением остатков клеток, отмывкой и переносом образцов в пробирки. Процедура пробоподготовки и метода экстракции зависели от природы исследуемого образца.
Соскоб со слизистой носа и с поверхности трофических язв производили с помощью стерильных одноразовых зондов. Биоптат кожи после иссечения разрезали на мелкие кусочки и гомогенизировали. При взятии скари-фикатов на пораженных участках кожи скальпелем делали небольшой разрез (глубиной 1—2 мм) и стерильным одноразовым зондом собирали тканевую жидкость. Все пробы после забора материала помещали в пробирки с 300 мкл стерильного физиологического раствора.
Выбор олигонуклеотидных праймеров для ПЦР осуществлялся путём анализа последовательностей ДНК M. leprae, полученных из базы данных NCBI (http//www. ncbi.nlm.nih.gov/), а также с использованием данных литературы [16—18]. Праймеры для ПЦР были подобраны с учётом GC состава матрицы, расчётной температуры гибридизации, наличия гомологичных участков последовательностей ДНК у других организмов. Для подбора праймеров и олигонуклеотидных проб использовано программное обеспечение Oligo 6.0.
Синтез праймеров и олигонуклеотидных флуорес-центномеченых зондов для ПЦР в реальном времени проводили на синтезаторах ДНК ASM-800 и aSm-102 (Россия, Новосибирск), позволяющих синтезировать
microbiology
Характеристика праймеров, зонда и размера ампликона для детекции M. leprae Таблица 1
Праймер Нуклеотидная последовательность праймеров и зондов Размер продукта ПЦР, п.н.
16s-U 16s-U 16s-P 5'- CGA ACG GAA AGG TCT СТА AA -3' 5'- GTC GAA CGG AAA GGT СТС TAA A -3' (FAM)- 5'- СТТ CAA GGC GCA TGT СТТ GTG GTG GAA -3'-(BHQ1) 290
как экспериментальные (20 нмоль), так и препаративные количества (0,5 мкмоль). Использовали флуоро-форы (БАМ, НЕХ) и гасители флуоресценции (BHQ1), синтезированные в лаборатории изотопных методов анализа Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Оли-гонуклеотиды очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием обращен-нофазных колонок Диасфер-110-С18 (Россия). Чистоту полученных олигонуклеотидов контролировали методом аналитического вертикального гель-электрофореза в полиакриламидном геле (табл. 1).
ПЦР проводили в 35 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл образца ДНК и следующие компоненты: 10 пмоль каждого праймера; 1,1 мкмоль каждого dNTP; 64 мкмоль ТЯБ-На (рН 8,6); 25 мкмоль (ПН4^04; 2,5 мкмоль — МgCl2 а также 5 единиц Taq-полимеразы. Для предотвращения изменения концентрации компонентов реакционную смесь покрывали 20 мкл минерального масла. Для осуществления «горячего старта» и предотвращения неспецифического отжига праймеров использовали парафиновую прослойку, разделяющую компоненты реакционной смеси.
Отработанный режим амплификации: 80°С — 30 с, 94°С — 1 мин 30 с 1 цикл; 94°С — 30 с, 64°С — 15 с 5 циклов; 94°С — 10 с, 64°С — 15 с 45 циклов; 10°С — хранение. Амплификацию ДНК проводили в термо-циклере «Терцик» (ООО «НПО ДНК-Технология, Россия) для дальнейшей постановки в электрофорезе. Учёт реакции проводился в трансиллюминаторе. При использовании ПЦР в реальном времени амплификация и детекция ДНК проходили в амплификаторе ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Детекцию флуоресценции проводили при 64°С.
Для контроля за ходом ПЦР вводили систему внутреннего контроля — ВК (клонированнный фрагмент гена рецептора фактора роста человека, пара праймеров и олигонуклетидный зонд, комплементарные ему). Критерием пригодности системы ВК служило отсутствие ингибирования специфической реакции, при этом ВК должен работать в случае отсутствия специфической реакции.
Метод ПЦР был апробирован на клиническом материале от 32 больных лепрой и 15 здоровых лиц, находящихся в семейном контакте с больными лепрой. Для проведения бактериоскопического и молекулярно-генетического исследований использовали биоптаты кожи (18), соскобы со слизистой поверхности носа (47), скарификаты кожи (54), соскобы с трофических язв (15) и сыворотки крови (29). Всего исследовано 148 образцов диагностического материала. Одновременно одни и те же образцы исследовали различными методами. У группы больных диагноз подтверждён клинически, бак-териоскопически и гистологически.
Результаты. Первоначально оценку специфичности
тест-системы на основе ПЦР к 16s рРНК проводили электрофоретически в агарозном геле с использованием ДНК различных видов микроорганизмов (см. выше), ДНК от больных лепрой и экспериментальных животных (модель Шепарда). В результате проведения ПЦР и последующего электрофореза был зафиксирован синтез ампликона размером 290 п.н. только в биологических образцах от больных лепрой (скарификаты и биоптаты кожи, соскобы со слизистой носа и с трофических язв). Во всех случаях результаты совпали со стандартными бактериоскопическими и гистологическими методами исследования.
После установления высокой степени чувствительности и специфичности данных праймеров была разработана последовательность флуоресцентных зондов для создания тест-системы в Real time. Клиническое апробирование тест-системы для выявления M. leprae методом ПЦР в реальном времени также проведено у больных лепрой и здоровых лиц, находящихся в семейном контакте с больными лепрой. Чувствительность метода зависела от характера модельного образца клинического материала (табл. 2).
Чувствительность бактериоскопического метода составила 88,9%. Самая высокая частота обнаружения ДНК M. leprae отмечалась в биоптатах кожи от больных лепрой, причём более эффективный метод выделения ДНК был М1. При выделении ДНК методом М1M. leprae идентифицировалась во всех 18(100%) гистологически подтверждённых биоптатах кожи, методом М2 — в 17(94,4%). Таким образом, методом ПЦР M. leprae об-
Таблица 2
Частота выявления M. leprae различными методами идентификации
Клинический Число ис- Бактериоско- ПЦР Real time
материал следуемых пия на 16S рРНК
образцов абс. % абс. %
Скарификаты 54 + 32 59,3 36 66,7
кожи - 22 40,7 18 33,3
Биоптаты кожи 18 + 16 88,9 18 100
- 2 11,1 0 0
Соскобы со сли- 32 + 20 62,5 22 68,8
зистои носа - 12 37,5 10 31,2
Соскобы с язв 15 + 0 0 3 20,0
- 15 100 12 80,0
Пробы сыворот- 29 + 0 0 0 0
ки крови - 29 100 29 100
Всего... 148 + 68 45,9 79 53,4
- 80 54,1 69 46,6
микробиология
наруживалась в биоптатах кожи даже в бактериоскопи-чески негативных образцах: методом М1 — в 2(11,1%) случаях, а методом М2 — в 1(5,5%).
При исследовании 32 соскобов со слизистой поверхности носа M. leprae также идентифицировалась чаще при ПЦР-анализе, чем при бактериоскопии. При выделении ДНК методами М1 и М2 в 22(68,8%) случаях идентифицировалась M. leprae, что на 2(6,3%) случая больше, чем при бактериоскопическом исследовании. В 54 скарификатах кожи от больных лепрой при экстракции методами М1 и М2 ДНКM. leprae детектировались в 36(66,7%) случаях, в отличие от 32 бактериоскопически позитивных образцов. При проведении ПЦР-анализа в соскобах с трофических язв ДНК M. leprae обнаруживалась при использовании методов выделения М1 и М2 в 3(20%) случаях, хотя при бактериоскопии все 15 соско-бов были отрицательны.
При выделении ДНК методом М3 M. leprae идентифицировалась в соскобах со слизистой поверхности носа, а также в биоптатах и скарификатах кожи только в бактериоскопически положительных образцах. В образцах сывороток крови от больных лепрой при использовании всех методов экстракции ДНК M. leprae не выявлялась.
Специфичность теста проверялась на биологических образцах (биоптаты, скарификаты кожи, сыворотка крови, соскобы со слизистой поверхности носа), полученных от здоровых лиц. Специфичность праймеров составила 100%. Ни в одном из образцов ДНК M. leprae не обнаруживалась, что и подтвердилось стандартными методами.
Таким образом, при сопоставлении результатов, полученных различными методами идентификации M. lep-rae в разных биологических образцах, метод ПЦР показал более высокую чувствительность при сравнении со стандартным бактериоскопическим исследованием. При этом во всех случаях идентификации M. leprae бактериоскопическим и гистологическим методами результаты ПЦР были положительными (коэффициент ассоциации Пирсона ra + 1).
Полученные результаты свидетельствуют о возможности применения сконструированной нами системы праймеров, методики подготовки образцов, параметров протокола экстракции ДНК в зависимости от клинического материала, а также протокола проведения реакции амплификации для детекции M. leprae методом ПЦР на 16S рРНК. Предложенная тест-система обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может использоваться как для диагностики активно протекающей лепрозной инфекции, так и для выявления асимптомно-го носительства возбудителя у клинически здоровых людей.
Обсуждение. Одним из наиболее перспективных направлений в изучении биологии M. leprae в последнее время является применение молекулярно-генетических методов. Эти методы помогают расшифровать генетические структуры M. leprae, охарактеризовать их место среди многочисленных видов микобактерий и выявлять возбудителя лепры в разных биологических образцах, т. е. имеют не только фундаментальное, но и прикладное значение.
На данный момент охарактеризованы и используются в качестве мишени различные специфические для M. leprae последовательности, позволяющие дифференци-роватьM. leprae от других видов. В то же время создание
высокоспецифичной и чувствительной тест-системы на основе ПЦР для идентификации возбудителя лепры, как и для идентификации любого возбудителя инфекционного заболевания, зависит от нескольких этапов.
Первый этап — экстракция ДНК. Основной задачей на этом этапе является получение максимального количества ДНК возбудителя в зависимости от биологического образца (соскобы со слизистой носа, скарификаты и биоптаты кожи, пробы сыворотки крови от больных лепрой и здоровых) с наименьшими экономическими затратами. На этом этапе нами были отработаны три метода экстракции ДНК как отечественного, так и зарубежного производства. Показано, что все методы экстракции ДНК имеют практически сопоставимую эффективность при выделении ДНК из биоптатов после их предварительного гомогенизирования. Для разработки скринингового теста идентификации возбудителя лепры особенно важным является использование образцов, полученных неинвазивным способом, таких как соскобы со слизистой поверхности носа. В этом случае наиболее информативными оказались метод выделения с использованием спиртовой преципитации нуклеиновых кислот («ПРОБА-НК» ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) и метод выделения с использованием сорбента («ПРОБА-ГС» ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). При экстракции ДНК из скарификатов кожи и соскобов с трофических язв эти методы также показали высокую чувствительность. Ограничением метода М3 является невозможность выделения ДНК из образцов крови и необходимость использовать для работы только наборы реагентов фирмы «Hain Lifescience» (Германия).
Второй этап — подбор специфических праймеров. Правильный выбор ДНК-мишени позволяет добиться высокой чувствительности и специфичности. При лепре для идентификации M. leprae методом ПЦР применялись различные праймеры, в частности, фланкирующие участки генов белков 18 кДА [11], 65 кДа[12], суперок-сиддисмутазы M. leprae [13].
Однако особое внимание уделяется праймерам, фланкирующим участок гена 16s рРНК, который является компонентом микобактериальных рибосом и экс-прессируется в большом количестве копий (от 103 до 104 на клетку). Бактериальный ген 16S рРНК содержит не только общие для всех бактерий последовательности, но и специфические для каждого вида [19], поэтому наиболее широко используется для идентификации бактерий. Исследования с использованием этого гена внесли большой вклад в открытие новых видов микобактерий и продолжают служить в качестве важного инструмента как альтернатива фенотипическим методам идентификации.
При выявлении M. leprae методом ПЦР с праймера-ми, фланкирующими участок гена 16S рРНК [20—24], было показано отсутствие перекрестной реакции мико-бактерий лепры со штаммами 22 других различных ми-кобактерий. M. De Wit и Р. Klaster [21] сообщали, что микобактерии лепры из различных источников имеют идентичные по 16S рРНК межгенные спейсерные области.
В настоящее время на смену визуальной оценке результатов ПЦР методом электрофореза и для снижения риска контаминации уверенно приходят флуоресцентные методы детекции продуктов амплификации. Одним из таких методов является метод ПЦР в реальном времени, который стал признанным стандартом при иссле-
довании ДНК и РНК. Поэтому в дальнейшем разработка метода детекции возбудителя лепры проводилась с использованием праймеров и зондов для регистрации результатов в режиме реального времени [14, 15].
Разработанная нами тест-система на основе амплификации участка гена 16S рРНК в режиме реального времени показала высокую специфичность и чувствительность, что позволит решить вопрос быстрой идентификации Mycobacterium leprae, она может быть использована в эпидемиологических исследованиях при изучении распространения возбудителя заболевания.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Hulse E.V. Leprosy and ancient Egypt. Lancet. 1972; 2: 1024—5.
2. Hansen G.A. Spedalshedens Arsager. Norsk Magazin for Laedevidenskaben. 1874; 4: 76—9.
3. Shinnick T.M., Good R.C. Mycobacterial taxonomy. Eur. J. Clin. Microb. 1990; 13(3): 884—901.
4. Shepard C.C. The experimental disease that follows the infection of human leprosy bacilli into footpads of mice. J. Exp. Med. 1960; 112: 445—54.
5. Shepard C.C., McRae D.H. A method for counting acid-fast bacteria. Int. J. Lepr. 1968; 36: 78—82.
6. Ridley D.S., Jopling W.H. Classification of leprosy according to immunity. A five-group system. Int. J. Lepr. 1966; 34: 255—73.
7. Domínguez J., Blanco S., Lacoma A., García-Sierra N., Prat C., Ausina V. Utility of molecular biology in the microbiological diagnosis of mycobacterial infections. Enferm. Infect. Microbiol. Clin. 2008; 26(9): 33—41.
8. Kirchheimer W.F., Sanchez R.M. Quantitative aspects of leprosy in armadillos. Lepr. India. 1977; 49: 48—53.
9. Scollard D.M., Adams L.B., Gillis T.P., Krahenbuhl J.L., Truman R.W., Williams D.L. The continuing challenges of leprosy. Clin. Microbiol. Rev. 2006; 19: 338—81.
10. World Health Organization. Global leprosy: situation 2016—2020. 2016: 1—20.
11. Lamb F.I., Singh N.B., Colston M.J. The specific of 18 kDa antigen of Mycobacterium leprae is present in Mycobacterium habana and functions as a heat-shock protein. J. Immunol. 1990; 144: 1922—5.
12. Shinnick T.M., Vodkin M.H., Williams J.C. The Mycobacterium tuberculosis 65-kilodalton antigen is a heat shock protein which corresponds to common antigen to the Escherichia coli GroEl protein. Infect. Immun. 1988; 56: 446—51.
microbiology
13. Mostafa H.M., Kazda M.V.D., Irgens L.M., Luesse H.G. Acid-fast bacilli from former leprosy regions in coastal Norway showing PCR positivity for Mycobacterium leprae. Int. J. Lepr. 1995; 63: 97—9.
14. Martinez N.A., Lahiri R., Pittman L.T., Scollard D., Truman R., Moraes M.O. et al. Determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 2009; 47: 2124—30.
15. Sharma R., Lavania M., Katoch K., Chauhan D.S., Gupta A.K., Gupta U.D. et al. Development and evalution of real-time RT-PCR asaay for quantitative estimation of viable mycobacterium leprae in clinical samples. Indian J. Lepr. 2008; 80: 315—21.
16. Santos A.R., Balassiano V., Oliveira M.L., Pereira M.A., Santos P.B., Degrave W.M. et al. Detection of Mycobacterium leprae DNA by polymerase chain reaction in the blood of individuals, eight years after completion of anti-leprosy therapy. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2001; 96: 1129—33.
17. Ebenezer G.J., Daniel S., Norman G., Daniel E., Job C.K. Are viable Mycobacterium leprae present in lepromatous patients after completion of 12 months and 24 months multi-drug therapy? Indian J. Lepr. 2004; 76(3): 199—206.
18. Martinez A.N., Ribeiro-Alves M., Sarno E.N., Moraes M.O., Ozcel M.A. Evaluation of qPCR-based assays for leprosy diagnosis directly in clinical specimens. PLoSNegl. Trop. Dis. 2011; 5: e1354.
19. Turrene C.Y., Tschetter L., Wolfe J., Kabani A. Necessity of Quality-controlled 16S rRNA gene sequence databases: identifying nontuberculousMycobacterium species. Clin. Microbiol. 2001; 39: 3637—48.
20. Cox R.A., Kempsell K., Fairclongh L., Corston M.S. The 16S ri-bosomal RNA of Mycobacterium leprae contains unique sequence, which can be used for identification by the polymerase chain reaction. J. Med. Microbiol. 1991; 35: 284—90.
21. De Wit M.Y.L., Klatser P.R. Mycobacterium leprae isolates from different sources have identical sequences of the spacer region between the 16S and 23S ribosomal RNA genes. Microbiology. 1994; 140: 1982—7.
22. Dobner P., Feldmann K., Rifai M., Löscher T. Rapid identification of mycobacterial species by PCR amplification of hypervariable 16S rRNA gene promoter regions. J. Clin. Microbiol. 1996; 34: 806—9.
23. Haile Y., Ryon J.J. Colorimetric microtitre plate hybridization assay for the detection of Mycobacterium leprae 16S rRNA in clinical specimens. Lepr. Rev. 2004; 75: 40—9.
24. Rampini S.K., Bloemberg G.V., Keller P.M., Büchler A.C., Dollen-maier G., Speck R.F. et al. Broad-range 16S rRNA gene polymerase chain reaction for diagnosis of culture-negative bacterial infections. J. Infect. Dis. 2011; 53: 1245—51.
Поступила 31.07.17 Принята к печати 01.08.17
