CC BY
203
Химия растительного сырья. 2012. №4. С. 147-152.
УДК 543.054:547.97
РАЗРАБОТКА ЭКСПРЕССНЫХ МЕТОДОВ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ЭКСТРАКЦИИ КАРОТИНОИДОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
© Н.В. Ульяновский1’2 , Д.С. Косяков1, К.Г. Боголицын1’2, А.Д. Ивахнов1, А.С. Амосова1
1 Северный (Арктический) федеральный университет им. М.В. Ломоносова, ул. Набережная СевернойДвины, 17, Архангельск, 163002 (Россия), e-mail: [email protected]
2Институт экологических проблем Севера УрО РАН, ул. Набережная Северной Двины, 23, Архангельск, 163002 (Россия)
Найдены оптимальные условия сверхкритической флюидной и ускоренной автоматической экстракции кароти-ноидов из растительного сырья с целью последующего хроматографического анализа, Проведено сравнение предложенных методов с экстракцией в аппарате Сокслета. Показано, что ускоренная автоматическая экстракция субкрити-ческим ацетоном является наиболее эффективным и экспрессным способом пробоподготовки для определения кароти-ноидов методом ВЭЖХ.
Ключевые слова: каротиноиды, ускоренная экстракция субкритическими растворителями, сверхкритическая флюидная экстракция, растительное сырье,
Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП НО «Арктика» Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ.
Каротиноиды представляют собой один из важнейших классов природных соединений, содержащихся в растительном сырье [1], и находят широкое применение в качестве природных пищевых красителей, кроме того, они играют важную провитаминную и антиокислительную роль, составляя неотъемлемую часть рациона питания. Теоретически Р-каротин обладает 100% провитаминной активностью (провитамин А), а а- и у- каротины проявляют 50% провитаминной активности. Антиоксидантная активность каротиноидов имеет исключительно большое значение, в том числе для снижения риска раковых заболеваний [2, 3]. Основными источниками каротиноидов являются фрукты и овощи. Особое положение среди них занимает морковь, являющаяся источником практически исключительно а-, Р- и у-каротина. По литературным данным [4], Р-каротин составляет большую часть каротиноидов моркови (60-80%), на долю а-каротина приходится
Введение
Ульяновский Николай Валерьевич - аспирант, e-mail: [email protected] Косяков Дмитрий Сергеевич - директор Центра коллективного пользования научным оборудованием «Арктика», кандидат химических наук, доцент, e-mail: [email protected]
Боголицын Константин Григорьевич - заведующий кафедрой теоретической и прикладной химии, доктор химических наук, профессор, e-mail: [email protected] Ивахнов АртемДмитриевич - научный сотрудник, кандидат химических наук, e-mail: [email protected] Амосова Анна Сергеевна - студентка, e-mail: [email protected]
10-40%, доля лютеина не превышает 1-5%.
В связи с этим особую актуальность приобретает разработка эффективных и экспрессных методов контроля содержания каротиноидов в сырье, основанных прежде всего на хроматографическом и хромато-масс-спектрометрическом анализе [5].
Экспрессность хроматографического определения каротиноидов определяется в первую очередь пробоподготовкой, заключающейся в экстракции растительного сырья различными растворителями. Классический метод, основанный на
* Автор, с которым следует вести переписку,
кипячении образца с петролейным эфиром или ацетоном или экстракции в аппарате Сокслета требует больших затрат времени [6]. Вследствие этого большой интерес представляет внедрение в аналитическую практику таких современных альтернативных методов экстракции, как сверхкритическая флюидная экстракция (SFE) и ускоренная экстракция органическими растворителями в субкритических условиях (ASE).
Цель настоящей работы - оценка применимости SFE и ASE для анализа каротиноидов растительного сырья, сопоставление указанных методов с экстракцией в аппарате Сокслета.
Экспериментальная часть
В качестве объекта исследования использовалась морковь сорта Шантанэ, выращенная в Архангельской области в 2010 г. Свежее тщательно вымытое и измельченное сырье было высушено при 40 °С до влажности 2,6%. Фракция 0,5-1 мм составляла 80% по весу. Образцы сохранялись в плотных полиэтиленовых пакетах в темноте при температуре 5 °С. Исходное сырьё содержало 461 мг/кг каротиноидов при содержании Р-каротина 80% от массы каротиноидов в ацетоновом экстракте [7].
Сверхкритическая флюидная экстракция выполнена с использованием установки СФЭ-400 (ИАнП РАН, Россия). Навеску сырья (1 г) помещали в экстракционную ячейку объемом 10 мл, которую заполняли диоксидом углерода при давлении 74 атм. Прогрев осуществляли в течение 10 мин, после чего прокачивали 50 мл сверхкритического (СК) С02 с заданной температурой, выпуская экстракт через кварцевый капилляр (диаметр 50 мкм) в приемный сосуд с ацетоном. В ходе экспериментов варьировали температуру (40, 60, 70, 80 °С) и давление (100-350 атм, шаг 50 атм.) в ходе экстракции [7].
Определение валового содержания каротиноидов в экстрактах, полученных способом SFE, проводили методом спектрофотометрии в видимой области спектра по поглощению при 450 нм. Расчет вели на содержание Р-каротина, используя коэффициент экстинкции, равный (AJcm1%) 2600 [8]. На основании анализа СК экстрактов определяли степень извлечения каротиноидов при экстракции.
Автоматическая ускоренная экстракция в субкритических условиях проводилась на установке ASE 350 (Dionex, США). В стальную ячейку объемом 10 мл помешалась навеска измельченного образца массой 1 г, смешанная с 1 г диатомитовой земли для увеличения степени проницаемости материала для экстрагента. Процесс осуществлялся при температурах 80, 100, 150 и 200 °С при постоянном давлении 100 атм. В качестве экстрагента был выбран ацетон как наиболее эффективный растворитель, широко используемый для извлечения каротиноидов и обеспечивающий, в отличие от неполярных жидкостей, возможность прямого ввода полученного экстракта в хроматографическую систему с обращенно-фазовым сорбентом. Параметры экстракции: нагрев ячейки в течение 5 мин, выдерживание образца при заданной температуре в течение 5 мин, промывка после выдерживания 10 мл ацетона. Полученный экстракт доводили ацетоном до объема 50 мл в мерной колбе.
Хроматографическое определение каротиноидов проводили с использованием ВЭЖХ системы Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, США) с диодноматричным спектрофотометрическим детектором методом обращено-фазовой хроматографии. Разделение осуществлялось на колонке LiChrospher PAH (Merck) 250*3 мм, 5 мкм, с полимерной привитой фазой С18, обеспечивающей специфическую селективность по отношению к каротиноидам. Объем инжекции составлял 10 мкл, скорость потока 0,5 мл/мин, температура 40 °С. Элюирование проводили в изократическом режиме, состав подвижной фазы: 83% ацетонитрила, 17% 50 мМ раствор ацетата аммония в изопропаноле. Детектирование велось при длине волны 450 нм, с непрерывной записью спектра в диапазоне 300-600 нм, с шагом 1 нм. Время анализа составляло 15 мин.
Результаты и их обсуждение
При проведении процесса SFE каротиноидов при температурах ниже 60 °С обнаружена крайне низкая экстракционная способность сверхкритического диоксида углерода по отношению к данным компонентам. Максимальная степень извлечения каротиноидов в ходе обработки при 40 °Си 350 атм составляла
0,002 от их содержания в исходном образце. Получаемый продукт по данным ВЭЖХ анализа на 85% состоял из Р-каротина. В связи с этим дальнейшие исследования проводили в диапазоне температур 6080 °С, верхний предел которого ограничен возможностями термостата экстрактора.
Важнейшим фактором, определяющим плотность и, как следствие, растворяющую способность сверхкритического флюида, является давление. В таблице 1 приведены данные по степени извлечения каротиноидов в диапазоне давлений от 100 до 350 атм.
Очевидно, что увеличение давления способствует увеличению эффективности экстракции каротиноидов из сырья. При этом наибольший эффект от прироста давления в системе наблюдается при температуре 80 °C, в то время как при меньших температурах повышение давления выше 250 атм не приводит к существенному росту количества извлекаемых каротиноидов.
Достижение степени извлечения более 35% возможно, по-видимому, при существенно более высоких температурах и давлениях, как правило не используемых в серийно выпускаемых аналитических экстракционных системах.
Это свидетельствует о недостаточной растворяющей способности сверхкритического диоксида углерода по отношению к каротиноидам без введения в систему сорастворителей либо возможности дегра-дации каротиноидов в среде сверхкритического флюида, и, как следствие, данный метод более применим к промышленным процессам, чем к аналитическим.
Введение в процесс SFE экстракции в оптимальных условиях сорастворителя (10% ацетона) позволило увеличить степень извлечения каротиноидов до 50-55%. Тем не менее, это повышение не позволяет использовать данный метод пробоподготовки в аналитических целях, несмотря на его экспрессность.
Хроматограммы экстрактов, полученных в аппарате Сокслета и в системе ASE (рис. 1 и 2), демонстрируют наличие трех основных пиков (I, II и III). Идентификация компонентного состава выполнена на основании анализа электронных спектров поглощения, полученных для каждого из пиков хроматограммы (рис. 3). Согласно литературным данным [9], основными каротиноидами моркови являются а-, Р- и у-каротины. Как следствие, идентификация компонентов экстракта сводилась к соотнесению спектров элюата и спектров чистых препаратов. В работе [10] приводятся данные о положении максимумов основных пиков различных каротиноидов и соотношении их высот. На этой основе пик II однозначно отнесен к Р-каротину, а пики I и III отнесены ка- и у-каротинам соответственно.
Таблица 1. Влияние условий экстракции сверхкритическим диоксидом углерода на степень извлечения каротиноидов моркови
Температура
Степень извлечения каротиноидов (%) при давлении, атм
экстракции, “С 100 150 200 250 300 350
60 0,5 9,8 16,2 18,5 19,2 20,0
70 1,6 7,3 19,7 22,7 22,3 21,9
80 2,3 8,4 17,8 22,4 31,6 34,8
Рис. 1. Хроматограмма экстракта каротиноидов моркови, полученного в аппарате Сокслета (I - а-каротин, II - Р-каротин, III - у-каротин)
Отличительной особенностью спектра хроматографического пика III является наличие полосы поглощения при 350 нм, что свидетельствует о присутствии, помимо у-каротина, цис-изомеров Р-каротина, образующихся вследствие термической изомеризации транс-формы [11]. Образование цис-изомеров приводит к значительному увеличению пика III (рис. 2) с ростом температуры и времени проведения экстракции. Протекание процессов термической деструкции сырья обусловливает также появление в хроматограммах интенсивных пиков полярных компонентов с временами удерживания до 4 мин, относящимся к продуктам карамелизации углеводов и не мешающим хроматографическому определению каротиноидов.
В таблице 2 представлены результаты экстракции методом ASE, при этом степень извлечения рассчитывалась как отношение площадей соответствующих пиков в хроматограммах ацетоновых экстрактов, полученных в системе ASE и в аппарате Сокслета.
Рис. 2. Хроматограммы Л8Б экстрактов каротиноидов моркови, полученных в различныхусловиях экстракции (1 - 100 °С, 2 - 150 °С, 3 - 200 °С, 4 - два цикла экстракции при 200 °С)
Длина волны, нм Длина волны, нм
Рис. 3. Электронные спектры поглощения в максимумах хроматографических пиков (а - а-каротин, б - Р-каротин, в - у-каротин)
Таблица 2. Степень извлечения каротиноидов из моркови методом Л8Б (по отношению к экстракции в аппарате Сокслета)
Каротиноид Температура экстракции, “С (количество циклов экстракции)
80 (1) 100 (1) 150 (1) 200 (1) 150 (2) 200 (2)
а- каротин 0,16 0,18 0,32 0,63 0,32 1,27
Р-каротин 0,16 0,19 0,29 0,49 0,29 0,84
у-каротин - 0,04 0,19 0,83 0,23 2,45
Анализ полученных данных показывает, что метод ускоренной экстракции субкритическим ацетоном является наиболее экспрессным и эффективным, обеспечивающим наиболее полное извлечение каротиноидов и превосходящим как классическую экстракцию, так и экстракцию сверхкритическим диоксидом углерода. Повышение температуры и количества циклов экстракции способствует увеличению степени извлечения каротиноидов, однако при температурах более 200 °С наблюдается существенное осмоление материала, что ограничивает возможность использования высоких температур. Максимально достигаемая степень извлечения а-каротина превышает единицу в условиях проведения двух циклов экстракции при 200 °С, что свидетельствует о преимуществе экстракции субкритическим ацетоном по сравнению со стандартным методом, при этом для Р-каротина этот показатель составляет 84%, что объясняется процессами изомеризации, приводящими также к кажущемуся завышению степени извлечения у-каротина. При условии стандартизации параметров экстракции данный эффект может быть учтен при количественных расчетах содержания каротиноидов в экстрактах. Таким образом, при анализе каротиноидов оптимальными условиями следует признать температуру 200 °С и общую продолжительность проведения процесса не менее 10 мин.
Выводы
1. Предложен эффективный способ эскпрессной экстракции каротинов с последующим анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
2. Проведено сравнение степени извлечения каротиноидов при классическом методе экстракции с методами SFE и ASE. Показано предпочтительное использование ASE для экстракции каротинов из растительного сырья с целью последующего хроматографического анализа.
Список литературы
1. New research on antioxidants. Ed. D. Marin, P. Garcia. New York, 2008. 300 p.
2. Block G., Patterson B., Subar A. Fruit, vegetables, and cancer prevention: A review of the epidemiological evidence // Nutrition and Cancer. 1992. Vol. 18. Pp. 1-29.
3. Steinmetz K.A., Potter J.D. Food-group consumption and colon cancer in the adelaide case-control study. I. Vegetables and fruit // Journal of Cancer. 1993. Vol. 53, N5. Pp. 711-719.
4. Chen B.H., Peng H.Y., Chen H.E. Changes of Carotenoids, Color, and Vitamin A Contents during Processing of Carrot Juice // J. Agric. Food Chem. 1995. Vol. 43, N7. Pp. 1912-1918.
5. High performance liquid chromatography in phytochemical analysis. Ed. M. Waksmundzka-Hajnos, J. Sherma. Boca Raton, 2011. 977 p.
6. Delia B. Rodriguez-Amaya. A guide to carotenoid analysis in foods. Washington, 2001. 65 p.
7. Амосова A.C., Ивахнов А.Д., Скребец Т.Э., Ульяновский Н.В., Боголицын К.Г. Сверхкритическая флюидная экс-
тракция каротиноидов моркови Шантанэ // Химия растительного сырья. В печати.
8. Delia B. Rodriguez-Amaya. A guide to carotenoid analysis in foods. Washington, 2001. Pp. 65.
9. Cristiane H. Azevedo-Meleiro, Delia B. Rodriguez-Amaya Confirmation of the identity of the carotenoids of tropical fruits
by HPLC-DAD and HPLC-MS // Journal of Food Composition and Analysis. 2004. Vol. 17, N3. Pp. 385-396.
10. Delia B. Rodriguez-Amaya, Mieko Kimura. Harvestplus Handbook for Carotenoid Analysis: HarvestPlus Technical Monograph. Washington, 2004. P. 63.
11. Tan B., Soderstrom D.N., Qualitative aspects of UV-VIS spectrophotometry of P-carotene and lycopene // Journal of chemical education. 1989. Vol. 66, N3. Pp. 258-260.
Поступило в редакцию 8 августа 2012 г.
Ulyanovsky N.V.1,2 , Kosyakov D.S.1, Bogolitsyn K.G.1,2, Ivakhnov A.D.1, Amosova A.S.1 THE DEVELOPMENT OF EXPRESS METHODS FOR THE ANALYTICAL EXTRACTION OF CAROTENOIDS FROM PLANT RAW MATERIALS
1Severny (Arctic) Federal University M.V. Lomonosov, st. Naberezhnaia Severnoi Dviny, 17, Arkhangelsk, 163002 (Russia), e-mail: [email protected]
2Institute of Ecological Problems of the North Ural Branch of RAS, st. Naberezhnaia Severnoi Dviny, 23, Arkhangelsk, 163002 (Russia)
The optimal conditions of supercritical fluid extraction and accelerated solvent extraction of carotenoids from plant raw materials are found for the purpose of subsequent chromatographic analysis, The comparison of proposed methods with Soxhlet extraction is carried out. It is shown the accelerated solvent extraction with the sub-critical acetone is the most effective and rapid sample preparation procedure for HPLC determination of carotenoids,
Keywords: carotenoids, accelerated solvent extraction, supercritical fluid extraction, plant raw materials.
References
1, New research on antioxidants. Ed, D, Marin, P. Garcia. New York, 2008, 300 p.
2, Block G., Patterson B., Subar A, Nutrition and Cancer, 1992, vol. 18, pp. 1-29,
3, Steinmetz K.A., Potter J.D. Journal of Cancer, 1993, vol. 53, no, 5, pp. 711-719,
4, Chen B.H., Peng H.Y., Chen H.E. J. Agric. Food Chem,, 1995, vol. 43, no, 7, pp. 1912-1918,
5, High performance liquid chromatography in phytochemical analysis. Ed. M. Waksmundzka-Hajnos, J. Sherma. Boca
Raton, 2011, 977 p.
6, Delia B, Rodriguez-Amaya, A guide to carotenoid analysis in foods, Washington, 2001, 65 p.
7, Amosova A.S., Ivakhnov A.D., Skrebets T.E., Ul'ianovskii N.V., Bogolitsyn K.G. Khimiia rastitel'nogo syr'ia. (In Press) (in Russ.).
8, Delia B, Rodriguez-Amaya, A guide to carotenoid analysis in foods, Washington, 2001, Pp. 65,
9, Cristiane H, Azevedo-Meleiro, Delia B, Journal of Food Composition and Analysis, 2004, vol. 17, no, 3, pp. 385-396,
10, Delia B. Rodriguez-Amaya, Mieko Kimura. Harvestplus Handbook for Carotenoid Analysis: HarvestPlus Technical Monograph, Washington, 2004, P. 63,
11, Tan B., Soderstrom D.N. Journal of chemical education, 1989, vol. 66, no, 3, pp. 258-260,
Received August 8, 2012
* Corresponding author.
