CC BY
17pneumococcal vaccine conjugated to CRM197 in United States infants. Pediatrics. 1998, 101: 604611.
17. Safari D., Dekker H.A.T., Joosten A.F. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against S. pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 2008, 76 (10): 4615-4623.
18. Verez-Bencomo V., Fernandez-Santana V., Hardy E. et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science. 2004, 305: 522-525.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Курбатова Екатерина Алексеевна, д.м.н., проф.,
105064, Москва, М.Казенный пер., 5А, р.т. (495)917-57-74
© А.Л.БУРМИСТРОВА, Ю.Ю.ФИЛИППОВА, 2013 А.Л.Бурмистрова, Ю.Ю.Филиппова
РАСТВОРИМАЯ ФОРМА ТРИГГЕРНОГО РЕЦЕПТОРА, ЭКСПРЕССИРОВАННОГО НА МИЕЛОИДНЫХ КЛЕТКАХ 1 ТИПА, КАК МАРКЕР СМЕШАННОГО МИКРОБНОГО ИНФИЦИРОВАНИЯ ОЖОГОВЫХ РАН
Челябинский государственный университет
Цель. Выявление ранних небактериологических маркеров смешанного микробного инфицирования ожоговых ран. Материалы и методы. Исследован уровень растворимой формы триггерного рецептора, экспрессированного на миелоидных клетках 1 типа (soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1, sTREM-1) и цитокинов в сыворотке крови 60 ожоговых больных на 3 — 6 и 10 — 17 дни после ожога методом твердофазного ИФА. Результаты. На ранних сроках ожоговой болезни уровень sTREM-1 в сыворотке крови может являться небактериологическим маркером смешанного инфицирования ожоговых ран: на 3 — 6 сутки после травмы — выше 298,8 пг/мл, на 10 — 17 сутки после ожога — выше 294,2 пг/мл. Заключение. В качестве дополнительного лабораторного маркера смешанного микробного инфицирования ожоговых ран может быть предложен уровень sTREM-1 в сыворотке крови пациентов с тяжелой термической травмой.
Журн. микробиол., 2013, № 6, С. 63—68
Ключевые слова: ожоги, сепсис, цитокины, растворимая форма триггерного рецептора, экспрессированного на миелоидных клетках-1 типа (sTREM-1)
A.L.Burmistrova, Yu.Yu.Filippova
SOLUBLE FORM OF TRIGGER RECEPTOR EXPRESSED ON MYELOID CELLS-1 AS A MARKER OF BURN WOUND MIXED INFECTION
Chelyabinsk State University, Russia
Aim. Detection of early non-bacteriological markers ofburn wound mixed microbial infection. Materials and methods. The level of soluble form of trigger receptor expressed on myeloid cells-1 (sTREM-1) and cytokines in blood sera of 60 burn patients on days 3 — 6 and 10 — 17 after the burn was studied by solid phase enzyme immunoassay. Results. At the early periods ofburn disease the level of sTREM-1 in sera may be a non-bacteriological marker ofburn wound mixed infection: at days 3 — 6 after the injury — higher than 298.8 pg/ml, at days 10 — 17 after the burn — higher than 294.2 pg/ml. Conclusion. Level of sTREM-1 in blood sera of patients with severe thermic injury could be proposed as an additional laboratory marker ofburn wound mixed microbial infection.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 6, P. 63—68
Key words: burns, sepsis, cytokines, soluble form of trigger receptor expressed on myeloid cells-1 (sTREM-1)
ВВЕДЕНИЕ
Ожоги — одна из самых распространенных и разрушительных форм травмы, в России на их долю приходится 10 — 11% случаев [1], 40 — 60% пациентов с тяжелыми ожогами (более 40% общей поверхности тела) умирают от сепсиса, вызванного инфекцией ожоговой раны, и/или от развивающегося синдрома полиорганной недостаточности (ПОН) [7, 11]. И хотя данные ряда авторов четко описывают корреляцию риска развития инфекции ожоговой раны и последующего развития системной инфекции с размером ожоговой раны и глубиной поражения кожных покровов, до настоящего времени не полностью понятны отношения между колонизацией/инфекцией ожоговой раны и развитием сепсиса. Об этом свидетельствует рост частоты возникновения сепсиса, ежегодное увеличение количества летальных исходов у септических больных, недостаточная эффективность терапевтических мероприятий, что приводит к большим экономическим затратам и оставляет актуальными дальнейшее исследование комплексных механизмов, вовлеченных в развитие сепсиса при ожоговой болезни, поиск ранних предикторов развития сепсиса, его осложнений и исхода и идентификацию новых терапевтических мишеней [6, 7, 9].
Одним из потенциальных маркеров инфекции является растворимая форма недавно открытого триггерного рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках 1 типа (soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1 — sTREM-1). В ряде работ показано, что высокий уровень sTREM-1 в сыворотке крови связан с наличием инфекционного процесса [10, 12], однако данные о том, является ли sTREM-1 показателем тяжести инфекционного процесса (микст-инфекция), носят дискуссионный характер.
Цель исследования — оценить использование sTREM-1 сыворотки крови больных с тяжелой термической травмой в качестве раннего маркера смешанной инфекции ожоговых ран.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена на базе областного ожогового центра Городской клинической больницы № 6 Челябинска. Обследованы 60 больных — 44 мужчины (73%) и 16 женщин (27%). Средний возраст пациентов составил 37,2±1,8 лет (от 15 до 61 года). Все обследованные имели глубокие комбинированные ожоги II — IIIA, Б, IV степени тяжести с площадью поражения от 12 до 50% общей поверхности тела. Повреждающим фактором являлось пламя. Для интегральной оценки тяжести травмы использовали индекс тяжести поражения (ИТП) [5]. В исследование были включены больные с ИТП от 30 до 110 условных единиц.
Всем пациентам проводилось комплексное клинико-лабораторное обследование, в ходе которого оценивались: общее состояние больных, течение раневого процесса, характер температурной кривой, данные клинических, биохимических анализов крови, мочи и бактериологического мониторинга крови, раневого отделяемого и био-птатов ожоговых ран. Забор материала и идентификацию микроорганизмов осуществляли в соответствии с Приказом № 535 от 22.04.85 МЗ СССР «Об унификации микробиологических/бактериологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ». В соответствии с положениями согласительной конференции Американской ожоговой ассоциации (2007) микробиологический диагноз «колонизация ожоговой раны» ставился при количестве бактерий КОЕ >105 на г ткани. Концентрация микроорганизмов в ране в количестве < 103 КОЕ/г ткани не учитывалась и оценивалась как транзиторная микрофлора.
На основании комплексного клинико-лабораторного обследования 54 пациентам на 20 — 30 сутки после ожога был поставлен диагноз сепсис на фоне длительно существующих инфицированных ожоговых ран. У 6 больных развился только синдром
системного воспалительного ответа (ССВО). Диагноз ССВО, сепсис ставился на основании положений Чикагской согласительной конференции (1992) и согласительной конференции Американской ожоговой ассоциации (2007).
В соответствии с поставленной целью в сыворотке крови больных было определено содержание sTREM-1 и цитокинов (IL-6, TNF-a, IL-8, IL-1ß, IL-1Ra, IFN-y, IL-10) на 3 — 6 сутки после ожога (период после ожогового шока) и на 10-17 сутки после травмы (период септикотоксемии) до появления клинических симптомов сепсиса методом твердофазного ИФА наборами реагентов «Вектор-Бест» (Новосибирск), «Biosourse» и «R&D Systems» (Minneapolis, USA).
Статистическую значимость межгрупповых различий определяли с помощью критерия Краскела — Уоллиса с апостериорными парными сравнениями по Коноверу
— Инману. Для определения конкретного значения показателя, который позволяет разделить больных на пациентов с моно- и смешанной инфекцией ожоговой раны, использовали ROC-анализ (Receiver Operating Characteristic Analysis) с вычислением площади под ROC-кривой и «точки отсечения» — значение показателя, которое делит исследуемых больных на искомые группы. Все расчеты и графические построения выполнены в пакетах SPSS for Windows (v. 15.0., SPSS Inc.) и MedCalc (v. 10.2.0). Во всех случаях различия и зависимости считали статистически значимыми при р<0,05.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
На первом этапе работы мы проанализировали результаты бактериологических исследований: выраженность инфицирования и видовое разнообразие этиологически значимых микроорганизмов в ожоговых ранах пациентов с тяжелыми термическими поражениями на 3 — 6 и 10 — 17 сутки после травмы. Было показано, что колонизация поверхности ран развивается уже с 1 — 2 суток после травмы. К 6 суткам после травмы диагноз инфекция ожоговой раны был поставлен 69% обследованным (25 человек из 36). Основными возбудителями раневой инфекции являлись: Staphylococcus aureus
— 45% (18 человек из 36), Pseudomonas aeruginosa — 35% (14 человек из 36) и Acinetobacter spp. — 20% (8 человек из 36). Одновременное наличие в ране нескольких видов возбудителей было определено к 4 — 6 суткам у 25% пациентов (9 человек из 36). Смешанная культура чаще всего была представлена ассоциацией S.aureus и P. aeruginosa —14% (5 человек из 36).
На 10 — 17 сутки после травмы количество больных с инфицированием ожоговой раны не изменялось, но увеличивалось количество пациентов со смешанным инфицированием ожоговых ран грамположительными и грамотрицательными микроорганизмами по сравнению с больными на 3 — 6 сутки после травмы (43 и 25% соответственно). На 10 — 17 сутки после травмы доля S.aureus, определяемого в ранах, как в виде монокультуры, так и в виде ассоциаций с другими микроорганизмами составила 50% от всех прочих изолятов. У 22% пациентов (10 человек из 46) смешанная инфекция была представлена ассоциацией S.aureus и P.aeruginosa, у 13% ожоговых больных (6 человек из 46) — S.aureus совместно с Acinetobacter spp. Микробиологический пейзаж ожоговой раны характеризовался периодичностью смены доминирующего возбудителя: начиная с 10 суток преобладающими видами возбудителей становятся P.aeruginosa и Acinetobacter spp. сначала в ассоциациях, а к концу срока наблюдения (25 — 40 сутки) — в монокультуре.
Обращает на себя внимание факт, что к 10 — 17 суткам после травмы почти в половине случаев (43%) микроорганизмы ожоговых ран представлены в виде ассоциаций. По данным ряда авторов [2, 8], одновременное развитие в ране нескольких возбудителей приводит к суммированию их болезнетворных возможностей и вызывает взаимное усиление вирулентности ассоциантов.
Для поиска ранних небактериологических маркеров смешанного микробного инфицирования ожоговых ран мы оценили изменение уровня цитокинов и sTREM-1
5. ЖМЭИ 6 № 5187
65
в сыворотке крови пациентов с тяжелой термической травмой в зависимости от моно-и смешанного инфицирования ожоговой раны с помощью критерия Краскела — Уоллиса с апостериорными парными сравнениями по Коноверу — Инману. Уровень sTREM-1 в сыворотке крови больных со смешанным инфицированием ожоговой раны был достоверно повышен по сравнению с пациентами с моноинфекцией как на 3 — 6, так и на 10 — 17 сутки после травмы (341,0:251,8 и 367,5:239,7 соответственно). В уровне цитокинов в сыворотке крови пациентов с моно- и смешанной инфекцией ожоговой раны статистически значимых различий не выявлено, хотя ранее нами было показано, что цитокины сыворотки крови выступают биомаркерами прогноза течения ожоговой болезни и ее исхода [4].
На втором этапе работы с помощью ROC-анализа мы оценили диагностическую значимость уровня sTREM-1 в сыворотке крови и определили конкретные значения этого показателя, которые могут быть использованы в качестве маркеров небактериологической диагностики смешанного микробного инфицирования уже на 3 — 6 и 10 — 17 сутки после травмы. В результате анализа были построены ROC-кривые, оценены площади под ROC-кривыми и найдены «точки отсечения» — значения sTREM-1 в сыворотке крови, с помощью которого можно разделить ожоговых больных в зависимости от моно- или смешанного инфицирования ожоговой раны на 3 — 6 и 10 — 17 сутки после травмы.
Показано, что уже на 3 — 6 сутки после ожога уровень sTREM-1 в сыворотке крови выше 298,8 пг/мл (чувствительность 77,8%; специфичность 100%; площадь под ROC-кривой 0,952+0,0517; 95%ДИ 0,806 — 0,994) может свидетельствовать об инфицировании ожоговой раны двумя и более видами возбудителей. На 10 — 17 сутки после травмы диагностически значимый уровень sTREM-1 составлял 294,2 пг/мл (чувствительность 84,2%; специфичность 100%; площадь под ROC-кривой 0,914+0,0479; 95% ДИ 0,788 — 0,977).
Следовательно, предиктовым информативным методом небактериологической диагностики смешанного инфицирования ожоговых ран на ранних сроках ожоговой болезни может являться оценка уровня sTREM-1 в сыворотке крови на 3 — 6 сутки после травмы — выше 298,8 пг/мл, на 10 — 17 сутки после ожога — выше 294,2 пг/мл.
ОБСУЖДЕНИЕ
В последние годы приходит осознание того, что сепсис (характерные для него патобиологические процессы) и, прежде всего, у больных с тяжелыми термическими травмами необходимо рассматривать с позиций взаимоотношений хозяин-микроорганизм в контексте ряда условий: 1. составляющие хозяина — преморбидные факторы, включая этнос, гендерные особенности, возраст, наличие генетических дефектов и т. д. [16]; 2. конкретные условия — характер ожоговой раны (размеры, глубина поражения, анатомическая локализация), особенности фактора поражения, стартовая терапия и т. д. [7]; 3. составляющая микроорганизмов — колонизация раневой поверхности, виды-ассоцианты, их источник, виды доминирующих этиологически значимых микроорганизмов в сообществе, поселившегося на раневой поверхности, инфекция ожоговой раны и генерализация процесса [7].
После термического поражения практически немедленно происходит колонизация раны культивируемыми формами микроорганизмов [7, 13]. В течение первых 48 часов после травмы, если не используются антимикробные вещества, начинается колонизация раневых поверхностей грамположительными бактериями, входящими в состав микробиоты кожи (с неповрежденных участков и глубоких слоев), т.е. первыми колонистами выступают представители нормальной микробиоты, несущие высокий физиологический потенциал, в том числе обеспечение колонизационной резистентности.
Начиная с 3 — 5 суток от травмы происходит заселение поверхности грамотрица-тельными бактериями вследствие транслокации их из кишечника, проницаемость
которого существенно возрастает в условиях стресса [17]. Возможно, повышение проницаемости кишечника [3] отражает физиологический закон утраты толерогенных и приобретение иммунных для организма антигенов, определяющих активацию базового иммуно/нейро/эндокринного ответа с целью «расширения» адаптационных возможностей стрессированного организма, и в этом большую роль играют гормоны стресса — катехоламины. Однако при тяжелых поражениях перечисленные события способны привести к плохо контролируемым реакциям и отрицательным последствиям, так как эти же гормоны — адреналин и норадреналин ощущаются бактериями как информационные молекулы «межгосударственной» сигнальной системы («inter-kingdom signaling»), реализующей коммуникацию между бактериями и их хозяевами, и расходуются ими с учетом своей целевой программы [15]. Например, оппортунистический патоген P.aeruginosa использует освобождаемые в ходе стресса хозяина эндогенные опиоиды, в частности динорфин, для повышения экспрессии своих вирулентных свойств [21]. Так способны поступать и многие другие микроорганизмы.
В этот же период (3 — 5 сутки) осуществляется колонизация ран госпитальными штаммами, устойчивыми к антибиотикам, владеющими выраженными вирулентными свойствами, для которых силой обстоятельств созданы благоприятные условия для проживания и инвазии как за счет потери защитного бактерицидного кожного покрова, так и за счет деструкции нормальной микробиоты кожи.
Каковы результаты такой колонизации? Под действием антибиотиков широкого спектра действия происходит не только изменение порядка заселения пораженных поверхностей, но и появляются новые сообщества со своими структурой и свойствами: 1. на поврежденных участках кожи идет формирование «раневого микробиома», обогащенного генами, отвечающими за экспрессию вирулентности, в том числе анти-биотикорезистентность. Например, появление высокопатогенного метициллинрези-стентного штамма S.aureus, который быстро приобретает от симбионта S.epidermidis гены-промоторы роста на коже [18].
2. Запускается колонизация ожоговой раны сообществами ассоциантов (2 — 3 видами микроорганизмов). Известно, что проживание на одной территории различных видов бактерий приводит к возрастанию уровня горизонтального генного транспорта (ГГТ): у неродственных бактерий, занимающих узкоспециализированные ниши тела человека, ГГТ превышает во много раз таковой между близкородственными изолята-ми различных экологических ниш. Как считают авторы [19], этот механизм позволяет микроорганизмам быстро справиться с адаптацией к новым нишам. При появлении антибиотикорезистентных штаммов в местах проживания границы действия ГГТ расширяются и начинают включать в себя сразу несколько анатомических ниш [19].
3. Более того, колонизирующая микробиота проявляет тесные связи (осуществляет перекрестные «химические переговоры» [3]) с кожным ответом на поражение. Показано, что заселение стафилококком ран у больных диабетом ассоциировано с недостаточным их заживлением, реэпителизацией пораженной поверхности, и этот процесс коррелировал с аберрантной экспрессией генов, обеспечивающих защитный кожный ответ [14]. Как свидетельствует Grice E.A. et al. [14], кожный и раневой микро-биомы демонстрируют тесную ассоциацию с транскрипционной прописью защитного кожного ответа, то есть происходит взаимодействие двух ключевых компонентов геномного ландшафта — микробиоты и транскрипционного ответа хозяина.
4. И наконец, микробиота начинает изменять форму существования, а именно, происходит переход культивируемых форм в некультивируемые. Если учесть, что от 20 до 60% микробиома, ассоциированного с различными участками тела человека, представлено некультивируемыми формами микроорганизмов [20], то возрастание таких микроорганизмов в микробиоме не только снижает эффективность бактериального мониторинга ожоговых ран при сепсисе и, тем более, выделение бактериальных культур из крови (положительные результаты получены только у 20% больных [9]), но и порождает много вопросов, в том числе о влиянии такой поляризации на
баланс взаимоотношений хозяин-микробиота, о трансформации этих отношений и «награждении» микробиоты рядом или множеством преимуществ.
В свете сказанного можно предположить, что на ранних стадиях ожоговой болезни, еще до развития клинических симптомов сепсиса, высоко значимыми могут оказаться не столько бактериологические методы (классическая бактериология), а биомаркеры — свидетели дестабилизации гомеостаза хозяина, в том числе иммунного и нейроэндокринного. С этой целью нами были проведены исследования по определению возможного использования в качестве лабораторного биомаркера смешанного инфицирования ран уровня sTREM-1 сыворотки крови у пострадавших с термическими травмами. Показано, что в ранние сроки ожоговой болезни высокий уровень sTREM-1 в сыворотке крови пациентов с тяжелыми термическими поражениями ассоциируется со смешанным инфицированием ран, что может использоваться в предиктовой небактериологической лабораторной диагностике в качестве дополнительного критерия генерализации инфекционного процесса.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексеев А.А., Крутиков М.Г., Бобровников А.Э. Сепсис у обожженных: вопросы диагностики, профилактики и лечения. Инф. антимикр. терап. 2001, 3: 74-75.
2. Бельский В.В., Шаталова Е.В. Взаимное влияние возбудителей при смешанной инфекции ожоговой травмы. Журн. микробиол. 1999, 4: 3-7.
3. Бурмистрова А.Л. Иммунный гомеостаз и микросинбиоценоз. Метаморфозы и пути развития воспалительных заболеваний кишечника. Челябинск, 1997.
4. Бурмистрова А.Л., Филиппова Ю.Ю., Угнивенко М.И. и др. Дестабилизация гомеостаза организма ожоговых больных как маркер развития сепсиса, его осложнений и исхода. Журн. микробиол. 2012, 4: 109-113.
5. Парамонов Б.А., Порембский Я.О., Яблонский В. Г. Ожоги. СПб. СпецЛит, 2000.
6. Brunn G.J., Platt J.L. The etiology of sepsis: turned inside out. Mol. Med. 2006, 12: 10-15.
7. Church D., Elsayed S., Reid O. et al. Burn wound infections. Clin. Microbiol. Rev. 2006, 19: 403434.
8. Clark N.M., Patterson J., Lynch J.P. Antimicrobial resistance among gram-negative organisms in the intensive care unit. Curr. Opin. Crit. Care. 2003, 9: 413-423.
9. Dejager L. Pinheiro I., Dejonckheere E. et al. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis? Trends Microbiol. 2011, 19: 198-208.
10. Ford J.W, McVicar D.W TREM and TREM-like receptors in inflammation and disease. Curr. Opin. Immunol. 2009, 21: 38-46.
11. Fu Y., Xie B., Ben D. et al. Pathogenic alteration in severe burn wounds. Burns. 2012, 38: 90-94.
12. Gibot S., Cravoisy A. Soluble form of the triggering receptor expressed on myeloid cells-1 as a marker of microbial infection. Clin. Med. Res. 2004, 2: 181-187.
13. Grice E.A., Kong H.H. Conlan S. еt al. Topographical and temporal diversity of the human skin microbiome. Science. 2009, 324: 1190-1192.
14. Grice E.A., Snitkin E.S., Yockey L.J. at al. Longitudinal shift in diabetic wound microbiota correlates with prolonged skin defense response. PNAS. 2010, 107: 14799-14804.
15. Hughes D.T., Sperandio V. Inter-kindom signaling: communication between bacteria and their hosts. Nature Rev. 2008, 6: 111-120.
16. Levy M.M., Fink M.P., Marshall J.C. еt al. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International sepsis definitions conference. Crit. Care Med. 2003, 31: 1250-1256.
17. Rittirsch D., Flierl M.A., Ward P. A. Harmful molecular mechanisms in sepsis. Nat. Rev. Immunol. 2008, 8: 776-787.
18. Santaniello, J. M., Luchette FA., Esposito T.J. еt al. Ten year experience of burn, trauma, and combined burn/trauma injuries comparing outcomes. J. Trauma. 2004, 57: 696-700.
19. Smillie C.S., Smith M.B., Friedman J. еt al. Ecology drives a global network of gene exchange connecting the human microbiome. Nature. 2011, 480: 241-244.
20. The NIH Human Microbiom Project. The NIH HMP Working Group. Genome Research. 2009, 19: 2317-2323.
21. Zaborina O., Lepine F., Xiao G. еt al. Dynorphin activates quorum sensing quinolone signaling in Pseudomonas aeruginosa. Plos Pathog. 2007, 3 (5): e67.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Бурмистрова Александра Леонидовна, д.м.н., проф., 454001, Челябинск, ул. Братьев Кашириных, 129, р.т. (351)799-71-76
