CC BY-ND
25
33
§1 УДК 578.832.1:62:001.891
о РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ТЕСТ-СИСТЕМЫ
сБ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ А/ШШ В ОБЪЕКТАХ
ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
^^ Н.Ф. Василенко, О.В. Малецкая, И.В. Жарникова, Т.В. Таран, О.И. Коготкова
■— ФКУЗ Ставропольский противочумный институт
Роспотребнадзора, г. Ставрополь, Россия
Разработана технология изготовления композиционных аффинных сорбентов с магнитными свойствами и биотехнология производства магноиммуносорбентной тест-системы для индикации вируса гриппа птиц A/H5N1 методом иммуноферментного анализа в биологическом материале от павших и больных птиц и пробах из объектов окружающей среды. Ключевые слова: грипп птиц, вирус, магноиммуносорбент, селективное концентрирование, иммуноферментный анализ.
N.F. Vasilenko, O.V.Maletskaya, I.V. Zharnikova, T.V. Taran, O.I. Kogotkova □ BIOTECHNOLOGY PRODUCTION DEVELOPMENT OF TEST SYSTEM FOR IDENTIFYING AVIAN INFLUENZA VIRUS A/H5N1 IN ENVIRONMENTAL OBJECTS □ Federal State Institution of Public Health «Stavropol Plague Control Research Institute» of the Rospotrebnadzor, Stavropol, Russia.
The technology of manufacturingofcomposite affinity sorbents with magnetic properties and production biotechnology of magnetic and immune sorbent test system for indicating the avian influenza virus A/H5N1 by ELISA in biological material from dead and sick birds and samples of environmental objects.
Key words: avian influenza virus, magnetic and immune sorbent, selective concentration, ELISA.
Проблема возникновения новых и возвращающихся инфекционных болезней, поражающих население многих государств, расположенных на различных континентах земного шара, до настоящего времени не теряет своей актуальности [2, 5]. К таким инфекциям относится и грипп птиц, который в начале XXI в. приобрел способность вызывать заболевания человека при контакте с больной птицей. Опасность развития массовых эпизоотических вспышек в популяциях домашней птицы и угроза трансформации циркулирующих в настоящее время вирусов гриппа в пандемический вариант требуют постоянного наблюдения за ситуацией. Актуальность проблемы экспресс-диагностики гриппа птиц (ГП) определяется реальной опасностью заноса возбудителя этой болезни и формирования очагов инфекции во многих регионах Российской Федерации, возникновения эпизоотий среди домашней птицы и заражения человека [3, 4]. Способность отдельных штаммов вируса гриппа птиц поражать людей предопределила необходимость усиления мониторинга за первичным резервуаром этой инфекции и разработки высокоэффективных лабораторных методов его обнаружения в объектах биотического и абиотического происхождения.
Один из пунктов мониторинга — сбор, доставка и лабораторное исследование полевого материала — необходим как для прямого обнаружения компонентов возбудителя (антигенов или фрагментов генома), так и для последующей изоляции и идентификации инфекционного агента. Низкие концентрации возбудителя ГП и его компонентов в полевом материале, а также огромное количество примесей не позволяют обнаруживать антигены вируса или его генетический материал непосредственно в пробах воды из открытых водоемов, образцов почвы, птичьего помета и др. Эффективность экспресс-диагностики и индикации возбудителя могут существенно повысить магнитоуправляемые сорбенты, способные осуществлять на своей поверхности селективное
концентрирование исследуемого патогена с последующим выявлением методом иммуноферментного анализа (ИФА) [1].
Цель исследования: разработка производственной биотехнологии изготовления магно-иммуносорбентной тест-системы для выявления вируса гриппа птиц A/H5N1 методом ИФА в биологическом материале от павших и больных птиц и пробах, полученных из объектов окружающей среды (вода, почва, птичий помет).
Материалы и методы исследований. При выполнении работы для производства и контроля использовали вирус гриппа Н5Ш-субтипа, штамм A/Common gull/Chany/2006, из которого получали антиген путём культивирования вируса в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ).Аллантоисную жидкость РКЭ отбирали через 2 суток инкубации. Гемагглютинирующий титр антигена после наработки составил 2 560 ГАЕ/мл. Далее проводили инактивирование антигена в-пропиолактоном. Инактивированный антиген центрифугировали при 25 000 об./мин в течение 90 мин на центрифуге BECKMAN Avanti® J-30 I. Сформировавшийся осадок растворяли в фосфатно-солевом буфере. Титр антигена после концентрирования составил 20 480 ГАЕ/мл. Полученным антигеном с адъювантом Фрейнда в соотношении 1 : 1 иммунизировали кроликов. Тотальный забор крови осуществляли на 80-й день иммунизации. Для устранения неспецифичных ингибиторов антител сыворотку обрабатывали RDE (Receptor destroyed enzyme). Титр полученной сыворотки в РТГА равнялся 1 : 640 ГАЕ/мл. Антиген вируса гриппа А/Н5Ш и иммунная кроличья сыворотка получены специалистами отдела зоонозных инфекций и гриппа ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Специфические иммуноглобулины класса G (IgG) для приготовления иммунопероксидазного конъюгата и магноиммуносорбента (МИС) выделяли фракционированием каприловой кислотой. Иммунопероксидазный конъюгат получали мето-
06419797
34
ЗНиСО
Рис. Набор реагентов «ИФА-МИС-Грипп птиц-СтавНИПЧИ»
дом перйодатного окисления. Для конструирования магносорбента (МС) в качестве матрицы использовали алюмосиликат с оксидом железа, модифицированные 6 %-м раствором полиглюкина, с последующим ковалентным связыванием IgG на поверхности МС и получением МИС.
Результаты и обсуждение. Аффинные органо-кремнеземные сорбенты с магнитными свойствами, изготовленные на основе кремнезема — алюмосиликата, модифицированного полиглюкином и вторичным алкилсульфатом натрия, характеризуются высокой адсорбционной активностью за счет развитой поверхности и привитого специфического лиганда, которым являются IgG к вирусу гриппа птиц. Магнитный материал обеспечивает упрощение и удобство манипуляций с сорбентами при проведении анализов.
В экспресс-анализах МИС выступают в качестве твердой фазы, значительно увеличивая специфичность и чувствительность анализов за счет селективной концентрации возбудителя на своей поверхности. В основу метода положена схема прямого иммуноферментного анализа. При постановке ИФА антиген вируса гриппа птиц, содержащийся в исследуемом материале, специфически взаимодействует с IgG к вирусу ГП, иммобилизованными на МИС. Образовавшийся комплекс «антиген—антитело» выявляли с помощью иммунопероксидазного конъюгата, катализирующего расщепление хромогена — тетраметиленбен-зидина.
В результате проведенных исследований нами сконструирован набор реагентов тест-система иммуноферментная магноиммуносорбентная для выявления вируса гриппа птиц А/Н5Ш («ИФА-МИС-Грипп птиц-СтавНИПЧИ»). Тест-система включает следующие компоненты: 10 %-я взвесь МИС против вируса ГП; конъюгат иммунопе-роксидазный иммуноглобулиновый против вируса ГП; антиген вируса ГП А/Н5№ с концентрацией 500 мкг/мл (положительный контроль);
фосфатно-солевой буфер; бычий сывороточный альбумин; твин-20; тетраметиленбензидин; 4 N раствор серной кислоты (стоп-реагент); планшет полистироловый плоскодонный для ИФА однократного применения с объемом лунки 0,4 мл (рис.).
При определении диагностической ценности тест-системы в качестве материала для установления чувствительности был использован антиген вируса гриппа птиц А/Н5^ (инакти-вированный) с концентрацией белка 500 мкг/ мл, раститрованный до 100 нг/мл. Для проверки специфичности использованы антигены вируса гриппа типа А (НШ1,Н3№) и типа В (препарат «Гриппол»). Отрицательным контролем служил МИС, не контактировавший с антигеном вируса ГП А/Н5Ш.
Проведены квалификационные межлабораторные испытания 3 серий набора реагентов «ИФА-МИС-Грипп птиц-СтавНИПЧИ» (акт квалификационных межлабораторных испытаний от 24.04.2013, утвержденный ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора). Разработана нормативная документация на набор реагентов «МИС-ИФА-Грипп птиц-СтавНИПЧИ»: пусковой регламент, технические условия, инструкция по применению, одобренная Ученым советом ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора (протокол от 30.05.2013 № 5) и утвержденная директором института.
Получены положительные результаты проведенных квалификационных испытаний, соответствие характеристик испытанных наборов требованиям технических условий (ТУ 9388-03301897080—2013), показана полнота и стабильность технологического процесса, необходимое качество выполнения всех технологических операций, наличие системы качества производства, готовность производства к серийному выпуску данного изделия медицинского назначения.
10319799
r-Ь
Проведены технические испытания медицинского изделия на базе ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора с участием специалистов кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России. Результаты испытаний показали, что набор реагентов «ИФА-МИС-Грипп птиц-СтавНИПЧИ» выявляет в ИФА антиген вируса ГП А/Н5Ш в концентрации 100 нг/мл при рабочем разведении пероксидазного конъю-гата 1 : 1 000 и не выявляет антиген вируса гриппа типа А(НШ1 и Н3К2) и типа В (из препарата «Гриппол»).
Исследования по определению стабильности основных параметров качества свидетельствуют, что тест-система в течение 12 месяцев хранения при температуре (5 ± 3) °С стабильно сохраняет свои физико-химические и биологические свойства.
Таким образом, разработанная магноиммуно-сорбентная тест-система для индикации вируса гриппа птиц А/Н5Ш методом иммуноферментно-го анализа в биологическом материале от павших и больных птиц и пробах из объектов окружающей среды позволит осуществлять оперативный эпидемиологический и эпизоотологический мониторинг, что будет способствовать своевременному проведению медицинских и ветеринарных мероприятий, направленных на профилактику гриппа птиц.
ЛИТЕРАТУРА Ефременко В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях. Ставрополь: Государственное предприятие издательско-полиграфическая фирма «Ставрополье», 1996. 131 с.
Лещева Г.А. и др. Крымская геморрагическая лихорадка — актуальная проблема Республики Калмыкия / Г.А. Лещева, Г.В. Гальцева, В.Н. Городин, Е.К. Бадмараева //Здоровье населения и среда обитания. 2013. № 1 (238). С. 26—28.
Львов Д.К. Значение вновь возвращающихся инфекций. //Вопросы вирусологии. 2002. № 5. С. 4—7. Львов Д.К. и др. Молекулярно-генетический анализ биологических свойств высокопатогенных штаммов вируса гриппа A/H5N1, изолированных от диких и домашних птиц в период эпизоотии в Западной Сибири (июль 2005) / Д.К. Львов, А.Г. Прилипов, М.Ю. Щелканов, П.Г. Дерябин, А.А. Шилов, Т.В. Грибенникова, Г.К. Сады-кова, О.В. Ляпина //Вопросы вирусологии. 2006. № 2. С. 15—19.
Малецкая О.В. и др. Эпидемическая ситуация и заболеваемость Крымской геморрагической лихорадкой в Южном федеральном округе в 2009 г. / О.В. Малецкая, Т.В. Харченко, Г.Д. Брюханова, А.П. Бейер, Н.Ф. Василенко, А.Д. Антоненко, А.Н. Куличенко //Здоровье населения и среда обитания. 2010. № 5 (206). С. 35—37.
Контактная информация:
Василенко Надежда Филипповна, тел.: 8 (8652) 26-03-83, 8 (906) 463-72-12, e-mail: [email protected]
Contakt information:
Vasilenko Nadegda,
phone: 8 (8652) 26-03-83, 8 (906) 463-72-12, e-mail: [email protected]
УДК 616.97 - 036.2
СОЦИАЛЬНО-ГИГИЕНИЧЕСКИЕ РИСКИ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ, ПЕРЕДАЮЩИХСЯ ПРЕИМУЩЕСТВЕННО ПОЛОВЫМ ПУТЕМ
С.В. Андреев, Н.П. Сетко, Л.Г. Воронина
ГБОУ ВПО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Оренбург, Россия
Рассмотрены социально-гигиенические риски возникновения инфекций, передающихся преимущественно половым путем. С целью оценки социально-гигиенических рисков были рассмотрены: гендерный признак, курение, употребление алкоголя, раннее начало половой жизни (в том числе в состоянии алкогольного опьянения), пренебрежение использованием средств барьерной контрацепции, незнание правил их использования, промискуитетное поведение. Показана значительная гетерогенность в структуре рисков, различная значимость риска в возникновении инфекций, передающихся преимущественно половым путем. Ключевые слова: социально-гигиенические риски, ИППП.
S.V. Andreev, N.P. Seiko, L.G. Voronina □ SOCIOHYGIENIC RISKS OF DEVELOPING SEXUALLY
TRANSMITTED INFECTIONS □ Orenburg State Medical University, Orenburg, Russia.
Examines the sociohygienic risk of developing sexually transmitted infections. In order to assess the socio-sanitary risks were considered: gender, smoking, alcohol use, early sexual activity (including the influence of alcohol), the neglect of the use of barrier contraception, ignorance of the rules of use, promiscuity. The considerable heterogeneity in the structure of risk, the risk of a different significance in the development of the disease. Key words: sociohygienic risks, STIs.
Проблема высокого уровня заболеваемости инфекциями, передавающимися преимущественно половым путем (ИППП), остается актуальной как в России, так и во всем мире в целом [3]. ИППП повышает риск развития бесплодия, рака шейки матки, пельвиоперитонитов, выкидышей, врожденной патологии плода [4]. С целью дальнейшего противодействия распространения
ИППП, снижения уровня заболеваемости необходимо исследовать ведущие факторы риска возникновения и развития ИППП [1, 2, 3].
Нами изучены социально-гигиенические риски возникновения ИППП.
Для этого была разработана анкета, основанная на опроснике кафедры гигиены МГМУ (1996 г.), с изменениями и дополнениями [6],
06419797
