CC BY
137
Биомедицина • № 4, 2G1G, C. 56-60
е ПРАКТИКУМ
Разработка и валидация методики количественного определения эндогенного кортизола и 6-в-гидроксикортизола в моче с целью определения активности изофермента CYP 3A4
В.В.Смирнов1, А.Ю.Савченко2, Г.В.Раменская1
1 Первый МГМУ им. И.М.Сеченова, Москва
2 Институт клинической фармакологии НЦ ЭСМП Минздравсоцразвития, Москва Контактная информация: e-mail: [email protected]
Разработан чувствительный метод определения кортизола и 6-в-гидроксикортизола в моче с помощью жидко-жидкостной экстракции и жидкостной хроматографии с масс-детектором с целью определения активности изофермента CYP 3А4. Анализ проводили на приборе Agilent 1200 LC/MS. В результате были сделаны выводы о связи отношения этих гормонов с активностью CYP3A4.
Ключевые слова: CYP 3A4, кортизол, 6-в-гидроксикортизол, метаболизм, LC-MS.
Изофермент цитохрома Р450 (СУР) 3А4 участвует в метаболизме большого количества лекарственных средств (более 45% всех применяемых в настоящее время лекарственных средств) [1]. Он катализирует несинтетическую стадию биотрансформации. При этом под действием СУР3А4 лекарственные средства превращаются в более гидрофильные, чем нативные вещества, метаболиты, в результате чего скорость выведения почками данных соединений возрастает. В большинстве случаев, помимо увеличения скорости выведения, в процессе метаболизма так же теряется фармакологическая активность. Однако некоторые лекарственные вещества, так
называемые пролекарства, изначально практически не обладают фармакологической активностью, и только под влиянием СУР3А4 превращаются в активные метаболиты, которые и вызывают фармакологические эффекты. Кроме того, СУР3А4 участвует в биотрансформации не только введенных из вне лекарственных средств (ЛС), но и эндогенных соединений - таких, как стероидные гормоны, метаболиты витамина D и другие [2].
Некоторые вещества влияют на изофермент СУР3А4, ингибируя или индуцируя его активность. Индукция ведет к ускорению метаболизма ЛС и, как правило, к увеличению скорости выведения вещества и снижению его фармакологиче-
ской активности. Ингибирование же наоборот, снижает активность ферментов и повышает концентрацию ЛС в крови [1].
Определение активности изофермента CYP3A4 является важной задачей для рациональной фармакотерапии, особенно при одновременном назначении нескольких препаратов. Так, например, индукторы или ингибиторы изофермента CYP3A4 при совместном приеме с субстратом данного изофермента будут изменять фармакокинетические характеристики этого субстрата [3].
Принцип установления активности CYP3A4 в организме человека заключается в определении концентрации в крови или других биологических жидкостях метаболита, который образуется из какого-либо вещества исключительно под действием CYP3A4. Такие ЛС называют маркерными субстратами. В зависимости от субстрата методы определения активности изофермента CYP3A4 можно разделить на две группы: инвазивные и неинвазивные. В настоящее время для оценки активности CYP3A4 инвазивным методом в научных целях используется несколько маркерных субстратов: эритромицин, лидокаин, нифедипин, дап-сон и мидозалам [2].
В большинстве из этих тестов ЛС, являющееся маркерным субстратом, вводится перорально (при этом оценивается суммарная активность CYP3A4 как в ге-патоцитах, так и в энтероцитах) или внутривенно (при этом оценивается суммарная активность CYP3A4 исключительно в гепатоцитах); далее через определенное время в крови или сыворотке определяют концентрацию метаболита маркерного субстрата, а в некоторых случаях - и самого ЛС.
Инвазивные методы определения активности изофермента CYP3A4 име-
ют ряд неизбежных выраженных недостатков. В качестве примеров можно привести необходимость внутривенного введения препаратов, применение которых сопряжено с риском развития НЛР, прежде всего - аллергических реакций и аритмогенных эффектов; необходимость, как минимум, двукратного забора крови из вены; тестирование может проводиться только в условиях лечебно-профилактического учреждения. В некоторых случаях методы могут обладать недостаточной специфичностью. Например, в настоящее время известно, что MEGX может образовываться из лидокаина под влиянием не только CYP3A4, но и в незначительных количествах CYP1A2, а значит, данный тест отражает суммарную активность этих 2 изоферментов цитохрома Р450.
В связи с этим более перспективны, на наш взгляд, неинвазивные методы оценки активности CYP3A4. В таких случаях активность CYP3A4 определяют по концентрации в биологических жидкостях эндогенных метаболитов, которые образуются только под действием CYP3A4, что исключает необходимость введения какого-либо ЛС, а значит, делает метод на 100% безопасным для пациента.
В качестве такого неинвазивного субстрата предлагается кортизол (гидрокортизон) - стероидный гормон коры надпочечников.
Оценка активности CYP3A4 может проводиться по отношению концентрации 6-в-гидроксикортизола к концентрации кортизола (6^-гидроксикортизол/ кортизол). Это возможно потому, что 6-^-гидроксикортизол образуется из кортизола исключительно под действием CYP3A4. Так как и кортизол, и его метаболит выводятся почками, на анализ берут не плазму крови, а мочу, что
упрощает процедуру отбора биопробы. На анализ берут утреннюю мочу, так как концентрация кортикостероидов с утра самая высокая. Мочу собирают в пластмассовые пробирки, допускается замораживание мочи [4]. Ко всему прочему преимуществом теста является также возможность сбора биоматериала (мочи) в домашних условиях. Концентрации 6^-гидроксикортизола и кортизола в моче определяются методом жидкостной хроматографии, как наиболее чувствительном и селективном, и широко используемом для данных целей [5]. Низкие значения отношения 6-в-гидроксикортизол/кортизол соот-
ветствуют низкой активности CYP3A4, а высокие - высокой.
Экспериментальная часть
В качестве биообъекта собирали утреннюю мочу пациентов, находящихся на лечении препаратом, который ингибирует или индуцирует активность CYP3A4. Первый отбор образцов проводился до начала лечения, а затем через неделю, после начала приема препарата. Для анализа отбиралась моча у пациентов обоих полов. В качестве метода пробоподготовки была выбрана жидко-жидкостная экстракция. Экстрагентом являлась смесь этилацетат/изо-пропанол (85/15). К 2 мл мочи прибавляли 4 мл экстрагента. Встряхивали в течение 10 минут, для полноты экстракции. Затем центрифугировали в течение 5 минут при скорости 3000 об/мин. Органический слой отделяли. С водным слоем повторно проделывали ту же самую процедуру. После центрифугирования два органических слоя объединяли. В качестве очистки и для улучшения экстракции к объединенному органиче-
скому слою добавляли 2 мл 1М раствора NaOH, встряхивали в течение 10 минут, и потом центрифугировали 5 минут при скорости 3000 об/мин. Органический слой отделяли, а затем упаривали на вакуумно-выпарительном аппарате. Сухой остаток растворяли в 1 мл этилового спирта.
Хроматографическое определение кортизола и 6-^-гидроксикортизола в моче проводилось на приборе Agilent 1200 LC/MS. Объем вкола составлял 10 мкл. Состав подвижной фазы: 55% воды, подкисленной НСООН (1 мл муравьиной кислоты на 1 л воды) и 45 % ацетонитрила. Скорость потока подвижной фазы
- 0,5 мл/минуту. Колонка: обращенно-фазная Waters (5мкм; 4,6x150мм), температура колонки - 35°С. Длинна волны ультрафиолетового детектора - 246 нм. Масс-детектор работал в режиме сканирования в позитивной полярности. Тип ионизации: MM-ES + APCI.
В качестве метода количественного определения был выбран метод абсолютной калибровки. Для этого были приготовлены стандартные растворы кортизола и 6-в-гидроксикортизола в моче, из которой заранее были удалены эндогенные кортизол и 6-в-гидроксикортизол, методом жидко-жидкостной экстракции. Готовили серию из 6 калибровочных растворов. Использовали стандартные растворы кортизола и 6-^-гидроксикортизола с концентрацией 10 мкг/мл в спирте. Затем из этого раствора получали растворы данных веществ в моче, избавленной от эндогенных уровней этих соединений. Концентрации калибровочных растворов были следующие - 0,1 нг/мл, 1,0 нг/мл, 10,0 нг/мл, 25,0 нг/мл, 50,0 нг/ мл, 100,0 нг/мл. После хроматографирования всех этих растворов, строили калибровочный график, по которому впо-
следствии находили значения содержания кортизола и 6-в-гидроксикортизола в испытуемой моче.
Разработанная методика была вали-дирована по показателям линейности, специфичности, точности и воспроизводимости.
Диапазон линейности определения был доказан в диапазоне от 0,1 нг/мл до 100,0 нг/мл. Уравнение прямой имело вид, коэффициент корреляции R = 0,99982.
Специфичность метода. У пиков кортизола и 6-в-гидроксикортизола в определяемых образцах не имелось наслоений другими субстанциями. По времени удерживания пики из исследуемых образцов совпадали с пиками стандартного раствора.
Точность. Один и тот же образец с известной концентрацией кортизола и 6-^-гидроксикортизола анализировали 6 раз подряд. В одних и тех же условиях. Полученные результаты концентраций кортизола и 6-^-гидроксикортизола были близкими (коэффициент вариации ±1,07%).
Воспроизводимость. Образец подвергали повторным исследованиям в разные дни и разными специалистами. Проводили по три измерения. Полученные результаты были схожи друг с другом (коэффициент вариации 0,90568).
Пригодность хроматографической системы. Коэффициент разрешения пиков кортизола и 6-^-гидроксикортизола был равен 2,6; это говорит о полном их разделении. Фактор асимметрии пика кортизола 1,20, а 6-^-гидроксикортизола
- 1,15. Эффективность колонки для обоих веществ была выше 3000 теоретических тарелок, что говорит о высокой эффективности хроматографической системы.
Заключение
Полученные результаты показали ожидаемое изменение отношения кортизола и 6-^-гидроксикортизола в моче в течение периода времени, за который отбирались пробы. Полученные результаты были соотнесены с клиническими наблюдениями, на основании чего были сделаны соответствующие выводы об эффективности методики определения отношения кортизола и 6-^-гидроксикортизола в моче с целью определения активности изофермента CYP 3А4.
Выводы
Разработан чувствительный метод определения кортизола и 6-^-гидро-ксикортизола в моче с помощью жидкожидкостной экстракции и жидкостной хроматографии с масс-детектором. Проведена валидация данного метода. Метод обладает высокой чувствительностью и селективностью, благодаря сочетанию жидкостной хроматографии с УФ-детектором и масс-детектором.
Сделаны выводы о связи отношения этих гормонов с активностью CYP3A4 и возможностью использования его для оценки активности данного изофермента. Так как данный метод не требует введения в организм человека посторонних веществ, его можно применять для оценки активности метаболических ферментов даже у беременных и кормящих женщин, а так же у грудных детей.
Список литературы
1. Кукес В.Г. Биотрансформа-
ция лекарственных средств: клиникофармакологические аспекты.
М.:Рефарм. 2004. - 186 с.
2. Кукес В.Г., Сычев Д.А., Ших Е.В.
Изучение биотрансформации лекарственных средств - путь к повышению эффективности и безопасности фармакотерапии // Врач. - 2007. - № 1. - С. 6-8.
3. Раменская Г.В., Светый Л.И., Кулинченко А.С. Влияние флуконазо-ла на концентрацию блокаторов медленных кальциевых каналов в плазме крови // Клиническая фармакология и терапия.
- 2002. - № 5. - С. 54-56.
4. Сычев Д.А., Раменская Г.В., Игнатьев И.В. и др. Клиническая фармакогенетика. /Под редакцией В.Г.Кукеса, Н.П.Бочкова. М.: Гэотар-Медиа, 2007.
- 248 с.
5. Раменская Г.В. Хроматографическое определение лекарственных средств и их метаболитов для фенотипи-рования изоферментов цитохрома Р-450 // Химико-фармацевтический журнал: научно-технический и производственный журнал. - 2005. - Т. 39, № 2. - С. 53-56.
Development and validation quantity method for determination of endogenous cortisole and 6->-hydroxycortisole in human urine for activity determination of isoensim CYP 3A4
V.V.Smirnov , A.U.Savchenko, G.V.Ramenskaya
The sensitive method of definition cortisol and 6 P-hydroxycortisol in urine by liquid-liquid extraction and LC/MS has been developed. The analysis spent on Agilent 1200 LC/MS. As a result of the work the validate method of definition endogenous cortisol and 6 P-hydroxycortisol in urine has been developed. Conclusions are drawn on connection of the ratio of these hormones with CYP3A4 activity.
Keywords: CYP 3A4, cortisol, 6 P-hydroxycortisol, metabolism, LC-MS.
Биомедицина № 4, 2G1G
бо
