CC BY
16
ЛИТЕРАТУРА
1. Антонова И.Н. Роль нарушений психологической адаптации в патогенезе хронических воспалительных заболеваний па-родонта у спортсменов: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. СПб, 2008, 35 с.
2. Афанасьева И.А. Показатели неспецифической защиты у спортсменов при интенсивных физических нагрузках / Материалы Первого международного конгресса «Термины и понятия в сфере физической культуры». СПб, 2007, с. 17-20.
3. Геселевич В.А. Актуальные вопросы спортивной медицины. М.: Сов. спорт,2004,231 с.
4. Гребняк В. П. Проблемы функционального контроля при подготовке спортсменов // Теория и практика физического воспитания, 2005, № 3, с.141-144.
5. Хаитов Р.М. Диагностика, мониторинг и коррекция иммунодефицитных состояний у высококвалифицированных спортсменов: метод. рекомендации. М., 2012, 40 с.
6. Koch A.J., Wherry A.D., M.C. Petersen Salivary immunoglobulin A response to a collegiate rugby game // J. Strength. Cond. Res., 2007, vol.21, N 1, p.86-90.
7. Розанов Н.Н. Особенности воспалительных заболеваний пародонта у представителей разных видов спорта // Пародонто-логия, 2009, № 4, с. 42-45.
8. Karacabey K., Saygin O., Ozmerdiventi R.The effects of exercise on the immune system and stress hormones in sportswomen // Neuro Endocrinol. Lett., 2005, vol. 26, p. 361366.
SUMMARY Physiological criteria for intensive training loads in the sphere of sports F.Safaraliyev, G.Huseynova, V.Hasanov, A.Arkhmamedov Azerbaijan Medical University, Baku
Among oral diseases in athletes in different age groups, significant differences were observed in the prevalence of certain forms of periodontal disease. In assessing the intensity of destruction of periodontal tissues according to CPITN index in the examined professional athletes in the oldest age group is more likely to have moderate and severe periodontitis. Identified among athletes high percentage incidence of inflammatory periodontal diseases indicates a high level of need for periodontal care. With the development of overtraining syndrome in professional athletes showed a significant reduction of all identified immunoglobulin in the saliva and increase the level of pro-inflammatory cytokines.
_Поступила: 13.03.2017
Распределение отдельных молекул ферритина в различных компартментах клеточных элементов свободной части десны у больных с р-талассемией
Э.К.Гасымов, Р.В.Шадлинская, Т.Г.Гусейнова
С.А.Исрафилова, И.Б.Садиги
Азербайджанский медицинский университет, г.Баку
Железо, является одним из самых распространенных микроэлементов в живых организмах, дефицит и избыток которого сопровождаются системными нарушениями функций различных органов. Если дефицит железа сопровождается уменьшением
транспорта кислорода и пониженной активностью Fe-зависимых ферментов [1], то его избыток может катализировать оксидатив-ный стресс, перекисное окисление липидов и повреждение ДНК [2,3], что в конечном итоге ставит под угрозу жизнеспособность
клеток и способствует программируемой клеточной смерти [4].
Обычно ферритин считается цитоплазма-тическим белком, однако, как при нагру-женности организма железом [5] так и в норме в ядре эпителиальных клеток роговицы птиц [6], в нейронах [7], в опухолевых клетках астроцитомы [8] обнаружено наличие ферритина.
Анализ литературных данных [9] позволяет заключить, что хотя в доставке молекул ферритина в матрикс лизосом есть определенная ясность, но в отношении его перемещения от цитоплазмы к нуклеоплазме существует ряд нерешенных вопросов.
ЦЕЛЬЮ данного исследования является выявление фактов наличия неравномерного распределения молекул ферритина в цито-и нуклеоплазме клеточных элементов свободной части десны у больных с ß-талассемией.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Проведено электронно-микроскопическое исследование биоптатов десны (у 18-и пациентов) больных с хроническим гингивитом, полученных по строгим медицинским показаниям под проводниковой анестезией. С этой целью после удаления зуба отсекали фрагмент слизистой оболочки оральной поверхности десны.
Полученный материал фиксировался смесью 2% параформальдегида, 2% глютараль-дегида и 0,1% раствора осмиевой кислоты на фосфатном буфере. После последующей постфиксации, проводимой в течение 2х часов в растворе осмиевой кислоты на фосфатном буфере [Ph 7,4], из материалов были приготовлены принятые в электронной микроскопии блоки Аралдит-Эпон и Спурр. Из данных блоков при помощи ультратома Leica EM UC7 были приготовлены последовательно срезанные ультратонкие срезы толщиной 35-70 нм, для исследования на трансмиссионном электронном микроскопе JEM 1400 (JEOL-Japan). Одна часть из них не была окрашена, другая часть была окрашена 2% раствором уранил цитрата и 0,6% раствором чистого цитрата свинца на 0,1М растворе NaOH, при исследовании которой на электронном микроскопе при ускоряю-
щем напряжении 80-120 кВ были сфотографированы электронограммы.
Скопления молекул ферритина выявляются с помощью гистохимического метода по Перлсу. Для этого полутонкие срезы толщиной 1 мкм фиксируются на предметное стекло при помощи его нагрева. До начала окрашивания препаратов для подготовки и к проведению гистохимических исследований проводится деэпонизация срезов. Для этого срезы в течение 30 мин находятся в растворе NaOH + этанол (100%) (приготовление раствора: 20 мл этанола + 4г NaOH, получаем насыщенный раствор. Далее к 5 мл данного насыщенного раствора добавляется 5 мл этанола (100%)). После образцы поочередно на 3-5 мин опускаются в спирты в убывающей концентрации (96°, 70°, 50°) и в течение 3-х минут промываются дистиллированной водой и просушиваются. Окрашивание проводится при помощи Прусской синей (0.5 мл 2%-х ферроцианид калия + 0.5 мл 2%-х HCl). В данном растворе образец находится 30 мин. Далее в течение 2-х минут промывается дистиллированной водой. После просушивания на образцы накапывается раствор Ван Гизона и оставляется на 10 минут. Далее после промывания и просушивания на образцы наносится покровный реагент (Eukritt), накрываются покровным стеклом, изучаются и фотографируются под микроскопом Latimet (Leitz) c помощью цифровой фотокамеры Canon.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Значительное преобладание количества молекул ферритина в цитоплазме, по сравнению нуклеоплазмой некоторых макрофагов в очаге нейтрофильно-макрофагальной инфильтрации в стадии обострения хронического катарального гингивита у больных с ß-талассемией было отмечено нами как на светооптическом (рис.1), так и на ультраструктурном уровнях (рис.2А). Причем, создается впечатление, что количество молекул ферритина намного больше в цитоплазме, чем в нуклеоплазме. Однако, следует подчеркнуть, что на светооптическом уровне несмотря на выявление резко положительной реакции берлинской лазури по всей поверхности сечения цитоплазмы макрофа-
га, в его ядросодержащей части (рис. 1 - показано стрелкой) наличие или отсутствие молекул ферритина определить не удается. При этом как видно из рис.2Б, без учета ферритиновых молекул, расположенных внутри лизосом (сидеросом), в количестве цитоплазматического и внутриядерного ферритина у базального эпителиоцита существенных различий не обнаруживается. В то же время, несмотря на наличие в составе цитоплазмы макрофагов ферритиновых моле-
кул в огромном количестве (рис.2А), их намного меньше, чем на даже сравнительно большой поверхности поперечного сечения ядра. Таким образом, можно заключить, что у больных с Р-талассемией отсутствуют какие-либо пропорциональные взаимоотношения в распределении ферритиновых молекул между цито- и нуклеоплазмами различных типов клеток в составе свободной части десны.
Рис. 1 Неравномерное распределение ферритина в структурных элементах собственной пластинки десны у больных с Р-талассемией. Объяснение дано в тексте. Полутонкий срез, окрашенный с помощью гистохимической реакции берлинской лазури по Перлсу
и докраской Ван_Гизоном. Увел.: х1000.
Одним из основных отличительных признаков эукариотов является наличие между цито- и нуклеоплазмами ядерной оболочки с ядерными порами, которые снабжены комплексами ядерных пор, состоящих из около 30 нуклеопоринов и связанных с ними 18 гликопротеинов [10]. Необходимо отметить, что диаметр самих ядерных пор колеблется от 70 до 100 нм, а за счет наличия комплекса ядерных пор, сужаясь, превращается в канал в 9 нм с длиной 45 нм [11], каждый из которых может обеспечить перенос до 1000 макромолекул в секунду [12], опосредуя весь транспорт между цитозолем и ядром [13].
Импорт/экспорт через комплекс ядерной поры различных веществ, в том числе молекулы ферритина, может быть осуществлен, в основном, тремя способами: обычной диффузией; облегченной диффузией и с помо-
щью специальных шаперонов для феррити-на [14].
Обычная (пассивная) диффузия ядерного порового комплекса возможна для ионов, метаболитов и малых макромолекул с диаметром 9 нм и молекулярной массой до 40 кДа [10,11]. Учитывая, что средний диаметр молекул ферритина в среднем равен 11± нм [15], а молекулярная масса примерно в 11 раз больше - 450 кДа [16], чем пропускная способность ядерного порового комплекса для макромолекул, это делает невозможным вхождение молекул ферритина в состав нуклеоплазмы с помощью обычной диффузии.
С помощью облегченной диффузии (механизма) между ядром и цитоплазмой могут транспортироваться гораздо более крупные белки, диаметром до 39 нм [17]. Однако, для этого транспортируемый белок в одном
из концов должен содержать сигнал ядерной локализации (nuclear localization signal, NLS), состоящий из одного или двух кластеров положительно заряженных аминокислотных последовательностей - в основном остатков лизина и аргинина [20]. Белок, имеющий NLS, входя в молекулярное взаимодействие с транспортными факторами, перемещается в ядро по Ran-зависимому механизму [10,18].
Cai CX, Linsenmayer TF (2001) используя современные методы генной инженерии (технология рекомбинантной ДНК) установили, что удаление (делеция) 10 остатков аминокислот из начальной части и 30 остатков из концевой части Н ферритина не мешает его вхождению в состав нуклеоплазмы эпителиальных клеток роговицы птиц. Однако более крупная делеция этих частей или же делециия молекулы Н ферритина по длине останавливает его транслокацию в ядро эпителиальных клеток роговицы. Таким образом авторы впервые установили, что обнаруживаемые в составе нуклеоплазмы молекулы Н ферритина, являющиеся основной субъединицей, не имеют аминокислотной последовательности характерной для NLS, т.е. они не могут перемещаться в ядро по Ran-зависимому механизму. Как отмечалось выше, Thompson KJ, Fried MG, Ye Z, Boyer P, Connor JR.(2002) обнаружили наличие молекул ферритина в ядре опухолевых клеток астроцитомы. Авторы, изучая действие различных факторов на ядерную транслокацию FITC-меченого rH-ферритина установили, что N-этилмалеимид (НЭМ), являющийся ингибитором NLS [20], не препятствует его перемещению в нуклеоплаз-му, а апирaза (АТФ-дифосфогидролаза), участвующая в гидролизе АТФ с выделением энергии, значительно способствует данному процессу. Учитывая вышеизложенное авторы предполагают, что перемещение Н-ферритина в нуклеоплазму носит активный (энергозависимый) характер и происходит через ядерный поровый комплекс.
В дальнейшем группа авторов [21], также под руководством профессора JR Connor, выявили ряд новых фактов:
- показали, что цитоплазматическая и ядерная формы H-ферритина клеток астроцитомы человека транслируется с участием одного и того же мРНК
- с помощью гистохимических и биохимических методов они установили, что количество О-гликозированной формы Н-ферритина значительно больше в ядре, чем в цитоплазме;
- отметили, что клетки, обработанные ал-локсаном, мощным ингибитором O-гликозилирования, содержали значительно меньше ядерного Н-ферритина по сравнению с клетками, выращенными в контрольных средах.
На основании этого данные авторы пришли к заключению о том, что O-глико-зилирование Н-ферритина непосредственно участвует в переносе его из цитоплазмы в ядро клеток астроцитомы человека.
Среди опубликованных работ касательно механизма транслокации цитоплазматиче-ского ферритина в ядро клеток, определенный интерес представляют работы, выполненные под руководством профессора TF Linsenmayer [22,23]. Авторы обнаружили, что в эпителиальных клетках роговицы птиц ферритин преимущественно имеет не цито-плазматическую, а нуклеарную локализацию. Они впервые обнаружили специальный транспортер, участвующий в переносе ферритина из цитоплазмы к ядру клеток и назвали его ферритоидом, который структурно содержит несколько доменов, включая функциональный сигнал ядерной локализации (NLS) и ферритинподобную область, приблизительно на 50% идентичную с самим ферритином. На наш взгляд самым интересным фактом, полученным авторами является то, что молекулярный вес нуклеар-ного ферритоидно-ферритинового комплекса примерно вдвое меньше (260 кДа) цито-плазматического ферритина. Таким образом, можно заключить, что ферритоид не участвует в переносе самого цитоплазматическо-го ферритина.
Рис. 2. Сравнительная характеристика распределения ферритовых молекул в цитозоле и нуклеоплазме базального эпителиоцита (А) и макрофага (Б) свободной части десны у больных с Р-талассемией. Объяснение дано в тексте. А и Б электронограммы неокрашенных ультратонких срезов (начальное увеличение- х 100000).
Отличительную позицию в отношении транслокации молекулы ферритина в нук-леоплазму клеток имеет профессор 1апси ТС с соавторами [24]: по мнению авторов пока не будет доказано, что ферритин может быть сформирован внутри самой нуклео-плазмы, интрануклеарные депозиты ферритина останутся «интерпозиционным артефактом».
В заключении следует подчеркнуть, что выяснение молекулярных механизмов ультраструктурных перестроек в формировании вне- и внутриклеточной транспортировки, способов хранения, а также путей, обеспечивающих биодоступность ферритина, позволяет значительно увеличить возможности диагностики, профилактики и лечения гемохроматозных состояний, в том числе и в-талассемии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Gozzelino R., Arosio P. Iron Homeostasis in Health and Disease // Int J Mol Sci., 2016, 17(1), p.1-14.
2. Zhang C. Essential functions of iron-requiring proteins in DNA replication, repair and cell cycle control // Protein Cell., 2014, vol.5(10), p.750-760.
3. Paul V.D., Lill R. Biogenesis of cytosolic and nuclear iron-sulfur proteins and their role in genome stability // Biochim Biophys Acta., 2015, vol.1853(6), p.1528-39.
4. Arosio P., Carmona F., Gozzelino R. et al. The importance of eukaryotic ferritins in iron handling and cytoprotection // Biochem J., 2015, v.472(1), p.1-15.
5. Smith A.G., Carthew P., Francis J.E. et al. Characterization and accumulation of ferritin in hepatocyte nuclei of mice with iron overload // Hepatology, 1990, vol.12(6),p.1399-405.
6. Cai C.X., Birk D.E., Linsenmayer T.F. Ferritin is a developmentally regulated nuclear protein of avian corneal epithelial cells // J Biol Chem., 1997, vol.272(19), p.12831-9.
7. Cheepsunthorn P., Palmer C., Connor J.R. Cellular distribution of ferritin subunits in
postnatal rat brain // J Comp Neurol., 1998, vol.400(1), p.73-86.
8. Thompson K.J., Fried M.G., Ye Z. et al. Regulation, mechanisms and proposed function of ferritin translocation to cell nuclei // J Cell Sci., 2002, vol.115(Pt 10), p.2165-77.
9. Mancias J.D., Wang X., Gygi S.P. et al. Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy // Nature, 2014, vol.509(7498), p.105-9.
10. Suntharalingam M., Wente S.R. Peering through the pore: nuclear pore complex structure, assembly, and function // Dev Cell, 2003, vol.4(6), p.775-89.
11. Macara I.G. Transport into and out of the nucleus // Microbiol Mol Biol Rev., 2001, vol.65(4), p.570-94,
12. Smith A.E., Slepchenko B.M., Schaff J.C. et al. Systems analysis of Ran transport // Science, 2002, vol.295(5554), p.488-91.
13. Liashkovich I., Meyring A., Kramer A. et al. Exceptional structural and mechanical flexibility of the nuclear pore complex // J Cell Physiol., 2011, vol.226(3) p.675-82.
14. Alkhateeb A.A., Connor J.R. Nuclear ferritin: A new role for ferritin in cell biology // Biochim Biophys Acta, 2010, vol.1800(8), p.793-7.
15. Iancu T.C. Ferritin and hemosiderin in pathological tissues // Electron Microsc Rev. 1992, vol.5(2), p.209-29.
16. Theil E.C. Ferritin: structure, gene regulation, and cellular function in animals, plants, and microorganisms // Annu Rev Bio-chem., 1987, vol.56, p.289-315.
17. Pante N., Kann M. Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm // Mol Biol Cell., 2002, vol.13(2), p.425-34.
18. Сорокин А.В., Ким Е.Р., Овчинников Л.П. Ядерно-цитоплазматический транспорт белков // Успехи биологической химии, 2007, т. 47, с. 89-128.
19. Cai C.X., Linsenmayer T.F. Nuclear translocation of ferritin in corneal epithelial cells // J Cell Sci., 2011, vol. 114(Pt 12), p.2327-34.
20. Deugnier Y., Turlin B., Loreal O. Iron and neoplasia // J Hepatol., 1998, vol.28 Suppl 1, p.21-5
21. Surguladze N., Patton S., Cozzi A. et al. Characterization of nuclear ferritin and mechanism of translocation // Biochem J., 2005, vol.388(Pt 3), p.731-40.
22. Linsenmayer T.F., Cai C.X., Millho-lland J.M. et al. Nuclear ferritin in corneal epithelial cells: tissue-specific nuclear transport and protection from UV-damage // Prog Retin Eye Res., 2005, vol.24(2), p.139-59.
23. Nurminskaya M.V., Talbot C.J., Nur-minsky D.I. Nuclear ferritin: a ferritoid-ferritin complex in corneal epithelial cells // Invest Ophthalmol Vis Sci., 2009,vol.50(8),p.3655-61.
24. Iancu T.C., Arad T., Shams I., Manov I. Iron-rich ferritin in the hypoxia-tolerant rodent Spalax ehrenbergi: a naturally-occurring bio-marker confirms the internalization and pathways of intracellular macromolecules // J Struct Biol., 2014, vol.187(3), p.254-65.
SUMMARY Distribution of individual molecules of ferritin in various compartments cellular
elements on the free part of the gums in patients with p-thalassemia E.Gasimov, R.Shadlinskaya, T.Huseynova, S.Israfilova, I.Sadiqi Azerbaijan Medical University, Baku
The purpose of this study is to identify the presence of uneven distribution of ferritin molecules in the cytoplasm and nucleoplasm of cellular elements of the free part of the gum in patients with p-thalassemia. Histochemical and electron microscopic study of gingival biopsy samples from 18 patients with chronic hypertrophic gingivitis, received on strict medical indications under conduction anesthesia was carried out. The data obtained show that the aid of the histochemical method identification with the help of berlin azure by Perls, was detected not the individual molecules of ferritin, but either their dense cluster, or its denatured form -hemosiderin. The presence of individual ferritin molecules in the nucleoplasm was found only at the ultrastructural level, and in the composition of all cellular elements of the free part of the gum in patients with p-thalassemia. It is not possible to reveal any proportional relationships in the amount of ferritin molecules between the cytoplasm and nucleoplasm of the studied cell types.
Поступила: 03.04.2017
