CC BY
79
ГЕНЕТИКА, БИОТЕХНОЛОГИЯ, СЕЛЕКЦИЯ И СЕМЕНОВОДСТВО
Известия ТСХА, выпуск 6, 2014 год
УДК 577.21:633.111:633.14
РАСПРОСТРАНЕНИЕ ЗАМЕЩЕНИЯ 2R/2D СРЕДИ СОРТООБРАЗЦОВ ЯРОВОЙ ГЕКСАПЛОИДНОЙ ТРИТИКАЛЕ (х TRITICOSECALE WITTM.)
А.Д. КОРШУНОВА, М.Г. ДИВАШУК, Г.И. КАРЛОВ, А.А. СОЛОВЬЕВ (РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева)
Анализ коллекции 86 сортообразцов яровой гексаплоидной тритикале различного географического происхождения показал наличие замещения 2R/2D у 17 образцов, все они являются селекционными линиями. Ни один из исследованных коммерческих сортов не несет замещения. У линии Л2412 было выявлено замещение 2B/2D.
Ключевые слова: тритикале, замещение 2R/2D, Ppd-D1, замещение 2B/2D, ДНК-маркеры.
Благодаря способности тритикале давать большие урожаи зерна и биомассы в широком диапазоне почвенно-климатических условий, на сегодняшний день ее выращивают в 42 странах мира на площади свыше 3,8 млн га. Однако у этой культуры имеется ряд недостатков, таких как высокорослость, подверженность прорастанию на корню, низкие хлебопекарные качества [1, 2, 6]. Одним из решений этих проблем является замещение отдельных хромосом ржи хромосомами D-генома пшеницы.
Среди сортов и линий озимой гексаплоидной тритикале (AABBRR) широкое распространение получило замещение 2R/2D [1, 14]. Наличие замещения 2R/2D помогает решать такие проблемы, как чрезмерная высота растений, сильная подверженность прорастанию на корню, позднее созревание. Также наличие хромосомы 2D в геноме озимой гексаплоидной тритикале увеличивает урожайность этой культуры и качество получаемого зерна [2, 11, 14]. Эффект, оказываемый хромосомой 2D, может быть обусловлен наличием важного гена, положительно влияющего на многие хозяйственно-ценные признаки, — Ppd-D1. Наличие доминантного аллеля Ppd-D1a снижает высоту растений пшеницы на 10 см и ускоряет наступление фазы цветения, уменьшая их жизненный цикл в среднем на неделю, что позволяет лучше переносить засуху [19, 20]. Также наличие аллеля Ppd-D1a обеспечивает увеличение урожайности от 9% в регионах с длинным днем до 50% в регионах с коротким днем.
Встречаемость замещения 2R/2D достаточно широко изучалась среди сортов и линий озимой тритикале благодаря его положительному влиянию на хозяйственно-ценные признаки [1, 2, 14]. Но среди сортообразцов яровой тритикале подобные исследования не проводились. В этой работе мы исследуем коллекцию яровой гексаплоидной тритикале на наличие замещения 2R/2D.
5
Методика исследований
Материалом служила коллекция яровой гексаплоидной тритикале кафедры генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Она состояла из 86 образцов (23 сорта и 63 селекционные линии) различного географического происхождения (табл.).
Характеристика сортов и линий яровой гексаплоидной тритикале по происхождению, наличию замещения 2№2Р и аллелям гена Ррб-Э1
Название сорта/ селекционной линии Происхождение Xwmc111 Xgwm349 Sec2 2R/2D Аллель гена Ppd-D1
Белорусский* Беларусь - - + - -
Лана* Беларусь - - + - -
Ульяна* Беларусь - - + - -
Узор* Беларусь - - + - -
Gabo* Польша - - + - -
Dublett* Польша - - + - -
Gredo* Польша - - + - -
Legalo* Польша - - + - -
Wanad* Польша - - + - -
Abaco* Польша - - + - -
Activo* Польша - - + - -
Арта 59* Россия - - + - -
131/7** Россия + + + - b
Ярило* Россия - - + - -
Амиго* Россия - - + - -
Память Мережко* Россия, Беларусь - - + - -
Карменн* Россия, Беларусь - - + - -
Норманн* Россия, Беларусь - - + - -
Укро* Россия, Украина - - + - -
Хлебодар харьковский* Украина - - + - -
Соловей Харьковский* Украина - - + - -
Харьковский 1* Украина - - + - -
Sandro* Швейцария - - + - -
6
Название сорта/ селекционной линии Происхождение Х\\тс111 Хд\\т349 Бес2 2R/2D Аллель гена Ррб-й1
PI587265 Австралия + + - + а
К-1752 Беларусь - - + - -
К-1763 Беларусь + + - + а
К-1767 Беларусь - - + - -
К-1220 Бурунди + + - + а
К-1200 Испания - - + - -
К 1202 Испания + + - + а
K 1203 Испания + + - + а
К-1185 Мексика + + - + а
К-1433 Мексика + + - + а
К-1190 Мексика + + - + а
K 1186 Мексика + + - + а
PI 422258 Мексика + + - + а
PI 422260 Мексика - - + - -
PI 519877 Мексика + + - + а
PI 520445 Мексика - - + - -
PI 520484 Мексика - - + - -
PI 429082 Польша - - + - -
Presto//Tesmo Польша - - + - -
Т 327 Россия - - + - -
Т 323 Россия - - + - -
Т 324 Россия - - + - -
Т 328 Россия - - + - -
Т 329 Россия - - + - -
Т 348 Россия - - + - -
Мексика 38 Россия - - + - -
Мексика 57 Россия - - + - -
Мексика 55 Россия - - + - -
ПРАГ 557 Россия - - + - -
7
Название сорта/ селекционной линии Происхождение Х\\тс111 Хд\\т349 Бес2 2R/2D Аллель гена Ррб-й1
ПРАГ 554(8) Россия - - + - -
ПРАГ 554/1 Россия - - + - -
ПРАГ 554/2 Россия - - + - -
ПРАГ418 Россия - - + - -
ПРАГ 500/1 Россия - - + - -
ПРАГ 511 Россия - - + - -
ПРАГ 553 (20) Россия - - + - -
ПРАГ 553 (5) Россия - - + - -
ПРАГ 553(3) Россия - - + - -
ПРАГ 553/1 Россия - - + - -
ПРАГ 553/2 Россия - - + - -
Л 1338 Россия - - + - -
Л 2412 Россия + + + - а
Л 8112 Россия - - + - -
Лена 1270 Россия - - + - -
Rosner612 США + + - + а
К-1242 США - - + - -
C 191 США + + - + а
PI559373 США - - + - -
PI 587279 США - - + - -
PI587388 США + + - + а
PI587531 США - - + - -
PI 587548 США - - + - -
К-1922 Чехословакия + + - + а
PI 429153 Швейцария - - + - -
PI 429157 Швеция - - + - -
PI 429159 Швеция - - + - -
PI 429151 Швеция - - + - -
PI 429158 Швеция - - + - -
8
Название сорта/ селекционной линии Происхождение Xwmc111 Xgwm349 Sec2 2R/2D Аллель гена Ppd-D1
PI 429160 Швеция - - + - -
PI 429162 Швеция - - + - -
К-1068 Эфиопия - - + - -
PI 428904 + + - + a
PI 429031 + + - + a
* Сорта яровой гексаплоидной тритикале.
** Присутствует хромосома 2D и транслокация T2RS.2RL-2BL [12].
Геномную ДНК выделяли из 3-дневных проростков по методу Bematzky и Tanksley [10] с некоторыми модификациями.
Наличие замещений определяли при помощи молекулярных маркеров: SSR (Xwmc111 (2D S), Xgvm349 (2DL), Xbarc168 (2DS), Xgwm102 (2DS), Xgwm484 (2DS), Xgwm539 (2DL), Xbarc271 (1DL), Xbarc149 (1DS)); STS (Sec2 (2RS)) [16]; PLUG (TNAC1204, TNAC1176) [17]. Условия проведения ПЦР с маркерами на микросателлиты были аналогичны описанным в статьях Lapin et al., Дивашук и др. [16, 3]. Продукты амплификации маркеров TNAC1204 и TNAC1176 рестрицировали с помощью эндонуклеазы рестрикции BsuR I при температуре 37°С в течение ночи.
Определение аллельного состояния гена Ppd-D1 проводили с помощью прай-меров Ppd-D 1_F, Ppd-D1_R1, Ppd-D1_R2 [9].
Продукты ПЦР разделяли в 2%-ном агарозном геле в буфере ТВЕ и окрашивали бромистым этидием для последующей визуализации в УФ-трансиллюминаторе.
Результаты и их обсуждение
Распространение замещения 2R/2D
Распространение замещения 2R/2D определялось среди 86 сортов и линий коллекции яровой гексаплоидной тритикале кафедры генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Достоверно определить наличие или отсутствие замещения 2R/2D можно при использовании набора маркеров на микросателлиты: Xwmc111 (2DS, 11 сМ по карте сцепления), Xgwm349 (2DL, 93,2 сМ) и Sec2 (2RS) [8, 12, 15]. С помощью этих маркеров в нашей коллекции обнаружено замещение 2R/2D у 17 (19,5%) образцов (табл.). У этих образов также было проверено наличие хромосомы 1D для подтверждения того, что образцы несут замещение, а не полный набор хромосом генома D (октоплоиды). Для выявления хромосомы 1D использовались два микросателлитных маркера: Xbarc271 (1DL) и Xbarc149 (1DS). Амплификации данных маркеров не было ни у одного из образцов. На основании этого, а также фенотипической оценки растений можно считать, что выявленные образцы являются гексаплоидными и несут замещение 2R/2D.
Из 17 образцов с замещением 2R/2D 6 были получены нами из Мексики, 3 — из США, 2 — из Испании и по одному — из Чехословакии, Бурунди, Австралии и Беларуси. У двух российских линий присутствует хромосома 2D. Среди польских,
9
украинских, швейцарских, шведских и эфиопских сортообразцов замещение 2R/2D не выявлено.
Среди сортообразцов изучаемой коллекции замещение 2R/2D встречалось относительно часто (19,5%). Однако все образцы, несущие это замещение, являются селекционными линиями. Из 23 анализируемых коммерческих сортов не выявлено ни одного с замещением 2R/2D. Это может быть связано с какими-либо негативными эффектами замещения у яровой тритикале [8] или с селекционным процессом при получении сортов, в родословных которых отсутствовали образцы с замещениями.
Определение аллельного состояния гена Ppd-D1
Показано, что образцы озимой тритикале с замещением 2R/2D устойчивы к прорастанию на корню, имеют более короткую соломину, быстрее созревают и имеют более выполненное зерно [1, 4, 11, 14]. Это может быть обусловлено наличием хромосомы 2D как таковой [18] или тем, что на этой хромосоме локализован ген нечувствительности к фотопериоду Ppd-D1. Известно, что аллель Ppd-D1a оказывает сильное влияние на высоту растений, а также ускоряет наступление фазы цветения растений, уменьшая их жизненный цикл в среднем на неделю, и увеличивает урожайность [18, 19].
Образцы, несущие замещение 2R/2D, проверили на наличие аллеля нечувствительности к фотопериоду Ppd-D1a. У всех образцов с замещением был найден аллель Ppd-D1b, который не влияет на чувствительность к фотопериоду. А аллель Ppd-D1a был нами обнаружен только у сортобразца 131/7, несущего хромосому 2D и транслокацию T2RS.2RL-2BL [12]. Возможной причиной однообразия по гену Ppd-D1 может быть то, что изначально было ограниченное количество образцов, несущих замещение 2R/2D, и именно от них происходило распространение замещения среди тритикале. Исключение, образец 131/7, было получено на кафедре генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева путем скрещивания гибридов F1 (пшеница сорт Воронежская х яровая рожь сорт Селенга) с яровой тритикале (неизвестный образец). Единственный образец из исследуемой коллекции (131/7), несущий хромосому 2D с аллелем Ppd-D1a, в настоящее время проходит сортоиспытание (Соловьев А.А., личное сообщение).
Определение замещения у образца Л2412
При анализе на наличие замещения 2R/2D у образца Л2412 амплифицирова-лись фрагменты молекулярных маркеров как с хромосомы 2D, так и с хромосомы 2R. Для выявления наличия целой хромосомы 2D были использованы еще 4 микросател-литных маркера на короткое и длинное плечи хромосомы 2D: Xbarc168 (2DS, 46,7 сМ по карте сцепления), Xgwm102 (2DS, 48,2 сМ), Xgwm484 (2DS, 40,7 сМ), Xgwm539 (2DL, 90,2 сМ). Были получены продукты амплификации со всех 4-х маркеров, т.е. образец Л2412 несет целую хромосому 2D. Чаще всего замещения происходят между гомеологичными хромосомами. Поэтому для выявления замещаемой хромосомы мы использовали маркеры PLUG на вторую гомеологичную группу хромосом.
Для выявления замещения были применены маркеры TNAC1176 на короткие плечи хромосом второй гомеологичной группы и TNAC1204 на длинные плечи с последующей обработкой амплифицированных фрагментов эндонуклеазой рестрикции BsuR I. Результаты представлены на рисунках 1 и 2.
10
2D
Рис. 1. Рестрицированные фрагменты продуктов ПЦР TNAC1176 с использованием эндону-клеазы рестрикции BsuR I: 1 — Л2412; 2 — Triticosecale Wittm. (AABBRR); 3 — Triticum boeoti-cum (АА); 4 — Aegilops Aushceri (ВВ); 5 — Aegilops Taushii (DD); 6 — Triticum durum (AABB); 7 — Triticum aestivum (AABBDD). Стрелками обозначены фрагменты, амплифицирующиеся
с генома В
Рис. 2. Рестрицированные фрагменты продуктов ПЦР TNAC1204 с использованием эндону-клеазы рестрикции BsuR I: 1 — Л2412; 2 — Triticosecale Wittm. (AABBRR); 3 — Triticum boeoti-cum (АА); 4 — Aegilops Aushceri (ВВ); 5 — Aegilops Taushii (DD); 6 — Triticum durum (AABB); 7 — Triticum aestivum (AABBDD). Стрелками обозначены фрагменты, амплифицирующиеся
с генома В
Из рисунка 2, где представлены рестрицированные фрагменты продуктов ПЦР ТКАС1176 (короткие плечи хромосом второй гомеологичной группы), следует, что у образца Л2412 отсутствует фрагмент, амплифицирующийся у Aegilops Лшксеп (ВВ). На рисунке 3, где представлены результаты рестрикции продуктов ТКАС1204 (длинные плечи хромосом второй гомеологичной группы), у образца Л2412 также отсутствует фрагмент, амплифицирующийся у Aegilops Лшксеп (ВВ). Таким образом, выявлено, что образец Л2412 несет замещение 2В/2Б.
11
Замещение 2B/2D, представляет большой интерес с точки зрения влияния этого замещения на хозяйственно-ценные признаки яровой тритикале. Линия Л2412 является перспективной для использования ее в качестве донора в селекционном процессе, т.к. объединяет в себе хромосому 2R, положительно влияющую на устойчивость к биотическим и абиотическим факторам окружающей среды и хромосому 2D, на которой локализованы гены короткостебельности и чувствительности к фотопериоду.
Заключение
Таким образом, замещение 2R/2D выявлено у 17 из 63 селекционных линий яровой гексаплоидной тритикале. Среди 23 сортов, представленных в коллекции, это замещение не обнаружено. Аллель Ppd-D1a не был найден ни у одной из линий с замещением 2R/2D. Благодаря полученным данным селекционные линии, несущие замещение 2R/2D и 2B/2D, можно будет включать в схемы скрещиваний для переноса аллеля Ppd-D1a, а также для улучшения ряда хозяйственно-ценных признаков яровой гексаплоидной тритикале.
Библиографический список
1. Баженов М.С., Дивашук М.Г., Пыльнее В.В., Карлов Г.И., Рубец В.С. Изучение образцов озимой тритикале на наличие хромосомных замещений и их связь с устойчивостью к прорастанию на корню // Известия ТСХА. М.: Изд-во РГАУ-МСХА, 2011. Вып. 2. С. 20-26.
2. Баженов М.С., Пыльнее В.В., Тараканов И.Г. Влияние факторов окружающей среды на покой семян и прорастание зерна в колосе озимой тритикале // Известия ТСХА. М.: Изд-во РГАУ-МСХА, 2011. Вып. 6. С. 30-38.
3. ДивашукМ.Г., Карлов Г.И., Соловьев А.А. Использование микросателлитных маркеров для идентификации пшенично-ржаной транслокации у гексаплоидной тритикале // Известия ТСХА. М.: Изд-во РГАУ-МСХА, 2007. Вып. 1. С. 61-65.
4. КуркиевК.У. Характер наследования признака высота растения у образцов гексапло-идного тритикале // Исходный материал зерновых, овощных культур и проблемы селекции в условиях Южного Дагестана: Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. СПб.: ВИР, 2000. 158. С. 83-87.
5. Куркиев К.У., Тырышкин Л.Г., Колесова М.А., Куркиев У.К. Идентификация генов короткостебельности Rht2 и Rht8 у образцов гексаплоидного тритикале с помощью ДНК маркеров // Вестник ВОГиС. 2008. Т. 12. Вып. 3. С. 372-377.
6. Нгуен Т.Т. Линь, Митрошина О.В., Пыльнев В.В., Рубец В.С. Оценка устойчивости образцов коллекции озимой тритикале к прорастанию на корню // Известия ТСХА. М.: Изд-во РГАУ-МСХА, 2011. Вып. 1. С. 71-84.
7. AhmadM. Theoretical and Applied Genetics, 2000. V. 101. P. 892-896.
8. Bazhenov M.S., Divashuk M.G., Kroupin P.Yu., Pylnev V.V. and Karlov G.I. The effect of 2D(2R) substitution on agronomical traits of triticale in early generations of two connected crosses // Cereal Research Communications, 2014 (в печати).
9. Beales J., Turner A., Griffiths S., Snape J.W., Laurie D.A. A pseudo-response regulator is misexpressed in the photoperiod insensitive Ppd-D1a mutant of wheat (Triticum aestivum L.) // Theoretical and Applied Genetics. 2007. 115. Р. 721-733.
10. BernatzkyR., Tanksley S.D. Genetics of actin-related sequences. Theoretical and Applied Genetics. 1986. 72. Р. 314-321.
11. Budak H., Stephen B.P., Beecher B.S., Graybosch R.A., Campbell B.T., Shipman M.J., Erayman M., Eskridge K.M. The effect of introgressions of wheat D-genome chromosomes into «Presto» triticale // Euphytica, 2004. 137. Р. 261-270.
12. DivashukM.G., Kroupin P.Yu., Soloviev A.A., Karlov G.I. Molecular Cytogenetic Characterization of the Spring Triticale Line 131/7 Carrying a Rye-Wheat Translocation // Russian
12
Journal of Genetics. 2010. 46(2). Р. 185-190. Дивашук М.Г., Крупин П.Ю., Соловьев А.А., Карлов Г.И. Молекулярно-цитогенетическая характеристика линии яровой тритикале 131/7, несущей ржано-пшеничную транслокацию // Генетика. 2010. Т. 46. № 2. С. 211-217.).
13. Friebe B., Jiang J., Raupp W.J., Mcintosh R.A., Gill B.S. Characterization of wheat-alien translocations conferring resistance to diseases and pets: current status // Euphytica. 1996. 91. Р. 59-87.
14. Kurkiev K.U. Inheritance of Plant Height in Hexaploid Triticales with R/D Substitution // Russian Journal of Genetics. 2008. 44. Р. 1080-1086. (Наследование высоты растения у гексаплоидных форм тритикале с замещением R/D // Генетика. 2008.).
15. Lapin D., DivashukM., Soloviev A. The identification of D-genome in some spring triti-cale lines // Acta Agriculturae Serbica, 2007. 12. Р. 41-50.
16. Lee J.H., Graybosch R.A., Lee D.J. Detection of rye chromosome 2R-using the polymerase chain reaction and sequence-specific DNA primers // Genome. 1994. 37. Р. 19-22.
17. Lijun H.U., Guangrong L.I., Haihian Z., Cheng L., Zujun Y. New chromosome-specific molecular markers for identifying wheat-Thinopyrum intermedium derivative lines // Journal of Genetics. 2012. 91. Р. 69-74.
18. Rebetzke G.J., RichardsR.A. Gibberellic acid-sensitive dwarfing genes reduce plant height to increase kernel number and grain yield of wheat // Aust J Agric Res. 2000. 51. Р. 235-245.
19. Worland A.J., Sayers E.J., Korzun V. Allelic variation at the dwarfing gene Rht8 locus and its significance in international breeding programmes // Euphytica. 2001. 119. Р. 150-155.
20. Worland A.J. The influence of flowering time genes on environmental adaptability in European wheats // Euphytica. 1996. 89. Р. 49-57.
DISTRIBUTION OF 2R/2D SUBSTITUTION IN SPRING HEXAPLOID TRITICALE (x TRITICOSECALE WITTM.)
A.D. KORSHUNOVA, M.G. DIVASHUK, G.I. KARLOV, А.А. SOLOVIEV
(Russian Timiryazev State Agrarian University)
The 2R/2D substitution is widespread among winter hexaploid triticale (AABBRR) varieties and lines [1, 14]. This substitution helps to solve many problems such as excessive plant height, preharvest sprouting and late maturity. Also 2D chromosome in the genome of winter hexaploid triticale increases the yield of this crop and the quality of the grains [2, 11, 14].
Effect of 2D chromosome may be caused by the presence of the gene Ppd-D1. The dominant allele of this gene, Ppd-D1a, reduces wheat height by 10 cm and provides drought resistance [19; 20]. Also, the presence of Ppd-D1a provides increased yield by 9% in regions with a long day and up to 50% in regions with a short day environment.
Distribution of 2R/2D substitution is widely studied among winter triticale varieties and lines [1, 2, 14]. But such studies have not been conducted among spring triticale varieties and lines. In this paper, we examined the collection of spring hexaploid triticale for presence of 2R/2D substitution.
Analysis of 86 spring hexaploid triticale samples revealed the presence of substitution 2R/2D in 17 samples, all of them are breeding lines. Commercial varieties in our research did not have this substitution. The Ppd-D1a allele in lines with the substitution 2R/2D was notfound. The substitution 2B/2D was found in one line.
13
Selection lines with 2R/2D and 2B/2D substitutions may be included in the scheme of crosses to carry allele Ppd-D1a, and to improve a number of agronomic characteristics of spring hexaploid triticale.
Key words: triticale, 2R/2D substitution, Ppd-D1, 2B/2D substitution, DNA markers.
Коршунова Анастасия Дмитриевна — асп. кафедры генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (г. Москва, ул. Тимирязевская, 49; e-mail: [email protected]).
Дивашук Михаил Георгиевич — к. б. н., ст. науч. сотр. Центра молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (г. Москва, ул. Тимирязевская, 49; е-mail: [email protected]).
Карлов Геннадий Ильич — д. б. н., руководитель Центра молекулярной биотехнологии биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (127550 Россия, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49; е-mail: [email protected]).
Соловьев Александр Александрович — д. б. н., проф., зав. кафедрой генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (г. Москва, ул. Тимирязевская, 49; е-mail: [email protected]).
Kоrshunоvа Аnаstаsiya Dmitriеvnа — Phd student of the department of genetics, biotechnology, plant breeding and seed production, Russian Timiryazev State Agrarian University (127550, Moscow, Timiryazevskaya street, 49; e-mail: [email protected]).
Divаshuk Mikhuil Gеorgiеvich — PhD in Biology, senior researcher of the Center of molecular biotechnology, Russian Timiryazev State Agrarian University (127550, Moscow, Timiryazevskaya street, 49; e-mail: [email protected]).
Каг1оу Gеnnаdiy Ilich — Doctor of Biological Sciences, Head of the Center of molecular biotechnology, Russian Timiryazev State Agrarian University (127550, Moscow, Timiryazevskaya street, 49; e-mail: [email protected]).
Sоlоviеv Аlеksаndr Аlеksаndrоvich — Doctor of Biological Sciences, professor, Head of the department of genetics, biotechnology, plant breeding and seed production, Russian Timiryazev State Agrarian University (127550, Moscow, Timiryazevskaya street, 49; e-mail: asoloviev70@ gmail.com).
14
