CC BY
76
Часы
—О— С. diphtheriae gravis tox+ № 665 (стекло) —□— С. diphtheriae gravis tox+ № 665 (пластик) —•— С. diphtheriae gravis tox+ циркулирующий (стекло) —■— С. diphtheriae gravis tox+ циркулирующий (пластик)
Рис. 2. Высеваемость биопленочной культуры штаммов С. diphtheriae gravis tox+ при культивировании в стеклянных и пластиковых пробирках.
штаммов уровень высеваемости колебался в пределах от 0,12 • 106 до 3,0 • 106 КОЕ/мл, тогда как в стеклянных пробир-кахрыл несколько выше (от 0,14 • 106 до 3,31 • 106 КОЕ/мл). Максимальных значений уровень высеваемости двух токси-генных штаммов С. diphtheriae при росте в пластиковых и в стеклянных пробирках достигал к 120-му часу.
У циркулирующего штамма возбудителя дифтерии по сравнению с музейным количество экзополисахарида, образуемого на 120-й час, было ниже (см. рис. 1), но при высеве из него (см. рис. 2) наблюдалось наибольшее количество клеток бактерий (3,31 • 106 КОЕ/мл). Для музейного штамма характерна обратная зависимость: высокое содержание экзополисахарида совпадало с низкой высеваемостью клеток бактерий (2,9 • 106 КОЕ/мл). Возможно, этот факт связан с более высокой способностью циркулирующего в популяции штамма возбудителя дифтерии адаптироваться к условиям окружающей среды.
Заключение. Возбудитель дифтерии обладает способностью к образованию биопленки, что повышает колонизацию этим
микроорганизмом эпителия верхних дыхательных путей и защиту возбудителя от воздействия факторов иммунной системы. Данные характеристики патогенных бактерий делают их более конкурентоспособными в борьбе за сайты адгезии при образовании биопленок на эпителии верхних дыхательных путей, способствуя формированию бактерионосительства. Выявленные различия в степени интенсивности образования биопленки циркулирующим в популяции и музейным штаммами С. diphtheriae gravis tox+ и жизнеспособности формирующих ее микроорганизмов связаны с их адаптационными возможностями.
ЛИТЕРАТУРА
1. Блажевич О. В. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития. Генетика. 2004; 40 (11): 1445-56.
2. Червинец Ю. В., Ботина С. Г., Глазова А. А., Коробан Н. В., Чер-винец В. М., Самоукина А. M. и др. Генетическая паспортизация и изучение способности к формированию биопленок лактоба-циллами, выделенными из полости рта здоровых людей. Клиническая лабораторная диагностика. 2011; 2: 44-6.
3. Costerton J. W., Stewart P. S., Greenberg E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 1999; 284: 1318-22.
4. Cook G., Costerton J. W., Darouiche R. O. Direct confocal microscopy studies of the bacterial colonization in vitro of a silver-coated heart valve sewing cuff. Int. J. Antimicrob. Agents. 2000; 13: 169-73.
5. DaveyM. E., O'Toole G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000; 64 (4): 847-67.
6. El-AziziM., Rao S., Kanchanapoom Т., KhardoriN. Molecular basis of bacterial adhesion. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 2005; 7; 29-41.
7. Froeliger E. H., Fives-Taylor P. Streptococcus parasanguis fimbria-associated adhesin fapl is required for biofilm formation. Infect. Immun. 2001; 69: 2512-9.
8. Gristina A. G., Dobbins J. J., Giammara В., Lewis J. C., DeVreies W. C. Biomaterial-centered sepsis and the total artificial heart. J.A.M.A. 1988; 259: 870-4.
9. Galazka A. Implications of the diphtheria epidemic in the Former Soviet Union for immunization programs. J. Infect. Dis. 2000; 181 (suppl. 1): 244-8.
10. Golaz A. Epidemic diphtheria in the Newly Independent States of the Former Soviet union: implications for diphtheria control in the United States. J. Infect. Dis. 2000; 181: 237-43.
Поступила 26.06.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 579.843.1:579.254].083.1
О. А. Рыковская, О. А. Шалу, E. В. монахова, Л. м. Смоликова, О. С. Чемисова, Е. Н. Голенищева, Е. м. Санамянц, Г. В. Гальцева, А. В. Алленов, Г. П. мурначев, Т. В. хоменко
разработка комплексного метода оценки вирулентности парагемолитических вибрионов
ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ФКУЗ Приморская противочумная станция Роспотребнадзора, Уссурийск, ФКУЗ Причерноморская противочумная станция Роспотребнадзора, Новороссийск, ФКУ3 Владивостокское противочумное отделение ФКУЗ Приморская противочумная станция Роспотребнадзора
Парагемолитические вибрионы, выделенные из разных источников, изучены по фено- и генотипическим признакам, ассоциированным с вирулентностью. Выявлено несовпадение в некоторых случаях результатов теста Канагава и ПЦР-тестирования гена tdh. Обоснована необходимость комплексной оценки вирулентности, включающей определение гемолитической активности в тесте Канагава, уреазной на среде Кристенсена и ПЦР-детекцию генов tdh и trh. Описан разработанный комплексный метод, определена формула патогенных штаммов, приведены 3 варианта вирулентных парагемолитических вибрионов. Предложены в качестве контрольных тест-штаммы Vibrio parahaemolyticus для фено- и генотипического тестирования штаммов по признакам вирулентности.
Ключевые слова: парагемолитические вибрионы, феномен Канагава, уреазная активность, гены термостабильного прямого гемолизина (TDH) и TDH-родственного гемолизина (TRH)
МИКРОБИОЛОГИЯ
O.A. Rykovskaya, O.A. Shalu, Ye.V. Monakyova, L.M. Smolikova, O.S. Tchemisova, Ye.N. Golenischtcheva, Ye.M. Sanamyantz,
G.V Galtseva, A.V. Allenov, G.P. Murnatchev, T.V. Khomenko THE DEVELOPMENT OF COMPLEX TECHNIQUE OF EVALUATION OF VIRULENCE OF
PARAHEMOLYTIC VIBRIO
The article deals with results ofstudying parahemolytic vibrio separatedfrom different sources according their phenotype and genotype attributes associated with virulence. In certain cases the mismatch of results of Kanagava tests and polymerase chain reaction test of gene tdh was established. The need in virulence complex evaluation is substantiated. This complex has to include detection of hemolytic activity in Kanagava test and urease activity on the Kri.sten.sen medium and polymerase chain reaction detection of genes tdh and trh. The developed complex technique is described. The formula of pathogenic strains is established. Three alternatives of virulent parahemolytic vibrio are given. The test-strains Vibrio parahaemolyticus are proposed as control in testing phenotype and genotype strains according virulence signs.
Key words: parahemolytic vibrio, Kaganava phenomenon, urease activity, genes of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH)
Парагемолитические вибрионы - условно-патогенные га-лофильные микроорганизмы, обитающие в соленых водоемах. Их выделяют из воды, креветок, мидий, устриц, омаров, крабов, различных видов рыб. Употребление человеком в пищу морепродуктов, контаминированных этими микроорганизмами, ведет к возникновению острого кишечного заболевания, протекающего по типу пищевой токсикоинфекции в виде спорадических случаев или эпидемических вспышек [2, 5, 6, 8, 9].
Опасность заражения парагемолитическими вибрионами существует везде, где население использует в питании продукты моря.
В нашей стране требования к качеству рыбы, нерыбных объектов промысла и продуктов, вырабатываемых из них, определены СанПиНом 2.3.2.1078-01 [4]. В соответствии с ними одним из микробиологических показателей оценки безопасности морепродуктов является Vibrio parahaemolyticus. Исследование пищевых продуктов на присутствие парагемолитических вибрионов проводят в порядке текущего надзора на этапах производства и реализации, а также по эпидемиологическим показаниям. В случае выделения парагемолитических вибрионов особую важность приобретает оценка их патогенного потенциала. Полученные при этом результаты определяют дальнейшие мероприятия по обеспечению безопасности пищевых продуктов.
В действующих методических документах [1, 3] предусмотрено определение патогенности парагемолитических вибрионов по способности продуцировать термостабильный прямой гемолизин (TDH-thermostable direct hemolysin) на среде Вагатцума. Однако этот тест, известный как феномен Канагава, нередко дает нестабильные и нечеткие результаты и, кроме того, не позволяет выявить второй основной фактор патогенности - TDH-родственный гемолизин (TDH-related hemolysin), обозначаемый как TRH. В последние годы зарубежными исследователями для достоверной оценки вирулентности Vibrio parahaemolyticus используется метод выявления генов этих токсинов (соответственно tdh и trh) с помощью ПЦР, который до начала наших исследований практически не применялся для характеристики штаммов, циркулирующих на территории Российской Федерации.
Целью работы явилось усовершенствование тестирования парагемолитических вибрионов по признакам вирулентности.
Материалы и методы. В работе использовано 250 штаммов Vibrio parahaemolyticus, выделенных в регионах Черного, Азовского, Каспийского и Японских морей из клинического материала и из объектов окружающей среды с 1972 по 2010 г. Все штаммы хранились в лиофилизированном состоянии в коллекции Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института.
Для корреспонденции:
Рыковская Оксана Алексеевна, мл. науч. сотр. Музея живых культур Адрес: 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40 Телефон: (863)240-27-03 E-mail: [email protected]
Гемолитическую активность вибрионов изучали на среде Вагатцума, уреазную - регистрировали на среде Кристенсе-на [1]. Наличие генов tdh и trh определяли в ПЦР со специфическими праймерами (см. таблицу). Синтез праймеров выполнен ООО НПФ «Литех» (Москва). В качестве ДНК-матриц использовали супернатанты 1 млрд взвесей суточных агаровых культур, прогретых при 100oC в течение 30 мин. Амплификацию проводили на программируемом термостате Терцик («ДНК-Технология», Москва).
Результаты и обсуждение. На первом этапе исследования проведен сравнительный анализ парагемолитических вибрионов по фено- и генотипическим признакам, ассоциированным с вирулентностью. Определены способность штаммов продуцировать TDH в тесте Канагава, их уреазная активность и наличие структурных генов гемолизинов tdh и trh с помощью ПЦР.
Подавляющее большинство tdh+^таммов были Канагава-позитивны. Исключение составляли 4 клинических штамма, у которых ген tdh не экспрессировался либо экспрессировался слабо и непостоянно. Слабая гемолитическая активность в тесте Канагава отмечена у пяти уреа-зопозитивных штаммов, выделенных от больных и носителей. Они отличались одновременным присутствием генов tdh и trh. Эти результаты совпали с данными японских исследователей, которые показали, что при наличии обоих генов продукция TDH снижается или отсутствует [10]. Все уреазопозитивные штаммы содержали ген trh, детерминирующий синтез TRH. Этот факт объясняется близостью расположения генов кластера уреазы и trh на малой хромосоме [13]. Полученные результаты подтверждаю данные литературы о том, что наличие уреазной активности может служить маркером для идентификации й^+-штаммов Vibrio parahaemolyticus. Сравнительный анализ фено- и геноти-пических свойств позволил установить, что результаты ПЦР-детекции гена tdh не всегда совпадают с наличием/ отсутствием гемолитической активности на среде Вагат-цума. Отмеченные расхождения свидетельствуют о необходимости использования феномена Канагава в сочетании с ПЦР-анализом. В связи с этим разработан комплексный метод оценки вирулентности парагемолитических вибрионов, который включает определение гемолитической активности в тесте Канагава, уреазной - на среде Кристенсена и ПЦР-детекцию генов tdh и trh.
Праймеры, используемые в работе [7]
Ген Последовательность праймеров Длина амплифи-ката, п.н.
tdh CCACTACCACTCTCATATGC
GGTACTAAATGGCTGACATC 251
trh TTGGCTTCGATATTTTC AGTACTC
cATAAcAAAcATATGcccATTTccG 585
Гемолитическая активность парагемолитических вибрионов на среде Вагатцума.
А - зона четкого лизиса, размером 3 мм и более; В - зона менее 3 мм; С - отсутствие лизиса.
По результатам феномена Канагава парагемолитические вибрионы делят на КР-позитивные (вирулентные), образующие зону р-гемолиза на кровяном агаре, и КР-негативные (авиру-лентные), не лизирующие эритроциты [11, 12]. Тест ставится на специальной среде Вагатцума, в состав которой входят: пептон ферментативный - 1,0 г, дрожжевой экстракт сухой - 0,3 г, натрия хлорид - 7,0 г, калий двузамещенный фосфорнокислый - 0,5 г, агар микробиологический - 13,0 г, дистиллированная вода - 100,0 мл. Все компоненты растворяют при нагревании (но не стерилизуют), добавляют 1 г маннита, 0,1% спиртового раствора кристаллвиолета. В охлажденный до 50oc агар вносят 2% свежеприготовленных эритроцитов человека, для чего кровь с добавлением цитрата натрия центрифугируют и осадок эритроцитов трижды отмывают физиологическим раствором.
На агар Вагатцума наносят по капле суточной бульонной культуры исследуемого и контрольных штаммов.
Результаты учитывают через 24-48 ч инкубации при температуре 37±0,5oC по величине и характеру зоны гемолиза (см. рисунок).
За положительный результат принимают зону четкого лизиса, размером 3 мм и более (см. рисунок, А). При зоне менее 3 мм результат оценивают как слабоположительный. К этой группе относят также штаммы с неполным гемолизом, который в различных повторностях может варьировать по интенсивности и величине зоны просветления (см. рисунок, В). При отсутствии лизиса штаммы считают Канагава-негативными (см. рисунок, С).
К группе со слабовыраженной гемолитической активностью относятся штаммы с низким уровнем экспрессии гена tdh, что отмечено у вибрионов, имеющих одну копию этого гена [11, 12], и у штаммов, содержащих одновременно гены tdh и trh [10].
Другим фенотипическим признаком вирулентности пара-гемолитических вибрионов является уреазная активность.
Наличие уреазной активности служит косвенным признаком присутствия одного из ключевых факторов патогенности Vibrio parahaemolyticus - гена trh.
Из всех сред, рекомендуемых для определения уреазной активности, наиболее четкие и воспроизводимые результаты получены на среде Кристенсена.
Для постановки теста суточную агаровую культуру высевают петлей на скошенную поверхность среды Кристенсена. Результат как положительный учитывают через 24-48 ч инкубации при 370С при окрашивании среды в малиновый цвет.
Генотипическая характеристика вирулентности включает ПЦР-детекцию генов tdh и trh. В качестве контрольных (позитивного и негативного) штаммов рекомендованы Vibrio parahaemolyticus КМ-204, содержащий tdh- n trh-гены и Vibrio parahaemolyticus КМ-215, лишенный этих детерминантов.
Для постановки ПЦР суточные агаровые культуры суспендируют в дистиллированной воде до 1 • 109 микробных клеток в 1 мл и обеззараживают прогреванием при 1000С в течение 30 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 5 мин и используют прозрачные су-пернатанты в качестве ДНК-матриц.
Реакцию проводят отдельно для каждого гена в 10 мкл смеси следующего состава: 10х буфер для амплификации (коммерческий) - 1 мкл; 2,5 мМ раствора смеси дезоксину-клеотидтрифосфатов (dNTR) - 1 мкл; 2,5 мМ раствора смеси прямого и обратного праймеров (см. таблицу) - 1 мкл; ДНК-матрица - 1 мкл; TAQ-полимераза (5 ед/мкл) - 0,1 мкл; деио-низированная вода - 6,9 мкл.
Амплификацию проводят на программируемом термоци-клере при следующем режиме:
I. Предварительная денатурация - 940С, 3 мин.
II. Денатурация - 940С, 20 с;
отжиг - 550С, 20 с;
синтез - 720С, 20 с, всего 30 циклов.
III. Досинтез - 720С, 3 мин.
По окончании реакции смеси разделяют электрофо-ретически в 2% агарозном геле, приготовленном на трис-ацетатном либо трис-боратном буфере, окрашивают бромистым этидием и визуализируют в УФ-свете. Результаты реакции учитывают по наличию/отсутствию амплификатов длиной 251 п.н. для гена tdh и 485 п.н. для trh. Амплифи-каты исследуемых штаммов также сравнивают с таковыми контрольного штамма.
Наличие амплификатов указанных выше размеров, в точности соответствующих по электрофоретической подвижности таковым контрольного штамма, содержащего гены tdh и trh, свидетельствует о присутствии в геноме испытуемого штамма искомых генов (см. таблицу).
Комплексная оценка вирулентности парагемолитических вибрионов позволяет определить формулу патогенных штаммов, которая включает гемолитическую активность в тесте Канагава (КР), уреазную активность (Ure) и потенциальную способность вибрионов к продукции гемолизинов (наличие генов tdh и trh).
Возможны 3 варианта вирулентных парагемолитических вибрионов: 1. tdh+ trh- КР+(-) Ure-; 2. tdh- trh+ KP- Ure+; 3. tdh+ trh+ KP-(+' Ure+. В скобках приведены редко встречающиеся штаммы.
Вибрионы первого варианта выделяют преимущественно от больных людей, и ими, как правило, обусловлены эпидемические вспышки. Эти штаммы за редким исключением Канагава-позитивные.
Вибрионы второго типа - немногочисленная группа. Их обнаруживают у больных при спорадических случаях и сравнительно редко при вспышках. Штаммы этой группы Канагава-негативны.
Штаммы третьего типа - редко встречающаяся группа, их выделяют преимущественно от больных при спорадических случаях. Гемолитическая активность на среде Вагатцума у вибрионов этой группы слабовыражена или отсутствует.
Штаммы четвертого варианта - tdh- trh- KP- Ure- принято считать авирулентными.
С целью стандартизации описанных методов в качестве контрольных предложены следующие тест-штаммы параге-молитических вибрионов:
Vibrio parahaemolyticus KM-87, серогруппа 05:К15, Канагава-позитивный, tdh+-trh--штамм. Используется при оценке гемолитической активности парагемолитических вибрионов по способности лизировать эритроциты человека на среде Ва-гатцума.
ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ СЛУЖБЫ
Vibrio parahaemolyticus КМ-186, серогруппа 01:К25, tdh-trh+-тест-штамм (позитивный контроль) для оценки уреазной активности. Вибрионы этого штамма обладают выраженной и стабильно проявляемой уреазной активностью.
Vibrio parahaemolyticus КМ-204, серогруппа 06:К18, содержит гены термостабильного прямого гемолизина (tdh) и TDH-подобного гемолизина (trh). Штамм рекомендован в качестве контрольного для ПЦР-тестирования парагемолитических вибрионов на присутствие генов вирулентности tdh и trh.
Vibrio parahaemolyticus КМ-215 - Канагава-негативный, не продуцирующий уреазу, не содержащий гены tdh и trh. Используют в качестве негативного контроля при оценке гемолитической, уреазной активности, а также при ПЦР-тестировании генов tdh и trh.
Заключение. Оптимизированы условия постановки тестов, подобраны праймеры для детекции tdh- и trh-генов, определена формула вирулентных парагемолитических вибрионов, предложены контрольные тест-штаммы.
Разработанный комплексный метод позволяет достоверно определить степень опасности штаммов Vibrio parahaemolyticus. При этом по результатам ПЦР оценивается потенциальная способность вибрионов к продукции гемолизинов, а тест Канагава является достаточно информативным методом определения их реальной опасности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых парагемо-
литическими и другими патогенными для человека вибрионами:
Метод. указания. МУК 4.2.1793-03. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2004. - С. 28.
2. МасловД.В. // Здоровье населения и среда обитания. - 1997. - N° 12 (57). - С. 17-18.
3. Методы выявления и определения парагемолитических вибрионов в рыбе, нерыбных объектах промысла, продуктах, вырабатываемых из них, воде поверхностных водоемов и других объектах: Метод. указания. МУК 4.2.2046-06. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2006.
4. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы. Сан ПиН 2.3.2.1078-01. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. - М.: Минздрав России, 2001. - С. 23.
5. Смоликова Л. М., Ломов Ю. М., Хоменко Т. В. и др. // Журн. ми-кробиол. - 1998. - № 6. - С. 3-7.
6. Шалу О. А., Непомнящая Н. Б., Монахова Е. В. и др. // Материалы проблемной комиссии научн. совета по сан.-эпид. охране территории Российской Федерации. - Ростов н/Д. - 2010. - Вып. 23. - С. 99-105.
7. HayashiS., OkuraМ., OsawaR. // Appl. Environ. Microbiol. - 2006.
- Vol. 72, N 7. - Р. 4576-4582.
8. Meador С. E., Parsons M. M., Ворр C. A. // J. Clin. Microbiol. -2007. - Vol. 45, N 4. - Р. 1133-1139.
9. Nair G. В., Ramamurthy Т., Bhattacharya S. K. et al. // Clin. Microbiol. Rev. - 2007. - Vol. 20, N 1. - Р. 39-48.
10. Nakaguchi Y., Okuda J., Iida T. et al. // Micribiol. Immunol. - 2003.
- Vol. 47, N 3. - Р. 233-239.
11. Nitshibuchi M., Kaper J.B. // Infect. and Immun. - 1995. - Vol. 63. -p. 2093-2099.
12. Okuda J., Nitsibushi M. // Mol. Microbiol. - 1998. - Vol. 30, N 3. - Р. 499-511.
13. ParkK.-S., Iida Т., Yamaichi Y. et al. // Infect. and Immun. - 2000. -Vol. 68, N 10. - Р. 5742-5748.
Поступила 11.03.12
организация лабораторной службы
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 615.471.03:616-074/-078:061.6
А. В. Эмануэль1, В. И. Суворов2, О. В. Евсеенко3
метрологическое обеспечение деятельности медицинской лаборатории
Лаборатория физико-химических измерений ФГУП BHИИM им. Д. И. менделеева; 2Научно-методический центр минздравсоцразвития России по молекулярной медицине ГБОУ ВПО СПбГмУ им. акад. И. П. Павлова; 3Государственное казенное учреждение здравоохранения «Центр крови Ленинградской области»
Обсуждаются методологические подходы к выполнению требований ФЗ-102 «Об обеспечении единства измерений» в области лабораторной медицины с позиций ГОСТР ИСО 9001-2008 «Системы менеджмента качества. Требования», а также ГОСТР ИСО 15189-2009 «Лаборатории медицинские. Частные требования к качеству и компетентности». Введение ГОСТ Р ИСО 18113.1-5 «Изделия медицинские для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем (маркировка)», четко распределяет ответственность по обеспечению метрологической корректности лабораторных измерений.
Ключевые слова: метрология, лабораторные измерения
A.V. Emanuel, V.I. Suvorov, O.V. Yevseyenko,
THE METROLOGICAL SUPPORT OF MEDICAL LABORATORY ACTIVITY
The article discusses the methodological approaches in implementing of regulations of the Federal law FZ-102 "On the .support of unity ofmeasurements in the area of laboratory medicine" from the positions ofGOST К ISO 9001-2008 '"The systems of quality management. Requirements" and GOST К ISO 15189-2009 "medical laboratories. The particular requirements to quality and competence". The application of GOST К ISO 18113.1-5 "The medicine items for diagnostic in vitro. Information provided by manufacturer (marking)" neatly assigns the responsibility for support of metrological correctness of laboratory measurements.
Key words: metrology, laboratory measurements
