Распределение стабильных изотопов углерода в виноградном растении и в вине в зависимости от климатических факторов местности Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

^ ИННОВАЦИИ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЙ, МЕДИЦИНСКОЙ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ^ЩтШмЛ НОМЕРА^^^^^^^Ш

УДК 663.2/.3

Распределение стабильных изотопов углерода

в виноградном растении и в вине в зависимости от климатических факторов местности

Л.А. Оганесянц, д-р техн. наук, профессор, академик РАСХН, А.Л. Панасюк, Е.И. Кузьмина ВНИИ пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности А.М. Зякун, д-р биол. наук, профессор

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

В настоящее время в литературе имеется ряд теоретических и экспериментальных работ, в которых рассматриваются возможности использования стабильных изотопных атомов углерода и кислорода на уровне их природных концентраций для определения регионов происхождения виноградных растений и получаемых из них продуктов [1]. Особое внимание исследователей уделяется изучению факторов, определяющих диапазон вариаций 513С-характеристик изотопного состава углерода в продуктах переработки винограда, в частности, в винах [2]. Основные факторы, определяющие вариации рас-пространенностей изотопов углерода в продуктах виноградных растений: температурные условия и водный режим роста растений. При высоком количестве осадков (водный баланс положительный) величина 513С виноградного сахара из зрелых ягод свидетельствует о пониженном содержании изотопа 13С по сравнению с отрицательным водным балансом [1]. Аналогичная зависимость изотопных характеристик углерода была отмечена для этанола, полученного из виноматериала, при разных условиях роста виноградных растений (водный режим, температура и солнечные дни). Как и в случае сахаров, вариации значений 513С этанола находились в диапазоне от -29,4 до -22,6 %о и коррелировали с условиями роста растений: пониженное содержание 13С изотопа в этаноле отмечено при высоком количестве осадков и повышенное содержание 13С при меньшем количестве осадков, соответственно. Однако противоположная зависимость влияния водного режима на изотопные характеристики углерода этанола в винах была обнаружена на примере продуктов брожения виногра-

Ключевые слова: изотопный состав углерода; сорт винограда; этанол; почва; климат.

Key words: carbon isotope content; vine plant variety; ethanol; soil; climate.

да из трех винодельческих регионов Словении (сезоны 1996, 1997, 1998 г.) [3]. Так, изотопные характеристики углерода этанола (813С), полученного при ферментации винограда из областей с разным количеством осадков, показали, что содержание 13С изотопа было больше в этаноле из винограда, выращенного при более высокой влажности и повышенной температуре, по сравнению с виноградом из более засушливых и холодных мест. Было высказано мнение, что кроме условий, определяемых влажностью, важную роль в формировании изотопного состава углерода винограда и получаемых из него продуктов брожения играют температурные условия роста растений и их отдаленность от морской акватории. Самое высокое содержание изотопа 13С в винном спирте было обнаружено при ферментации винограда, выращенного в прибрежных влажных и теплых регионах Словении, которое составило 513С около -24 %, а самое низкое содержание этого изотопа наблюдали для винограда из восточной менее влажной и холодной части Словении (величина 513С этанола около -29 %). Также имеются сообщения о снижении содержания 13С в продуктах, получаемых из винограда в разных странах Европы при переходе от теплых к холодным областям роста растений [4].

Систематические исследования по изучению формирования изотопного состава углерода (13С/12С) основных

вегетативных органов виноградного растения, которые определяют изотопный состав углерода генеративных органов, не проводились. Как известно, органические компоненты одной части органов растения (корни, лоза) формируются в течение всего времени роста растения, а другой его части (листья, ягоды) являются сезонными образованиями. В процессе созревания виноградных ягод сахароза перемещается из листьев в ягоды и быстро превращается в глюкозу и фруктозу [5]. Принимая во внимание, что изотопный состав углерода сахаров содержит больше 13С по отношению к другим растительным компонентам (например, лигнин, каротеноиды, липиды, аминокислоты) [6], то соотношения содержания этого изотопа в листьях и ягодах может быть своеобразным показателем степени перехода сахаров из листьев в ягоды. В дополнение к этому изотопные характеристики углерода корневой системы и лозы, как компонентов многолетнего роста растения на соответствующих почвах, могут нести информацию о региональной принадлежности виноградного растения и, соответственно, о происхождения вина как продукта ферментации содержимого виноградных ягод.

В последние годы были проведены исследования, касающиеся измерения соотношений распространеннос-тей стабильных изотопов углерода (13С/12С) в почвах и ягодах виноградных растений, произрастающих на почвах южного региона России, с последующим анализом распределения этих изотопов в винах, как продуктах ферментации винограда [7-9]. Принимая во внимание данные [3, 4], отражающие зависимости формирования изотопного состава углерода компонентов виноградного растения и продуктов их ферментации от условий роста, крайне важным было изучить влияние этих условий на изотопные показатели углерода виноградных растений на примере двух винопроизводящих регионов России (Краснодарский край и Ростовская обл.).

В связи с этим целями работы были анализ влияния почвенно-кли-матических факторов и сортовых особенностей виноградных растений на распределение стабильных изотопных атомов углерода (13С/12С) в тканях отдельных их органов и оценка степени изменения этих показателей при сбраживании содержимого виноградных ягод в процессе производства вина.

В опытах использовали виноградные растения западноевропейских

генетически разных сортов Каберне Совиньон и Алиготе, произрастающие на почвах Краснодарского края и Ростовской области, а также автохтонные сорта Сибирьковый и Крас-ностоп Золотовский. В качестве анализируемых растительных объектов служили срезы скелетных корней и корневых волосков с глубины почвы около 10 см, срезы ткани лозы, листья и виноградные ягоды на период их технической зрелости.

Образцы почв отбирали из ризосферы растений на глубине 10-15 см. С целью исключения возможного влияния примесей бикарбоната и карбоната на определения изотопных характеристик органического вещества в почвах тестируемые образцы почв обрабатывали 10 %-ным водным раствором HCl.

Анализируемые виноматериалы из винограда сорта Алиготе были приготовлены путем брожения виноградного сусла, а сорта Каберне -брожением сусла на мезге. Брожение проводили в анаэробных условиях в закрытых сосудах, где метаболические газы и легколетучие продукты отводили через водный затвор, осуществляемый двумя барба-терами, заполненными дистиллированной водой. Между барбатерами располагали стеклянные ампулы-контейнеры для отбора проб метаболической двуокиси углерода, очищенной от возможных летучих водорастворимых примесей. Двуокись углерода в ампулах-контейнерах использовали для изотопного анализа углерода. Опыты проводили в трех параллельных повторах для каждого сорта винограда.

Определение распространенностей стабильных изотопов углерода в исследуемых образцах проводили с помощью двух масс-спектрометров Breath MAT Finnegan (Германия) и IRMS Delta V Advantage фирмы Thermo Fisher Scientific (Германия), специализированных для анализа распространенностей 13С/12С изотопов.

Характеристики изотопного состава углерода анализируемых образцов определяли в относительных единицах 513С (%о) в соответствии с известным выражением (1):

5"Собр=[(^бр- RсT)/RJ1000%°, (1)

где Rо6р и Rст- отношения распространенностей изотопов углерода 13С/12С в анализируемом образце и

международном стандарте соответ-

ственно.

В качестве стандарта по углероду

использовали лабораторный обра-

зец, тестированный в соответствии с

содержанием 13С изотопа в окамене-

лости Belemitella americana из формации Пи Ди верхнемелового периода (PDB - стандарт), Rct=0,00112372. Стандартная ошибка измерений изотопных характеристик (513С) составляла ±0,2 %0.

Определение изотопных характеристик этанола осуществляли в соответствии с «Методикой измерений отношения изотопов 13С/12С спиртов и сахаров в виноградных суслах и винах методом изотопной масс-спектрометрии» (свидетельство об аттестации № 01.00225/54-10 от 28.09.2010 г.).

Характеристики условий роста виноградных растений в сезоны 20082010 гг. в двух регионах России приведены в табл. 1. В сезон 2009 г. в Ростовской области виноградные растения росли в сравнительно засушливых условиях, т. е. при повышенной суммарной годовой температуре и при пониженном годовом количестве осадков по сравнению с сезонами 2008 и 2010 гг. Сезон 2010 г. был наиболее влажным и умеренно теплым. В Краснодарском крае сумма годовых осадков возрастала от сезона 2008 г. к сезону 2010 г. (табл. 1). Наиболее холодным при умеренной влажности был сезон 2009 г., засушливым и жарким отмечен сезон 2008 г., а сезон 2010 г. был наиболее влажным. Предполагалось, что годовая сумма осадков и годовая сумма активных температур коррелируют с количеством осадков и температурными условиями в период образования и созревания виноградных ягод. Поэтому отмеченные климатические особенности условий роста виноградных растений в Краснодарском крае и Ростовской области послужили основой для определения степени влияния температурного и водного режимов на формирование изотопных характеристик (513С) отдельных тканей растений и целевого продукта - натурального виноградного вина.

Величины 513С органических образцов, полученных из тканей виноградных растений (корень, лоза, листья) и из ягод, находились в диапазоне значений 513С от -29,9 до -25,42 % для Краснодарского края и в диапазоне от -30,6 до -26,0 % для Ростовской области соответственно. При этом величины 513С почвенного органического вещества (ПОВ), на которых произрастали анализируемые растения, имели практически одинаковые значения: 513СПОВ= -25,4±0,2 % (Краснодарский край) и 513СПОВ= -25,36±0,07 % (Ростов-ская обл.).

Виноград из Краснодарского края. В тканях и ягодах виноградных рас-

Таблица 1

Годовая сумма активных температур и годовая сумма осадков

Анали- Ростовская область Краснодарский край

зируемый год годовая сумма активных температур, °С годовая сумма осадков, мм годовая сумма активных температур, °С годовая сумма осадков, мм

2008 3560 446 4027 361

2009 3887 424 3800 380

2010 3860 586 3880 543

Краснодарский край

Каберне Совиньон

О 1 2 3 4 5 В 7 В fi 10 11 12 13

корень

Рис. 1. Вариации величины 8ВС (%) тканей виноградных растений (корень, лоза, лист) и ягод (сорт Алиготе и Каберне Совиньон), выращенных в условиях Краснодарского края: сезон 2008 г. сухой и жаркий; сезон 2009 г. холодный и умеренно влажный; сезон 2010 г. влажный и умеренно теплый (см. табл. 1)

тений сортов Алиготе и Каберне Совиньон, выращенных в Краснодарском крае, наблюдали четко выраженную неоднородность в распределении 13С изотопа: наибольшее содержание 13С изотопа обнаружено в корнях растений и лозе, а наименьшее в ягодах (рис. 1). При этом по мере увеличения суммы годовых осадков отмечено систематическое снижение содержания 13С изотопа в тканях корней и лозе растений. В отличие от этого изотопные характеристики углерода виноградных ягод демонстрируют иную зависимость. Так, сезонные температурные условия роста растений существенно влияют на содержание 13С изотопа в генеративных органах. Характеристики изотопного состава углерода ягод из виноградных сортов как Алиготе, так и Каберне Совиньон, выращенных в наиболее прохладном сезоне 2009 г., свидетельствуют о наименьшем содержании 13С изотопа по сравнению с урожаями сезонов 2008 г. (жаркий и засушливый) и 2010 г. (влажный и умеренно теплый). Различие в содержании 13С изотопа в ягодах и листьях сортов Алиготе и Каберне, как генетически

ИННОВАЦИИ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЙ, МЕДИЦИНСКОЙ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ

ТЕМА НОМЕРА

Ростовская область

и ю

2009

2010

2009 2010

2010

Клоерне Сопиньан Красмостоп

Алиготе Си6|фЬ«оаыЙ

2010

корень лоза лист ягода

Рис. 2. Вариации величины 8ВС (%) тканей виноградных растений (корень, лоза, лист и ягоды) сортов Алиготе, Каберне Совиньон, Сибирьковый и Красностоп Золотовский, выращенных в условиях Ростовской области: сезон 2009 г. сухой и жаркий; сезон 2010 г. влажный и умеренно теплый (см. табл. 1)

Краснодарский край

и

2008 2009 2010 Алиготе

200В 2009 2010 Каберне Совиньон

10 11 12 13 14 1$

I I н/продукгы ШШ ягоды

Рис. 3. Вариации величины 813С (%) этилового спирта и нелетучих продуктов (н/продукты) в винах Алиготе и Каберне Совиньон, урожаи 2008, 2009 и 2010 гг., Краснодарский край. Для сравнения приведены изотопные характеристики углерода виноградных ягод урожая соответствующих трех сезонов: сезон 2008 г. сухой и жаркий; сезон 2009 г. холодный и умеренно влажный; сезон 2010 г. влажный и умеренно теплый (см. табл. 1)

разных виноградных растениях, проявляется при их росте во влажных условиях сезона 2010 г. Известно, что характеристики изотопного состава углерода сахаров в растительных тканях свидетельствуют о значимо большем содержании 13С изотопа по сравнению с другими растительными компонентами, например, лигнином. В связи с этим повышенное содержание 13С изотопа в листьях Алиготе по сравнению с ягодами рассматривается как результат снижения транспорта сахарозы из листьев в ягоды во влажный период их роста. В то же время при росте растений сорта Каберне в тех же условиях

содержание 13С изотопа в ягодах и листьях не отличается друг от друга (см. рис. 1), что указывает на меньшее влияние влажных условий роста этих растений на транспорт сахарозы из листьев в ягоды.

Изотопные характеристики углерода этанола, полученного при брожении виноградного сусла и при брожении сусла на мезге, не коррелируют с суммарным изотопным составом углерода виноградных ягод, но находятся в удовлетворительном согласии с изотопными характеристиками нелетучих водорастворимых органических продуктов, включая органические кислоты, полифенолы, несброженные сахара (рис. 2). В вине сорта Алиготе, полученном из урожаев 2008, 2009 и 2010 гг., для которых отмечено возрастающее количество годовых осадков от сезона к сезону, величины 513С этанола и нелетучих органических продуктов свидетельствуют о снижении в них содержания 13С изотопа. Этот вывод согласуется с данными работ [1], где показано, что количество 13С изотопа в виноградном сахаре снижается по мере увеличения влажности в условиях созревания винограда.

На примере сорта Каберне Сови-ньон отмечен иной характер зависимости изотопного состава углерода этанола от влажности: содержание 13С изотопа в этаноле и нелетучих водорастворимых продуктах возрастает по мере увеличения количества годовых осадков (рис. 2). Этот вывод согласуется с данными другого сообщения [3], где показано, что этанол, выделенный из виноматери-ала, полученного при повышенной влажности, содержит больше 13С изотопа по сравнению с материалом при более низкой влажности. Таким образом, на примере анализа виноградных растений, растущих в течение трех сезонов в Краснодарском крае, показано, что водный баланс оказывает разное влияние на формирование изотопного состава углерода.

Виноград из Ростовской области. Изотопные характеристики углерода виноградных растений из другого винодельческого региона также свидетельствовали о выраженной неоднородности распределения 13С изотопа в образцах отдельных растительных тканях и ягодах, полученных из сортов виноградов Алиготе, Каберне Совиньон, Сибирьковый и Красностоп Золотовский (рис. 2). Анализ изотопного состава углерода виноградных растений показал, что содержание 13С изотопа в их анализируемых тканях и ягодах систематически снижается по мере увеличения

количества годовых осадков (сезон

2009 г. был сухим и жарким, а сезон

2010 г. - влажным и теплым). Обнаруженные изменения изотопных характеристик углерода указанных сортов виноградных растений в зависимости от влажности условий их роста в регионе Ростовской области также согласуются с данными для виноградных растений западноевропейских сортов [4]. В то же время изотопные характеристики углерода тканей и ягод сорта Алиготе, выращенного в том же регионе, демонстрируют совершенно противоположную тенденцию: с увеличением количества годовых осадков отмечено увеличение содержания 13С изотопа в общем углеродном пуле (рис. 3). Можно полагать, что отмеченная особенность в распределении изотопного состава углеродного пула виноградных растений сорта Алиготе по сравнению с сортами Каберне Совиньон, Сибирьковый и Красно-стоп Золотовский обусловлена их различной сортовой принадлежностью.

Изотопные характеристики углерода этанола в вине сорта Алиготе, полученном при брожении виноградного сусла, как и в случае Алиготе из Краснодарского края, свидетельствуют о снижении содержания 13С изотопа по мере увеличения влажности условий роста растений (рис. 4). Обратная зависимость между изотопными показателями углерода (513С) отмечена в случае этанола в вине сорта Каберне Совиньон, полученном при брожении сусла на мезге, где обнаруживается тенденция к увеличению содержания 13С изотопа в сезоны с повышенной влажностью. Аналогичная зависимость 513С для этанола, полученного из виномате-риала сорта Каберне Совиньон в Ростовской области, наблюдалась для виноматериала из Краснодарского края.

В табл. 2 представлены средние значения величины 513С этанола и нелетучих органических продуктов, которые содержатся в остатке виноградного вина после дистилляции этанола. Характеристики изотопного состава углерода этанола из винома-териалов Алиготе и Каберне Сови-ньон двух винодельческих регионов России свидетельствуют о систематическом увеличении количества 13С изотопа в этаноле по отношению к углероду нелетучих водорастворимых винных компонентов. В дополнение к этим продуктам приведены значения 513С метаболической двуокиси углерода, образующейся при получении анализируемых образцов виноматериала. Изотопные характе-

ристики углерода СО2, продуцируемой при брожении виноградного сахара, свидетельствуют о существенном обогащении 13С изотопом как относительно этанола, так и углерода нелетучих продуктов. Предполагается, что изотопные характеристики углерода нелетучих водорастворимых органических продуктов (например, пентоз) отражают изотопный состав углерода используемых сахаров при брожении винограда. В этом случае наблюдаемое различие изотопных характеристик углерода метаболической двуокиси углерода и нелетучего водорастворимого остатка вина согласуется с ранее обнаруженными характеристиками изотопного состава углерода, наблюдаемыми при росте дрожжей Candida lipolytica на глюкозе [12].

Принимая во внимание известную стехиометрию, отражающую продукцию двух молей этанола и двух молей СО2 при брожении одного моля глюкозы, были рассчитаны средние характеристики изотопного состава углерода виноградных сахаров в образцах сортов Алиготе и Каберне Совиньон по условиям материально-изотопного баланса (см. табл. 2). Легко видеть, что рассчитанные значения 513С сахаров являются пропорциональными величинам, измеренным для нелетучих водорастворимых продуктов в вине. Полученные расчетные данные согласуются с диапазоном значений 513С виноградных сахаров [1, 3].

Поскольку изотопные характеристики углерода нелетучих водорастворимых продуктов в вине отражают изотопный состав углерода сахаров, используемых при брожении винограда, то отмеченная разность в изотопных показателях углерода этанола и нелетучих продуктов может быть специфическом показателем его подлинности.

Анализ изотопных характеристик углерода (513С) западноевропейских сортов винограда Каберне Совиньон и Алиготе, а также автохтонных сортов Сибирьковый и Красностоп Зо-лотовский, произрастающих в двух винодельческих регионах России, показал, что факторами, определяющими отношения распространеннос-тей изотопов 13С и 12С в растительных тканях и ягодах, являются климатические условия роста: влажность (сумма годовых осадков) и температура (сумма годовых активных температур). Сортовая принадлежность растений также может определять величину 513С [1]. Для образцов тканей вегетативных органов изученных виноградных растений отмечено повышенное содержание 13С изотопа

по сравнению с генеративными органами - ягодами. Различие в содержании 13С изотопа в этаноле, полученном из виноматериала сортов Алиготе и Каберне Совиньон в двух виноградарских регионах России, обусловлено влажностью условий роста виноградных растений, их сортовой принадлежности. В то же время, на примере виноматериалов сортов Алиготе и Каберне Совиньон, полученных при брожении винограда урожая разных сезонов и в обоих винодельческих регионах России, зарегистрировано систематическое превышение величины 513С этанола на 2-3 %о относительно нелетучих водорастворимых органических продуктов в вине.

Таким образом, обнаруженная особенность распределения изотопов углерода в вине служит аналитически важным показателем его подлинности. Установление географического места происхождения вин должно сопровождаться дополнительным определением количественных и изотопных характеристик других химических элементов, содержащихся в вине, включая изотопы кислорода и водорода.

ЛИТЕРАТУРА

1. Gaudillere, J-P. Carbon isotope composition of sugars in grapewine an integrated indicator of vineyard water status/J.-P. Gaudillere, C. Van Leeuwen, N. Ollat//J. Experimental Botan. - 2002. - Vol. 53. - No 369. -P. 757-763.

2. Monetti, A. Classification of Italian vines on regional scale by means of a multi-isotopic analysis/A. Monetti, G. Versini, F. Reniero// Charalambous, G. Ed. Elsevir: Amsterdam. The Netherlands. -1995. - P. 1723-1730.

3. Determination of authenticy, regional origin and vintage of Slovenia wines using a combination of IRMS and SNIF-NMR analyses/N. Ogrinc [et al.]//J. Agric. Food Chem. - 2001. -Vol. 49. - P. 1432-1440.

4. Breas, O. Isotope Ratio mass spectrometry: analysis of wines from different European Countries/O. Breas, F. Reniero, G. Serrini//Repid Commun. Mass Spectrom. - 1994. -Vol. 8. - P. 967-970.

5. Davis, C. Sugar accumulation in grape berries. Cloning of two putative vacuole invertase cDNRs and their expression in grapevine tissues/C. Davis, S.P. Robinson//Plant Physiology. - 1996. - Vol. 111. - P. 275-283.

6. Whelan, T. Carbon isotope discrimination in a plant possessing the

Краснодарский край

2008 2009 201Û Алиготе

200S 2009 2010 Каберне Совиньон

10 t1 12 13 14 1$

I I н/пропукты ШШ ягоды

Рис. 4. Вариации величины 8ВС (%) этилового спирта и нелетучих продуктов (н/продукты) в винах Алиготе и Каберне Совиньон, урожаи 2009 и 2010 гг., Краснодарский край). Для сравнения приведены изотопные характеристики углерода виноградных ягод урожая соответствующих двух сезонов: сезон 2009 г сухой и жаркий; сезон 2010 г. влажный и умеренно теплый (см. табл. 1)

Таблица 2

Величины 513С, характеризующие средний изотопный состав углерода продуктов брожений сусла и мезги винограда (урожаи сезонов 2008, 2009 и 2010 гг.)

Продукт

S13C, %о

Алиготе

Каберне Совиньон*

Виноградный этанол Нелетучие продукты Метаболическая СО2 ***Виноградный сахар

-27,0 (0,96)** -27,4 (0,50)

-27,9 (0,60) -28,4 (0,70)

-20,6 (0,30) -20,8 (0,34)

-24,9 (0,7) -25,2 (0,5)

* Красное вино Каберне Совиньон получали

брожением мезги без отделения сусла. **В скобках приведен стандартный доверительный интервал. ***Изотопные характеристики углерода рассчитаны согласно материально-изотопному балансу:

S13C( )= (4-S13C )

_(сахар) 4_(этанол)

+ 2-S13CœJ/6.

C4 dicarboxylic acid pathway/ T. Whelan, W.M. Sackett, C.B. Bene-dict//Biochem. Biophys. Research Commun. - 1970. - Vol. 41. - No 5. -P. 1205-1210.

7. Изучение распределения 13С/12С изотопов в виноградных растениях Краснодарского края/Л.А. Огане-сянц [и др.]//Хранение и переработка сельхозсырья. - 2010. - № 1. -С. 29-31.

8. Соотношение стабильных изотопов углерода в винограде и вине для подтверждения их аутентичнос-ти/Л.А. Оганесянц [и др.]//Пиво и напитки. - 2010. - № 2. - С. 20-21.

9. Влияние почвенно-климатичес-

ких факторов и сортовых особенностей винограда на соотношение 13С/

12С изотопов/Л.А. Оганесянц [и др.]//

Виноделие и виноградарство. -

2010. - № 5. - С. 30-32.