CC BY
53
DOI: 10.21055/0370-1069-2018-3-60-65
УДК 616.98:579.841.11
А.А. кытманов, Г.д. Елагин, Г.В. куклина, д.В. Печенкин, о.о. фоменков, А.В. Еремкин,
с.с. ипатов, Э.р. Зиганшин
разработка иммуноферментных моноклональных тест-систем для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза
Филиал ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны, Киров, Российская Федерация
цель. Создание лабораторных образцов иммуноферментных моноклональных тест-систем для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза. материалы и методы. В работе использованы микробные культуры и гибридные клеточные линии, полученные из Государственной коллекции микроорганизмов филиала ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России (г. Киров). Клетки гибридом культивировали в перитонеальной полости мышей линии BALB/с. Препараты сапных и мелиоидозных моноклональных антител выделяли из асцитных жидкостей осаждением сульфатом аммония и очисткой ионообменной хроматографией. специфические компоненты создаваемых тест-систем подвергали сублимационному высушиванию в соответствующих защитных средах. Исследование диагностических свойств разработанных тест-систем проводили методом непрямого твердофазного иммунофер-ментного анализа. результаты и обсуждение. В результате работы получены препараты моноклональных антител in vivo, а также выделены и очищены иммуноглобулины из асцитных жидкостей. Подобраны пары моноклональных антител для изготовления специфических компонентов. Изготовлены лабораторно-экспериментальные серии иммуноферментных моноклональных тест-систем, позволяющие специфически выявлять возбудителей сапа и мелиоидоза в концентрации 0,5 106 м.к./мл и более. Показано отсутствие перекрестных реакций с близкородственными сапрофитами и гетерологичными микроорганизмами в концетрации 1,0 108 м.к./мл. Показана принципиальная возможность проведения дифференциации Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei методом иммуноферментного анализа. Тест-системы перспективны для последующей регистрации в качестве медицинских изделий для диагностики in vitro.
Ключевые слова: сап, мелиоидоз, моноклональные антитела, иммуноферментный анализ.
Корреспондирующий автор: Кытманов Алексей Александрович, e-mail: [email protected].
Для цитирования: Кытманов А.А., Елагин ПД., Куклина ПВ., Печенкин Д.В., Фоменков О.О., Еремкин А.В., Ипатов С.С., Зиганшин Э.Р Разработка иммуноферментных моноклональных тест-систем для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза. Проблемы особо опасных инфекций. 2018; 3:60-65. DOI: 10.21055/0370-1069-2018-3-60-65
А.А. Kytmanov, G.D. Elagin, G.V. Kuklina, D.V. Pechenkin, O.O. Fomenkov, A.V. Eremkin, S.S. Ipatov, E.R. Ziganshin
Development of Immuno-Enzymatic Monoclonal Tests-Systems for the Detection of Glanders and Melioidosis Agents
Affiliated Branch of the Federal State Budgetary Institution «48th Central Research Institute» of the Ministry ofDefense of the Russian Federation, Kirov, Russian Federation
Abstract. Objective of the study was the development of immune-enzymatic monoclonal test-kit for detecting glanders and melioidosis agents. Materials and methods. We used microbial cultures and hybrid cell lines obtained from the collection of the «48th Central Research Institute» of the Ministry of Defense of the Russian Federation. Hybridoma cells were incubated in the peritoneal cavity of BALB/c mice. Preparations of glanders and melioidosis monoclonal antibodies were isolated from the ascetic fluids through precipitation with ammonium sulfate and purification by means of ion-exchange chromatography. Specific components of the test-kits were subjected to freeze drying in corresponding protective media. Study of diagnostic properties of the developed test systems was performed using ELISA. Results and conclusions. We have obtained preparations of monoclonal antibodies in vivo, as well as isolated and purified immunoglobulins from ascetic fluids. We also selected the pairs of monoclonal antibodies for manufacturing specific components. Experimental series of immune-enzymatic monoclonal test-systems allowing for specific detection of glanders and melioidosis causative agents in concentrations ranging from 0.5 106 CFU/ml and higher were made. The absence of cross-reactivity with closely related saprophytes and heterologous microorganisms in concentrations of 1,0108 CFU/ml was shown. Demonstrated was the possibility in principle to differentiate between Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei using ELISA. Test systems are promising for follow up state registration as medical products for in vitro diagnostics.
Keywords: glanders, melioidosis, monoclonal antibodies, ELISA.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Corresponding author: Alexey A. Kytmanov, e-mail: [email protected].
Citation: Kytmanov А.А., Elagin G.D., Kuklina G.V., Pechenkin D.V., Fomenkov O.O., Eremkin A.V., Ipatov S.S., Ziganshin E.R. Development of Immuno-Enzymatic Monoclonal Tests-Systems for the Detection of Glanders and Melioidosis Agents. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2018; 3:60-65. (In Russian). DOI: 10.21055/0370-1069-2018-3-60-65
Received 06.06.18. Revised 18.06.18. Accepted 16.08.18.
Среди представителей рода Burkholderia особое место занимают B. mallei и B. pseudomallei, которые относятся к микроорганизмам второй группы пато-генности (опасности), а вызываемые ими заболевания признаны самостоятельными нозологическими единицами.
В России последние вспышки сапа зарегистрированы в период Второй мировой войны. На территории ссср данная болезнь считалась полностью ликвидированной. Однако в 1985 г. сотрудниками Волгоградского научно-исследовательского противочумного института в г. Улан-Удэ Бурятской АССР выделили возбудитель сапа от ввезенной из Монголии лошади. В настоящее время эндемичными по этому заболеванию являются страны Ближнего Востока, Африки и Латинской Америки, а также Индия, Китай, Монголия, Филиппины и Северная Австралия [6].
Мелиоидоз впервые описан в 1911 г. A. Whitmore и его ассистентом C.S. Krishnaswami как подобное сапу заболевание («glanders-like») В Таиланде и Северной Австралии первые случаи мелиоидоза диагностированы в 1947 и 1950 гг. соответственно. В настоящее время в этих странах отмечаются самые высокие показатели заболеваемости, а эти два региона являются гиперэндемичными по мелиоидозу [5].
Актуальность создания эффективных средств диагностики заболеваний сапом и мелиоидозом определяется угрозой их занесения на территорию России из эндемичных стран в связи со значительным ростом транспортных связей, а также возросшими грузо- и пассажиропотоками.
иммунологические методы исследования, в силу своей высокой чувствительности и специфичности, относительной методической простоты и невысокой себестоимости, являются эффективным способом решения задач индикации и идентификации патогенных микроорганизмов.
Современные подходы к разработке и совершенствованию иммунодиагностических средств детекции патогенов методом твердофазного иммунофер-ментного анализа (тиФА) базируются на широком использовании моноклональных антител (МкАт) заданной специфичности.
Возможность применения МкАт для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза и их дифференциации от близкородственных видов буркхольде-рий показана отечественными учеными [2, 3, 4].
В Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте в 1996-1998 гг. на основе МкАт разработана и апробирована экспериментальная иммуноферментная тест-система для выявления гликопротеина (АГ8) в составе капсульной субстанции B. pseudomallei. С помощью этой тест-системы подтверждена гетерогенность штаммов В. pseudomallei по признаку экспрессии антигенных детерминант, в частности, по содержанию Аг8 в суточных культурах буркхольдерий [7]. В настоящее время это учреждение осуществляет коммерческую реализацию наборов реагентов для диагностики in
vitro, в том числе иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие мелиоидозные и сапные моноклональные для выявления соответствующих возбудителей в окружающей среде и биоматерале. За рубежом МКАТ к антигенам B. pseudomallei используют в ряде традиционных иммунодиагности-ческих тестов, которые применяются в эндемичных регионах распространения инфекции для идентификации выделяемых культур буркхольдерий и их дифференциации от других представителей рода [2]. В 2011 г. опубликованы данные, полученные специалистами нескольких организаций США при участии Института Патологий Вооруженных Сил США (Armed Forces Institute of Pathology), в которых описано изучение бактерицидной активности более 100 моноклональных антител в отношении патогенных буркольдерий [11].
Цель работы состояла в создании лабораторных образцов иммуноферментных моноклональных тест-систем для выявления возбудителей сапа и ме-лиоидоза.
Для достижения поставленной цели представлялось необходимым решить следующие задачи: наработать препараты специфических мелиоидозных и сапных моноклональных антител; выбрать пары МкАТ, обеспечивающие наименьшую минимально выявляемую концентрацию бактерий в иммунофер-ментном анализе; приготовить готовые к применению лабораторные серии иммуноферментных тест-систем и оценить их диагностические возможности.
Материалы и методы
препараты специфических моноклональных антител к антигенам возбудителя сапа получали, используя культуры гибридных клеточных линий 301E5F10, 258F12H11, 298С11Е11 и 292G4D4; к антигенам возбудителя мелиоидоза - 255A6F5, 255B6E1, 253B4D4, 283B5H2 и 298E9B4. Все гибридные клеточные линии получены в филиале ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» (г. Киров). Клетки гибридом вводили вну-трибрюшинно мышам линии BALB/с в дозах от 1 до 2 млн. Для поддержания роста гибридом за 10 дней до инокуляции культур гибридных клеток мышам-реципиентам в брюшную полость вводили по 0,3 мл минерального масла пристана (Sigma-Aldrich, США). Контроль приживления клеток осуществляли через 10 сут после введения. В случае развития у мышей выраженного асцита производили забор перитоне-ального экссудата.
Иммуноглобулины из асцитных жидкостей выделяли методом двукратного осаждения насыщенным раствором сульфата аммония с последующим диализом против 0,15 М натрия хлорида с добавлением 20 мМ фосфатного буферного раствора с рн 7,5, образовавшийся после диализа осадок удаляли центрифугированием. Раствор иммуноглобулинов фильтровали через шприцевую фильтрующую
насадку (MillexGP, Merck, Millipore, Германия) с диаметром пор 0,22 мкм. Окончательную очистку иммуноглобулинов осуществляли методом ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЭ-сефацелем (GE Healthcare, Швеция) [1].
Синтез конъюгатов иммуноглобулинов с перок-сидазой хрена (Sigma-Aldrich, США) осуществляли по методу P.K. Nakane и A.J. Kawaoi [8]. Рабочее разведение конъюгатов определяли методом «шахматного титрования» [1].
Постановку «сэндвич-варианта» ИФА выполняли в следующем порядке: сенсибилизация планшета (Nunc, Дания) препаратами МКАТ в 50 мМ карбонатно-бикарбонатном буферном растворе (КББ) в течение 1 ч при температуре 37 °С, трехкратная отмывка лунок фосфатно-солевым буферным раствором с добавлением 20 % Твина 20 (Sigma-Aldrich, США) (далее отмывка), инкубация взвеси микробных культур (исследуемые образцы) в течение 30 мин при температуре 37 °С, отмывка, инкубация иммуноферментного конъюгата в течение 30 мин при температуре 37 °С, отмывка, инкубация субстратно-индикаторной смеси на основе о-фенилендиамина (Sigma-Aldrich, США) в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре, остановка реакции 1 М раствором серной кислоты, определение оптической плотности при длине волны 492 нм (ОП492). Результаты принимали к учету в том случае, если фоновые значения иммуноферментных конъюгатов не превышали величину ОП492, равную 0,15. В лунках с исследуемыми образцами результат считали положительным при величине ОП492, равной 0,3 и более.
для приготовления готовых форм тест-систем специфические компоненты переводили в защитную среду высушивания до концентрации, в 11 раз превышающей рабочее разведение, фасовали в ампулы и лиофилизировали. Для иммуноферментного конъю-гата использовали защитную среду следующего состава: 5 % сахарозы, 10 мг/мл бычьего сывороточного альбумина в 0,5 М ТРИС-HQ с рН 7,4; в качестве среды высушивания для иммуноглобулинов применяли 5 % раствор сахарозы в 0,5 М КББ с рН 9,6. Лиофилизацию специфических компонентов проводили в установке для сублимационного высушивания «АЛСУ» (ООО ОКБ «Фармбиомаш», Россия).
Оценку минимальной выявляемой концентрации (чувствительности) и специфичности тест-систем в отношении близкородственных патогенных буркхольдерий проводили с использованием микробных культур B. mallei (штаммы Ц-5, 10230, 11) и B. pseudomallei (Dalat, Duc-V, С-141), для сапной и мелиоидозной тест-систем соответственно. Для оценки специфичности тест-систем в отношении близкородственных сапрофитов и гетероло-гичных микроорганизмов использовали культуры: Burkholderia cepacia (штаммы АТСС 25416, 8237, АВ-1934, 3181, р-5812); Pseudomonasputida (ВКМВ-901); Pseudomonas aeruginosa (PQO-1); Pseudomonas
fluorescens (А-4125); Bacillus anthracis (СТИ-1, Sterne-34F2, Ихтиман); Bacillus cereus (96); Bacillus megate-rium (654); Bacillus subtilis (36); Brucella abortus (544, 870, 19BA, Tulya, С-68); Brucella melitensis (145, 16M, 706, ЯГ-56); Brucella suis (1330); Escherichia mli (НВ101); Francisella tularensis (15 НИИЭГ, 503, 543, Schu); Legionella pneumophila (Philadelphia-1, Pontiak, Flint); Yersinia enterocolitica (124, 134, 383); Yersinia pestis (EV); Yersinia pseudotuberculosis (147, 326, 681); Vibrio cholerae (569-В). Приготовление микробных взвесей с заданной концентрацией проводили визуально с помощью стандартных образцов мутности (оСо 42-28-85, Россия).
Воспроизводимость результатов ИФА оценивали путем определения относительного значения вариации оптической плотности субстратно-индикаторной смеси. Расчет коэффициента вариации проводили по результатам изучения положительных и отрицательных контрольных проб для семи образцов каждой серии обеих тест-систем.
на этапах работы с животными исследования соответствовали международным этическим нормам, законодательству Российской Федерации и нормативным документам учреждения.
Результаты и обсуждение
Для выбора МКАТ, обеспечивающих специфическое выявление патогенных буркхольдерий и наиболее высокую чувствительность иммунофермент-ного анализа, исследованы различные комбинации антител, используемые для сенсибилизации планшетов и в составе конъюгата с пероксидазой хрена. В качестве контроля использовали смесь штаммов, взятых в равных соотношениях - B. mallei Ц-5, 10230, 11 и B. pseudomallei Dalat, Duc-V, С-141 для сапной и мелиоидозной тест-систем соответственно. Полученные результаты представлены в табл. 1 и 2.
В серии предварительных экспериментов установлено, что сапные иммуноглобулины гибридных клеточных линий 292G4D4 и 301E5F10, а также мелиоидозные иммуноглобулины, полученные от линий 283B5H2 и 298E9B4, при использованиии как в качестве сенситина, так и в составе конъюга-та, обладают низкой специфической активностью в отношении соответствующих возбудителей, поэтому данные моноклональные антитела исключены из дальнейших исследований.
Различные сочетания моноклональных антител гибридных клеточных линий, используемые в качестве сенситина и в составе иммунопероксидазного конъюгата, позволяют выявлять микробные клетки B. mallei в концентрациях от 0,25 106 м.к./мл до 16,0 106 м.к/мл. При этом наибольшую чувствительность анализа обеспечивали моноклональные антитела, продуцируемые гибридной клеточной линей 258F12H11 в составе как сенситина, так и иммуно-пероксидазного конъюгата. Антитела, продуцируемые указанной гибридомой, использованы для изго-
Таблица 1/ Table 1
Чувствительность иммуноферментного анализа при выявлении микробных клеток возбудителя сапа с использованием
различных комбинаций мкАТ
Sensitivity of enzyme immunoassay in glanders microbe cell detection using various combinations of monoclonal antibodies
Наименование МКАТ, используемых для сенсибилизации планшетов Минимальная выявляемая концентрация микробных клеток B. mallei c использованием иммунопероксидазного конъюгата на основе МКАТ гибридной клеточной линии ..., 106 м.к./мл
258F12H11 292G4D4 298С11Е11 301E5F10
258F12H11 0,25 16,0 0,5 8,0
292G4D4 16,0 16,0 16,0 8,0
298С11Е11 2,0 16,0 1,0 4,0
301E5F10 16,0 4,0 8,0 8,0
Примечание: результаты анализа являются полуколичественными
товления лабораторно-экспериментальных образцов иммуноферментной тест-системы.
Данные, представленные в табл. 2, свидетельствуют, что минимальная выявляемая концентрация B. pseudomallei у всех исследуемых пар иммуноглобулинов не превышала 8,0-106 м.к./мл. При этом максимальную чувствительность обеспечивало сочетание моноклональных антител гибридных клеточных линий 255A6F5 в составе сенситина и 255B6E1 в составе иммунопероксидазного конъюгата. МКАТ, продуцируемые перечисленными гибридомами, использованы для комплектации лабораторно-экспериментальных образцов иммуноферментной тест-системы.
По результатам исследований изготовлено по три лабораторно-экспериментальные серии иммуно-ферментных моноклональных тест-систем для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза.
комплектация разработанных тест-систем унифицирована в соответствии с аналогами, изготавливаемыми в филиале ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» (г. Киров). В их состав включены в готовом виде или в виде полуфабрикатов все иммунохимические реагенты, необходимые для постановки твердофазного иммуно-ферментного анализа в планшетах, за исключением дистиллированной воды. Тест-системы включали в себя следующие компоненты: иммуноглобулины (МКАТ) против антигенов сапного (мелиоидозного)
микроба; конъюгат иммунопероксидазный против антигенов сапного (мелиоидозного) микроба; взвесь убитой культуры сапного (мелиоидозного) микроба (положительный контрольный образец) с концентрацией 1 млрд м.к./мл; навеска солей для приготовления фосфатно-солевого буферного раствора; 20 % раствор твин-20; концентрат цитратно-перекисного раствора; навеска о-фенилендиамина; 1 М раствор серной кислоты; планшет полистироловый для постановки иммуноферментного анализа (96 лунок); инструкция по применению.
После приготовления готовых форм проведена оценка минимальной выявляемой концентрации микробных клеток, специфичности тест-систем в отношении близкородственных буркхольдерий, сапро-фитов и гетерологичных микроорганизмов, а также воспроизводимость результатов анализа. Результаты определения чувствительности тест-систем представлены в табл. 3.
Представленные в табл. 3 данные свидетельствуют о том, что изготовленные иммуноферментные тест-системы позволяют специфически выявлять возбудителей сапа и мелиоидоза в концентрациях 0,5 106 м.к./мл и выше, а также дифференцировать патогенные буркхольдерии представленных штаммов в концентрациях от 1,0 107 м.к./мл и ниже.
При оценке специфичности установлено, что обе тест-системы не давали ложно-положительных результатов при изучении культур близкородствен-
Таблица 2 / Table 2
Чувствительность иммуноферментного анализа при выявлении микробных клеток возбудителя мелиоидоза с использованием
различных комбинаций мкАТ
Sensitivity of enzyme immunoassay in melioidosis microbe cell detection using various combinations of monoclonal antibodies
Наименование МКАТ, используемых для сенсибилизации планшетов Минимальная выявляемая концентрация микробных клеток B. pseudomallei c использованием иммунопероксидазного конъюгата на основе МКАТ гибридной клеточной линии ..., 106 м.к./мл
255A6F5 255B6E1 253B4D4 283B5H2 298E9B4
255A6F5 1,0 0,5 1,0 2,0 8,0
255B6E1 1,0 2,0 2,0 4,0 8,0
253B4D4 1,0 1,0 2,0 4,0 8,0
283B5H2 8,0 8,0 4,0 4,0 4,0
298E9B4 8,0 8,0 1,0 8,0 4,0
Примечание: результаты анализа являются полуколичественными
Таблица 3 / Table 3
Чувствительность образцов лабораторно-экспериментальных серий иммуноферментных моноклональных тест-систем для выявления
возбудителей сапа и мелиоидоза
Sensitivity of samples of laboratory-experimental series of immune-enzymatic monoclonal test-systems for melioidosis
and glanders agents detection
Тест-система (№ серии) Минимальная выявляемая концентрация культуры...
B. mallei штамма..., -106 м.к./мл B. pseudomallei штамма ..., -106 м.к./мл
Ц-5 10230 11 Dalat Duc-V С-141
САП (0115) САП (0215) САП (0315) МЕЛИОИДОЗ (0115) МЕЛИОИДОЗ (0215) МЕЛИОИДОЗ (0315)
0,25 0,5 0,5 10,0 10,0 10,0
0,5 0,5 0,25 10,0 10,0 10,0
0,5 0,5 0,5 10,0 10,0 10,0
100,0 100,0 100,0 0,5 0,5 0,5
10,0 10,0 10,0 0,5 0,5 0,5
10,0 10,0 10,0 0,5 0,5 0,5
Примечание: результаты анализа являются полуколичественными.
ных сапрофитов и гетерологичных бактерий в концентрации 1,0108 м.к./мл и ниже.
По результатам изучения воспроизводимости установлено, что коэффициент вариации для положительных результатов составил 7,8 %, для отрицательных - менее 7 %.
Таким образом, в результате работы получены препараты моноклональных антител in vivo; из ас-цитных жидкостей выделены иммуноглобулины, которые фракционированы методом ионообменной хроматографии; подобраны пары моноклональных антител, обеспечивающие максимальный уровень чувствительности при использовании в составе им-муноферментного конъюгата и для сенсибилизации планшетов, перспективные для создания иммуноферментных тест-систем.
Изготовлены лабораторно-экспериментальные серии иммуноферментных моноклональных тест-систем для выявления возбудителей сапа и ме-лиоидоза, позволяющие специфически выявлять микробные клетки B. mallei и B. pseudomallei в концентрации 0,5-106 м.к./мл, которые не давали лож-ноположительных результатов при исследовании близкородственных сапрофитов и гетерологичных микроорганизмов в концентрации 1,0 108 м.к./мл.
Разработанные серии иммуноферментных тест-систем для выявления возбудителей сапа и мелиои-доза по детекционным характеристикам не уступают параметрам зарубежных иммунодиагностических тестов на основе моноклональных антител [9, 10].
Показана принципиальная возможность проведения дифференциации B. mallei и B. pseudomallei с помощью моноклональных антител 255A6F5, 255B6E1 и 258F12H11.
тест-системы перспективны для последующей регистрации в качестве медицинских изделий для диагностики in vitro.
Конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
Список литературы
1. Кэтти Д., редактор. Антитела. Методы. М.: Мир, 1991. Т. 1. 287 с.
2. Замарина Т.В., Храпова Н.П., Корсакова И.И., Пименова Е.В. Конструирование экспериментальной тест-системы имму-ноферментной на основе моноклональных антител к антигену 200 kDa возбудителя мелиоидоза. Вестник Волгоградского государственного медицинского университета.2014; 3:93-95.
3. Прохватилова Е.В., Храпова Н.П. О получении моноклональных люминесцирующих иммуноглобулинов для обнаружения возбудителя мелиоидоза. В кн.: Эколого-эпидемиологический надзор за природно-очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии. Астрахань; 1996. С. 147-8.
4. Прохватилова Е.В. О разработке новых иммунобиологических препаратов на основе моноклональных антител к Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei. Проблемы особо опасных инфекций. 2003; 2:153-8.
5. Cheng A.C., Currie B.J. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology and management. Clin. Microbiol. Rev. 2005; 18(2):383-416 DOI: 10.1128/CMR.18.2.383-416.2005.
6. Harvey S.P., Minter J.M. Ribotyping of Burkholderia mallei isolates. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005. 44(1):91-7. DOI: 10.1016/j.femsim.2004.12.002.
7. Khrapova N.P., Tikhonov N.G., Prokhvatilova Y.V. Detection of Glycoprotein of Burkholderia pseudomallei. Emerg. Infect. Dis. 1998; 4(2):336-7. DOI: 10.3201/eid0402.980229.
8. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugated J. Histochem. Cytochem.
91. DOI: 10.1177/22.12.1084.
9. Sudhir K. Dohre, Urmil Tuteja, Subodh Kumar Generation and Characterization of Monoclonal Antibodies Specific to Burkholderia mallei. Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci. 2016; 5(5):342-9. DOI: 10.20546/ijcmas.2016.505.035.
10. Woods K.L., Boutthasavong L., NicFhogartaigh C., Lee S.J., Davong V., AuCoin D.P., Dance D.A.B. Evaluation of a rapid diagnostic test for detection of Burkholderia pseudomallei in the Lao People's Democratic Republic. J. Clin. Microbiol. 2018; 56(7):e02002-17. DOI: 10.1128/jcm.02002-17.
11. Zhang S., Feng S.H., Li B., Kim H.Y., Rodriguez J., Tsai S, Lo S.C. In vitro and in vivo studies of monoclonal antibodies with prominent bactericidal activity against Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei. Clin. Vaccine Immunol. 2011; 18(5):825-34. DOI: 10.1128/CVI.00533-10.
References
1. Ketti D, editor [Antibodies. Methods. Volume 1]. Translated from English. Moscow: "Mir"; 1991. 287 p.
2. Zamarina T.V., Khrapova N.P., Korsakova I.I., Pimenova E.V. [Designing of experimental immune-enzymatic test-system on the basis of monoclonal antibodies to melioidosis agent antigen 200 kDa]. Vestnik Volgogradskogo Gosudarstvennogo Meditsinskogo Universiteta. (Bulletin of the Volgograd State Medical University). 2014; 3:93-5.
3. Prokhvatilova E.V, Khrapova N.P. [Concerning the obtain-ment of luminescent monoclonal immunoglobulins for the detection of melioidosis causative agent]. In: [Ecological-epidemiological sur-
veillance over natural focal infections in the Northern Caspian Sea region]. Astrakhan; 1996. P. 147-8.
4. Prokhvatilova E.V. [Concerning the development of new immune-biological preparations based on monoclonal antibodies to Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2003; 2:153-8.
5. Cheng A.C., Currie B.J. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology and management. Clin. Microbiol. Rev. 2005; 18(2):383-41o. DOI: 10.1128/CMR.18.2.383-416.2005.
6. Harvey S.P., Minter J.M. Ribotyping of Burkholderia mallei isolates. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005. 44(1):91-7. DOI: 10.1016/j.femsim.2004.12.002.
7. Khrapova N.P., Tikhonov N.G., Prokhvatilova Y.V. Detection of Glycoprotein of Burkholderia pseudomallei. Emerg. Infect. Dis. 1998; 4(2):336-7. DOI: 10.3201/eid0402.980229.
8. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugated J. Histochem. Cytochem.
91. DOI: 10.1177/22.12.1084.
9. Sudhir K. Dohre, Urmil Tuteja, Subodh Kumar Generation and Characterization of Monoclonal Antibodies Specific to Burkholderia mallei. Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci. 2016; 5(5):342-9. DOI: 10.20546/ijcmas.2016.505.035.
10. Woods K.L., Boutthasavong L., NicFhogartaigh C., Lee S.J., Davong V., AuCoin D.P., Dance D.A.B. Evaluation of a rapid diagnostic test for detection of Burkholderia pseudomallei in
the Lao People's Democratic Republic. J. Clin. Microbiol. 2018; 56(7):e02002-17. DOI: 10.1128/jcm.02002-17.
11. Zhang S., Feng S.H., Li B., Kim H.Y., Rodriguez J., Tsai S, Lo S.C. In vitro and in vivo studies of monoclonal antibodies with prominent bactericidal activity against Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei. Clin. Vaccine 34. DOI: 10.1128/CVI.00533-10.
Authors:
Kytmanov A.A., Elagin G.D., Kuklina G.V., PechenkinD.V., Fomenkov O.O., Eremkin A.V., Ipatov S.S., Ziganshin E.R. Affiliated Branch of the Federal State Budgetary Institution «48th Central Research Institute» of the Ministry of Defense of the Russian Federation. Kirov, Russian Federation. E-mail: [email protected].
об авторах:
Кытманов А.А., Елагин Г.Д., Куклина Г.В., Печенкин Д.В., Фоменков О.О., ЕремкинА.В., Ипатов С.С., Зиганшин Э.Р. Филиал ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны. Российская Федерация, Киров. E-mail: [email protected].
Поступила 06.06.18. Отправлена на доработку 18.06.18.
Принята к публ. 16.08.18.
