CC BY
71
■ И I II II
■тп
Новости клеточных технологий
Раскрыт механизм старения нейральных стволовых клеток
Нейральные столовые клетки (НСК) расположены в субвентрикулярной зоне боковых желудочков мозга млекопитающих. В отличие от дифференцированных клеток нервной ткани, НСК способны дифференцироваться в любой из двух основных типов нервных клеток (нейроны и клетки глии — астроциты и олигодендроциты). Такие свойства, как дифференцировка и самообновление, позволяют НСК участвовать в репарации нервной ткани [1]. К сожалению, способность НСК и стволовых клеток других типов к самообновлению ухудшается по мере старения организма [2].
На данный момент известно несколько генов, экспрессия которых необходима стволовым клеткам для самообновления. Например, продукт гена Bmi1 необходим для самообновления стволовых кроветворных клеток (СКК) и НСК во взрослом организме [3, 4]. Функция Bmi1 заключается в репрессии локуса INK4a/ARF (называемого также CDKN2A), кодирующего два ингибитора клеточного цикла — INK4a и ARF. Данный локус должен быть выключен в СКК и НСК, поскольку самообновление стволовой клетки подразумевает прохождение через клеточный цикл.
По мере старения организма уровень экспрессии локуса INK4a/ARF повышается, делая невозможным самообновление стволовых клеток. Учитывая, что уровень экспрессии Bmi1 на протяжении жизни практически не меняется, ген, отвечающий за возрастное уменьшение потенциала самообновления до последнего времени оставался загадкой.
Поиском данного гена занялась группа ученых под руководством Шона Моррисона. Ученые решили начать поиск со стволовых клеток крови, поскольку наличие хорошо охарактеризованных поверхностных маркеров позволяет выделить эти клетки в чистом виде, используя метод FACS.
Ученые выделили СКК из печени эмбриона мыши (популяция Thy-1 l0WSca-1 +Lineage~Mac-1 +), костного мозга новорожденных и взрослых мышей (популяция Thy-1l0WSca-1 +Lineage~Mac-1 +c-kit+) и проанализировали их профили транскрипции. Для этого из СКК выделили РНК, провели обратную транскрипцию и амплификацию, после чего подвергали гибридизации с олигонуклеотидными экспрессионными биочипами (Аффиметрикс).
Сравнение транскриптомов «молодых» и «старых» СКК показало, что лишь один ген — Hmga2, активно экспрессируется в СКК эмбриона и постепенно ингибируется по мере старения мыши. Используя метод количественной ПЦР, ученые обнаружили аналогичную закономерность в экспрессии Hmga2 в НСК. Таким образом, изменение уровня экспрессии гена Hmga2 с возрастом являются общей чертой по крайней мере двух типов стволовых клеток.
Ген Hmga2 (High Mobility Group AT-hook 2) кодирует белок, ассоциированный с хроматином за счет своего ДНК-связывающего домена. Белок Hmga2 входит группу HMG-белков, функция которых заключается в организации структуры хроматина и контроле экспрессии генов. Ранее было показано, что мутации в гене HMGA2 человека оказывают влияние на рост индивидуума [5]. Это наблюдение подтвердилось и на мышиной модели. Мыши с нокаутом гена Hmga2 (Hmga2~;~) жизнеспособны, однако меньше по размеру и развиваются медленнее,
чем мыши дикого типа. Все это указывает на то, что Hmga2 может играть важную роль в развитии организма. Но какую? Ученым из группы Шона Моррисона удалось ответить на этот вопрос: фактор Hmga2, как и Bmi1, ингибирует экспрессию локуса INK4a/ARF. Если в «молодых» НСК много Hmga2 и мало INK4a и ARF, то в «старых» НСК количество Hmga2 уменьшается, a INK4a и ARF возрастает. Такая закономерность может объяснить почему по мере старения НСК теряют способность к самообновлению.
Для того, чтобы подтвердить предполагаемую роль гена Hmga2 в функционировании стволовых клеток ученые выделили НСК из Hmga2~;~ мыши и проверили их способность к дифференцировке и самообновлению in vitro. В отличие отдифференцированных клеток нервной ткани, НСК, помещенные в чашку с ростовой средой, продолжают делиться и образуют шарообразные колонии (нейросферы). По размеру нейросфер можно судить о потенциале самообновления НСК. В то же время, НСК способны к спонтанной дифференцировке в культуре. По количеству и соотношению дифференцированных клеток в культуре нейросфер можно судить о потенциале дифференцировки НСК (подробнее см. [BD, Ученые обнаружили, что Hmga2^- НСК обладают таким же потенциалом дифференцировки, что и НСК дикого типа, однако образуют нейросферы меньшего размера. Это означает, что при отсутствии гена Hmga2 у нейральных стволовых клеток ухудшается способность к самообновлению.
К аналогичным выводам ученые пришли, изучая Hmga2~A НСК in vivo. НСК являются единственными митотическими активными клетками нервной ткани, благодаря чему их можно легко выявить с помощью специальной метки — бромдезоксиуридина (БрДУ). БрДУ представляет собой нуклеотидный аналог, способный включаться в цепь ДНК во время репликации. Таким образом, добавив в рацион мыши БрДУ, можно пометить все делящиеся клетки, в том числе и НСК. Ученые окрасили срезы мозга Hmga2_/_ мышей и мышей дикого типа с помощью специальных антител против БрДУ и обнаружили, что количество митотически активных клеток в субвентрикулярной зоне мозга уменьшается при отсутствии Hmga2. Таким образом, Hmga2 влияет на пролиферативный потенциал НСК in vivo.
Если функция Hmga2 заключается в инактивации ингибиторов клеточного цикла, закодированных в локусе INK4a/ARF, то можно предположить, что делецию Hmga2 можно компенсировать, дополнительно удалив данный локус. И действительно, было показано, что у двойного нокаута Hmga2~;~ INK4a/ARF~~;~ количество НСК в субвентрикулярной зоне мозга такое же, как у дикого типа.
Как же регулируется экспрессия гена Hmga2? Оказывается, в этом процессе участвуют микро-РНК. В нетранслируемой 3’-области гена Hmga2 расположены сайты узнавания микро-РНК let-7. Ученые измерили экспрессию let-7 и обнаружили, что экспрессия этой микро-РНК в НСК мышей увеличивается с возрастом.
Таким образом, группа Моррисона предлагает следующую модель. В стволовых клетках зародышей и молодых особей интенсивно экспрессируется ген Hmga2, который выключает ингибиторы клеточного цикла ARF и INK4a и позволяет клеткам делиться. По мере старения
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 1, 2009
I I I I I I
■ I I I
Новости клеточных технологий
стволовых клеток активируется микро-РНК \et-7, которая ингибирует экспрессию гена Нтда2. Выключение гена Нтда2 приводит к активации АВР и 11\1К4а, остановке клеточного цикла и потере стволовыми клетками способности к самообновлению (рис.).
В чем заключается биологический смысл такой регуляции? Возможно, ограничивая потенциал пролиферации стволовых клеток по мере их старения и тем самым принося в жертву способность тканей к восстановлению, природа пытается предотвратить неконтролируемый рост. С возрастом в клетках накапливаются мутации, поэтому рано или поздно стволовая клетка превратится в раковую, если, конечно, нет механизмов вовремя остановить ее деление. Такое объяснение кажется тем более вероятным, что известно, что Нтда2 является протоонкогеном. Перестройки гена Нтда2 характерны для некоторых раковых заболеваний. Примечательно, что при этом ген Нтда2 теряет участок комплементарный микро-
РНК \et-7 и избавляется при этом от \et-7 зависимой репрессии [7].
Итак, группа Шона Моррисона продемонстировала новый механизм регуляции стволовых клеток мыши. Однако, на ряд вопросов так и не получено ответов. Например, работает ли этот механизм у человека? Если да, то можно ли его обойти? Почему экспрессия \et-7 увеличивается с возрастом?
Шон Моррисон также сохраняет молчание по поводу возможного применения результатов исследования в медицине. Кажется очевидным, что отключая Нтда2-зависимый механизм контроля самообновления НСК, можно спровоцировать рак. Однако, если выключить этот механизм локально и на короткое время, недостаточное для трансформации стволовых клеток в раковые, то может быть, получится добиться восстановления поврежденной ткани у пожилых пациентов. Осуществимо ли это, покажут результаты будущих исследований.
Модель влияния возраста на потенциал самообновления нейральных стволовых клеток, предложенная группой доктора Ш, Моррисона. В НСК мыши с возрастом увеличивается экспрессия микро-РНК let-7, что приводит к уменьшению экспрессии гена Hmga2. Hmga2 ингибирует экспрессию локуса INK4a/ARF. В результате, с возрастом у НСК увеличивается экспрессия ингибиторов клеточного цикла ARF и \NK4a, что приводит к снижению потенциала самообновления
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009
■ И I II II
■тп
Новости клеточных технологий
ЛИТЕРАТУРА:
1. Basak О., Taylor V. Stem cells of the adult mammalian brain and their niche. Cell Mol. Life Sci. 2008 Nov 18. Epub ahead of print.
2. Beausejour C.M., Campisi J. Ageing: balancing regeneration and cancer. Nature 2006; 443(7110): 404—5.
3. Lessard J., Sauvageau G. Bmi-1 determines the proliferative capacity of normal and leukaemic stem cells. Nature 2DD3; 423(6937): 255-60.
4. Molofsky A.V., PardalR., Iwashita T., Park I.K., Clarke M.F., Morrison
S.J. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature 2DD3; 425(6961): 962—7.
5. Weedon M.N., Lettre G., Freathy R.M. et al. A common variant of HMGA2 is associated with adult and childhood height in the general population. Nature genetics 2DD7; 39(101: 1245—50.
6. Vescovi A.L., Galli R., Reynolds B.A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer 2006; 6(B): 425—36.
7. Fusco A., Fedele M. Roles of FIMGA proteins in cancer. Nature Reviews Cancer 2007; 7(121: 899—910.
8. Nishino J., Kim I., Chada K., Morrison S.J. Flmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16lnk4a and p19Arf expression. Cell 2008; 135(21: 227—39.
Порготовип П.В. Дмитриев
По материалам: Nishino J„ Kim I., Chada K„ Morrison S.J, Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16lnk4a and p19Arf expression. Cell 2008; 135(2): 227-39
Ограниченный туморогенный потенциал С034+С038+ трансформированных клеток при остром миелобластном лейкозе является артефактом
В исследованиях последних лет было обнаружено, что в составе общей массы трансформированных клеток при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) у человека существует малочисленная популяция лейкозных стволовых клеток (ЛСК). Серийная трансплантация именно этой популяции клеток приводит к возникновению ОМЛ у иммунодефицитных мышей-реципиентов, тогда как туморогенный потенциал других популяций опухолевых клеток ограничен [1]. ЛСК имеют фенотипическое и функциональное сходство со стволовыми кроветворными клетками (СКК) и, как было показано, обладают большой резистентностью к применяемой для лечения ОМЛ химиотерапии и, вероятно, являются источником рецидивов [2]. В связи с этим, ЛСК привлекли особое внимание ученых и клиницистов, так как разработка методов терапии, направленных на их уничтожение, может привести к революции в лечении ОМЛ, а также целого ряда других гематологических и солидных злокачественных новообразований.
Тщательное изучение биологии ЛСК сталкивается со значительными трудностями, что прежде всего обусловлено малочисленностью этой популяции клеток. Изоляция ЛСК стала возможна только при использовании высокоэффективной сортировки «клеток-кандидатов» на основании паттерна экспрессируемых на поверхности антигенов методом FACS [3]. В качестве реципиентов при последующих трансплантациях, как правило, используются мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (NOD/SCID), которые характеризуются рядом выраженных дефектов в Т-, В-, NK-клетках и системе комплемента, что позволяет использовать их в качестве универсальных «биореакторов» [4]. Именно при использовании этой линии мышей было показано, что ЛСК при ОМЛ имеют иммунофенотип CD34+CD38~, тогда как CD34+CD38+ клетки характеризуются низкой туморогенной активностью [3].
Тем не менее, не все исследователи признают адекватность используемой экспериментальной модели. В частности группа D. Bonnet установила, что используемые для идентификации клеток и дальнейшей сортировки антитела могут значительно искажать результаты
по репопулирующей активности гемопоэтических предшественников и ЛСК в ЫОО/БСЮ мышах [7]. В настоящем исследовании они провели более детальный анализ вероятных артефактов, связанных с использованием антител при изучении туморогенного потенциала разных популяций злокачественных клеток ОМЛ при их трансплантации ЫОО/БСЮ мышам.
На первом этапе изучалось влияние инкубации мо-нонуклеарных клеток (пуповинной крови или ОМЛ) с антителами к одному из антигенов (С034, С045, С013, С0123, СйЗ, С020 и С038) или изотипическими контрольными антителами, проводимой непосредственно перед отмыванием и трансплантацией мышам. Инкубация с антителами к С034, С045, что было объяснимо, и С038, что было удивительно, приводила к значительному снижению приживления мононуклеарных клеток. При этом эффект анти-С038 антител проявлялся быстро; количество окрашенных РКН26 мононуклеарных клеток пуповинной крови стремительно снижалось уже через 16 час. после трансплантации. Кроме того, анти-С038 антитела снижали туморогенный потенциал мононуклеарных клеток ОМЛ в среднем более, чем в 500 раз.
С целью определения обусловлен ли эффект антител взаимодействием их Рс-фрагментов с рецепторами на клетках иммунной системы реципиентов, мононук-леарные клетки инкубировались как с целыми молекулами анти-С038 антител, так и с Р(аЬ)2-фрагментами этих же антител. Степень приживляемое™ была значительно выше у клеток, обработанных Р(аЬ)2-фрагмен-тами. Следовательно, ингибирующий эффект анти-С038 антител был в значительной степени обусловлен их взаимодействием с Рс-рецепторами на поверхности клеток реципиентов, несмотря на наличие у мышей многочисленных дефектов иммунной системы.
Ингибирующий эффект антител к С038 уменьшается при предварительном введении ЫОО/БСЮ мышам иммунносупрессивных антител. Обработка антителами к С0122 (С0122 — р-цепь рецептора к И-2), вызывающих истощение 1МК-клеток и частично моноцитов/макрофагов [5], не только предотвращала ингибирующий эффект инкубации с анти-С038 антителами, но и приводила
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009
