CC BY
20
182
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
репродуктивного возраста. При этом формирование неполноценного рубца на матке после КС является актуальной проблемой современной гинекологии, которая приводит к угрозе разрыва матки во время последующей беременности, повышению вероятности невынашивания беременности, нарушению прикрепления плаценты к стенке матки, плацентарной недостаточности. В связи с этим актуальна разработка подходов к восстановлению тканей матки с формированием полноценного рубца после оперативного родоразрешения в т. ч. с использованием клеточной терапии.
Цель данного исследования — изучить иммуногисто-химические характеристики тканей матки кроликов при восстановлении после моделирования послеоперационного рубца матки на фоне введения клеточного продукта на основе мезенхимальных стромальных клеток (МСК). Предмет исследования — экспрессия коллагена (Coll) I и III типа, вносящих значительный вклад в механическую прочность ткани матки, и их соотношение по содержанию: в интактной мышечной ткани матки оно приближено к 1:1. МСК выделяли из биоптатов жировой ткани ферментативным способом по стандартной методике и культивировали в стерильных условиях при 37°С, 5% СО2, 100% влажности в ростовой среде (а-МЕМ, 10% фетальной бычьей сыворотки, 2mM глу-тамина, 1% смеси антибиотиков-антимикотиков). В эксперименте использовали жизнеспособные культивированные клетки (95-98%) 3 пассажа, имеющие фенотип CD29+/CD44+/CD90+/CD105+/CD34-/CD45-. Моделирование рубцового процесса: под действием наркоза контрольным и опытным животным в области матки, острым путём на расстоянии 1 см от места срастания маточных рогов производили два разреза через все слои размерами 1 см на правом и левом рогах матки. Раны ушивали непрерывным швом. В сформированные разрезы в матке кроликов опытной группы после ее ушивания в область потенциального формирования рубца вводили МСК. По истечении срока наблюдения (7-е, 14-е сутки и спустя 30 суток после оперативного вмешательства) животные контрольной и опытной группы выводились из эксперимента с соблюдением принципов биоэтики в соответствии со стандартами GLP и производился забор их маток. Образцы ткани фиксировали и по стандартной методике подготавливали для иммуно-гистохимического окрашивания с использованием первичных антител к Coll I, III и коммерческой системы визуализации антител «2-step plus Poly-HRP Anti Rabbit/ Mouse IgG Detection System» (Elabscience). Количественную оценку экспрессии Coll I, III выполняли путем анализа цифровых изображений с использованием алгоритма «positive pixel count» программы для морфометрии «Aperio Image Scope 12.1.0.5» и расчёта индекс экспрессии исследуемых маркеров. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 10.0. В результате исследования выявлено, что при травматическом повреждении тканей матки в эксперименте развивается нарушение их морфологии, развивается дезорганизация, дискомплексация слоев. При этом восстановительный процесс в тканях матки животных, которым вводили МСК в место формирования потенциального рубца, был более полноценным, по сравнению с таковым в случае без введения клеток, соотношение Coll I и III было близко к 1:1. Можно сделать вывод, что применение МСК у животных в эксперименте по формированию модели рубцовых процессов позволяет оптимизировать регенерацию тканей матки, ускорить сроки и повысить эффективность ее восстановления.
РАЗРАБОТКА БИОТКАНИ НА ОСНОВЕ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО БИОГЕЛЯ ДЛЯ ТЕРАПИИ СИНДРОМА АШЕРМАНА
Р.А. Полтавцева, А.Ю. Пульвер, Н.А. Пульвер, Е.В. Свирщевская
ФГБУ НМИЦ акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: биогель, биоткань, синдром Ашермана, противоспаечный эффект.
Основной причиной вторичного бесплодия является механическая травма базального слоя эндометрия после родов или аборта, что в ряде случаев приводит к формированию не рассасывающихся спаек—синехий. В данной работе разработан биоматериал (Биоткань, БТ) на основе термочувствительного биополимера поли-1\1-изопропилакриламида (ПНИПААм), конъюгированного с биологическими добавками для терапии вторичного бесплодия.
В состав БТ входят белки тромбоцитарного лизата (ТЛ) плазмы крови и экстракт внеклеточного матрикса (ВКМ), выделенный из ткани эндометрия в соотношении ПНИПААм, ВКМ, ТЛ как 10:3.5:1.5. В качестве контроля использовали гель на основе коллагена. Исходный гель ПНИПААм не токсичен, что показано в экспериментах in vitro с использованием панели клеточных линий и ме-зенхимальных стволовых клеток (МСК), выделенных из эндометрия человека. Очищенный ТЛ обладал стимулирующим эффектом (на 15-20%) в культурах in vitro, после конъюгации с ПНИПААм эффект снижался, но был достоверным (5-12%). Очищенный компонент ВКМ оказывал стимулирующее влияние на МСК, полученные из эндометрия, но не влиял на пролиферацию клеточных линий. При конъюгации эффект ВКМ на МСК сохранялся (5-10%). Полученная БТ стимулировала пролиферацию, метаболическую активность клеток и повышала адгезию к белкам внеклеточного матрикса МСК. Полученная БТ сохраняла способность к застудневанию при 32 оС. Таким образом, в экспериментах in vitro показали, что БТ, сохраняла свойства термочувствительности и биоактивности.
Для анализа противоспаечного эффекта in vivo нами была разработана экспериментальная модель повреждения глубоких слоев эндометрия на маточных рогах крысы, что приводило к формированию синехий. Введение БТ в полости оперированных рогов приводило к частичному восстановлению эндометрия. Далее проводили анализ наступления беременности, для этого через 3 недели после операции самок подсаживали к самцам. Анализ наступления беременности отслеживали по весу оперированных самок. Финальные результаты оценивались по количеству родившихся крысят, с последующим патолого-анатомическим и гистологическим анализом маточных рогов. Показали количество крысят у оперированных крыс, хотя их количество было меньше нормы (2,3 ± 1,5 против 4,2 ± 2,1 на каждый маточный рог соответственно).
Таким образом, проведенные исследования позволили разработать биоткань на основе ПНИПААм, конъюгированного с биологически активными субстанциями, обладающую противоспаечной активностью, позволяющей как частично восстановить эндометрий матки, так и обеспечить имплантацию яйцеклеток. Работа выполнена по государственному заданию Министерства Здравоохранения Российской Федерации на 2020-2022 годы (№ АААА-А20-120022790039-1).
Гены & Клетки XVII, №3, 2022
