CC BY
24
□CSD*
International Journal of Endocrinology
Орипнальж досл^ження
/Original Researches/
УДК 616.831-005.4:616.379-008.64]:577.1-019 DOI: 10.22141/2224-0721.14.4.2018.140182
Бойчук Т.М., Ткачук С.С., Нка О.М.
Вищий державний навчальний заклад Укра'ни «Буковинський державний медичний ун1верситет,
м. Черн1вц1, Укра!на
Рання та выстрочена реакщя бшка Hif-1a в полях гiпокампа на шем№-реперфуз№ в щурiв зi стрептозотоцинчндукованим цукровим дiабетом
For cite: Miznarodnij endokrinologicnij zurnal. 2018;14(4):310-315. doi: 10.22141/2224-0721.14.4.2018.140182
Резюме. Актуальнють. Роль транскрипц1йного фактора Hif-1a в патогенезi ппоксичних. ушкоджень та цукрового дабету (ЦД) доведена, однак молекулярн механiзми, що лежать в основi дисфункцп дано-го фактора при поеднанн ЦД з Шем'чно-реперфузйним ушкодженням головного мозку, залишаються нез'ясованими. Мета. Вивчення вмсту блка Hif-1a в нейронах пол'в ппокампа щурiв з експериментальним ЦД у динамiцi 'шем'чно-реперфузйного ушкодження головного мозку. Матер'али та методи. Дослдження виконано на 6-мсячних щурах, яким у в ':ц '1 два мсяц моделювали ЦД однократним уведенням стрептозо-тоцину (60 мг/кг маси тла) (Sigma, США). Порушення мозкового кровообгу вдтворювали шляхом оклюзп обох сонних артерй протягом 20 хвилин. Умст блка Hif1-a визначали методом 'мунофлуоресценцИ псля 20-хвилинноi шемИ'з одногодинною реперфуз'ею та на 12-ту добу пост'шем'иного пероду в полях ппокампа СА1, СА2, СА3, СА4. Результати. У щурiв без ЦД 20-хвилинна iшемiя з одногодинною реперфуз'ею пдви-щуе вм'ют блка Hif-1a в ус'х. досл1джених. полях ппокампа. На 12-ту добу ¡шем'ино-реперфузйного пер'юду в полях ппокампа СА2-СА4 значення окремих досл1джених. показни^в активност транскрипцйного фактора Hif-1a продовжують зростати, а в пол'1 СА1 — нормалiзуються або наближаються до значень у тварин контрольноi групи. У щурiв ¡з ЦД у ранньому поскшем'чному перод в пол '1 СА1 змни вмсту блка Hif-1 а вдсуш, в полi СА2 наявн ознаки зниження його активносл, в полi СА3 — обмежен реак^ею одного показника, в полi СА4 мають такий же характер, як i в контрольних щурiв, за даних експериментальних умов. На 12-ту добу iшемiчно-реперфузiйного пероду в полi СА1 зростають ус показники активност транскрипцйного фактора Hif-1 а, за абсолютними значеннями перевищуючи вiдповiднi у тварин контрольноi групи за тих. же експериментальних умов; в полi СА2 i СА3 змiни досл^ених параметрiв обмежен порiвняно з такими у тварин групи контролю; в полi СА4 знижуються показники, як у тварин групи контролю зазнали зростання. Висновки. ЦД обмежуе реакцю блка Hif-1 а на iшемiю-реперфузiю в нейронах пол'в СА1-СА3 у ранньому iшемiчно-реперфузiйному перiодi та в нейронах, пол 'в СА2-СА4 — на 12-ту добу спостереження. Ключовi слова: цукровий дабет; шем'т-реперфуз'т головного мозку; блок Hif-1a
Вступ
Загальновщомо, що шщатором каскаду бю-xiMi4Hrn i молекулярних подш, що призводять до загибелi нейрошв у головному мозку тд час його iшемiчно-реперфузiйного ушкодження, е невщпо-вщшсть мж постачанням кисню i потребою в ньо-му. У такш ситуащ! в тканиш мозку спрацьовують захисш клггинш мехашзми, зокрема шдукц1я рiзних
факторiв транскрипцп, серед яких важлива роль на-лежить шдукованому гшокаею фактору ШМа — транскрипцшному регулятору кисневого гомео-стазу i ключовому фактору формування адаптивних вщповщей [1, 2]. ШМа е потужним регулятором рiзних гешв-мшеней, що збшьшують еритропоез, стимулюють ангюгенез через активацго судинного ендотелiального фактора росту (VEGF), забезпечу-
© «Ммнародний ендокринолопчний журнал» / «Международный эндокринологический журнал» / «International Journal of Endocrinology» («Miznarodnij endokrinologicnij zurnal»), 2018 © Видавець Заславський О.Ю. / Издатель Заславский А.Ю. / Publisher Zaslavsky O.Yu., 2018
Для кореспонденци: Жка Ольга Михайлiвна, кандидат медичних наук, асистент кафедри нервових хвороб, псгаатри та медичноТ" психологи iM. С.М. Савенка, Вищий державний навчальний заклад УкраТни «Буковинський державний медичний ушверситет», пл. Театральна, 2, м. Чершвщ, 58002, УкраТна; е-mail: [email protected]; контактний тел.: +38 (050) 5373124. For correspondence: Olha Nika, PhD, Assistant at the S.M. Savenko Department of Nervous Diseases, Psychiatry and Medical Psychology, State Higher Education Institution of Ukraine "Bukovinian State Medical University', Teatralna sq., 2, Chernivtsi, 58002, Ukraine; е-mail: [email protected]; phone +38 (050) 5373124.
ють адекватний метаболiзм глюкози та ii транспорт у нейрони, сприяють збереженню структури мгго-хондрiй i виживанню клiтин [3, 4].
Однак не Bci дослщники оцiнюють роль Hif-1a так однозначно. Отримано експериментальнi пщ-твердження не лише нейропротекторних, але й ней-ротоксичних ефектiв Hif-1a. Останнi ре^зуються через пщвищення активностi продукту гена р53 — бiлка р53 та шших чинник1в активацГi апоптозу [5]. Кр1м того, Hif-1a бере участь у загибел! кл1тин шляхом некрозу, взаемодшчи з кальцieм i кальпашом; в1н може посилювати набряк мозку, з61льшуючи проникн1сть гематоенцефалiчного бар'ера [6—9]. Вважають, що захиснi ефекти Hif-1a реалiзуються переважно при бшьш легкiй гшокси, а нейроток-сичш — при тяжк1й.
Кр1м гшокси, потужним регулятором активнос-т1 Hif-1a е гiперглiкемiя [8]. У свою чергу, г1покс1я та гiперглiкемiя — основш чинники, що визнача-ють хрон1чн1 ускладнення дiабету. Науковi дороб-ки останнiх рок1в вказують на те, що дестабiлiзацiя Hif-1a, трансдукована гiперглiкемiею, проявляеться втратою клiтинноi вщповщ на г1покс1ю при усклад-неннях дiабету, що, у свою чергу, негативно впли-вае на адаптащю кл1тин i тканин до низького вмюту кисню [10, 11]. Якщо механiзми стабшзацп Hif-1a гiпоксiею вивчеш достатньо добре, то дестабшза-цгя i зниження активностi цього фактора за умов ri-перглжемп залишаються дискутабельними. Одним 1з недавно встановлених механiзмiв дестабшзаци та функцiонально'i репреси Hif-1a при ЦД е вплив метилглiоксалю, який накопичуеться в умовах ви-сокого р1вня глюкози i призводить до шввдкш про-теасом-залежноi деградацп Hif-1a в умовах гшокси [10]. Незначна гiперглiкемiя активуе сигналiзацiю Hif-1a в деяких специфiчних типах клиин, однак високий вм1ст глюкози шпбуе ii [12].
Як бачимо, роль транскрипцшного фактора Hif-1a в патогенезi г1поксичних ушкоджень i ЦД доведена, хоча мехашзми його активацп та дестабшзаци продовжують активно вивчатися. Однак моле-кулярш механiзми, що лежать в основ1 дисфункци даного фактора при поеднанш ЦД з iшемiчно-ре-перфузiйним ушкодженням головного мозку, залишаються нез'ясованими.
Мета дослiдження — вивчити показники актив-ност1 транскрипцiйного фактора Hif-1a в нейронах пол1в гiпокампа щур1в з експериментальним ЦД у динамщ iшемiчно-реперфузiйного ушкодження головного мозку.
Матерiали та методи
Дослщження проведенi за умов моделювання двобiчноi каротидно'i шемн 20-хвилинним клш-суванням обох загальних сонних артерш 1з репер-фузiею рiзноi тривалост в щур1в без ЦД та з його наявнютю. ЦД моделювали внутрiшньочеревним уведенням стрептозотоцину (60 мг/кг) (Sigma, США) бшим нелiнiйним самцям щур1в в1ком два м1-сящ [13]. Тривалiсть дiабету стновила 4 мюящ, що в щур1в е достатшм для формування дiабетичноi ен-
цефалопатГ! [13]. PaHHi наслiдки ГшемГчно-реперфу-зшного ушкодження rinoKaMna вивчали пiсля одно-годинно! реперфузГ!, а вiдстрoченi — на 12-ту добу пoстiшемiчнoгo перюду.
Моделювання шемп та евтaнaзiю тварин здш-снювали п1д кaлiпсoлoвим наркозом (75 мг/кг внутршньочеревно). Нaявнiсть ЦД верифжували визначенням ум1сту глюкози в кров! (глюкозоокси-дазним методом) i вивченням морФолог1чного стану тдшлунково! залози; експериментaльнi групи фор-мували з1 щур1в, в яких рiвень глжемп дoрiвнювaв або перевищував 10 ммоль/л.
Головний мозок якомога швидше вилучали в умовах низько! температури, зпдно з координатами стереотаксичного атласу [14] видГляли д1лянки, що мютять поля гiпoкaмпa СА1, СА2, СА3 та СА4 i пoмiщaли ix для 24-годинно! фжсацп в 10% розчин Буена. Шсля вщповщно! гютолопчно! проводки здiйснювaли заливку препaрaтiв у пaрaфiнoвi блоки.
Б1лок Hif-1a iдентифiкувaли Гмунофлуоресцент-ним методом. Регiдрoвaнi пстолопчш зр1зи шкубу-вали впродовж 18 годин у вологш кaмерi при 4 оС 1з первинними мишачими моноклональними антить лами до Hif-1a щура (mouse IgG1 isotype; Santa Cruz, США) у розведенш 1 : 1000. Надлишок первинних антитГл вiдмивaли в 0,1 М фосфатному буферу здш-снювали iнкубaцiю зр1з1в упродовж 60 хвилин при 37 оС з1 вторинними aнтитiлaми (кроляч1 антит1ла до повно! молекули IgG миш1, кoн'югoвaнi з флу-оресце!ну iзoтioцioнaтoм; Santa Cruz, США) в розведенш 1 : 64, шсля чого зр1зи промивали 0,1 М фосфатним буфером i заключали в сумш глщерину та фосфатного буфера (9 : 1) для подальшо! люмь несцентно! мГкроскопи. Визначали концентрацго б1лка Hif-1a, його питомий умют i площу Hif-1a-Гмунореактивного матер1алу (1РМ). Опрацьован1 г1столог1чн1 зр1зи вивчали за допомогою флуоресцентного мжроскопа Axioskop. Зображення вводили в комп'ютерну систему цифрового анал1зу Vidas-386 (Kontron Elektronik, Н1меччина) [15].
Статистичне опрацювання числових даних здш-снювали в прикладних програмах Statistica 6.0 та SPSS 13 Гз використанням параметричного t-кри-тер1ю Стьюдента. Критичний р1вень значущост1 при перев1рц1 статистичних г1потез приймали за 0,05.
Результати
Результати досл1дження подано в табл. 1 i 2. Встановлено, що в пол1 СА1 щур1в без ЦД 20-хви-линна каротидна Гшем1я з одногодинною реперфу-з1ею спричинила зростання концентраций та питомого вм1сту бГлка Hif-1a у 2,1 та 1,9 раза вщповщно. У пол1 СА2 за даного втручання в1дбулося зростання пло-щ1 Hif-1a-IPM в 1,6 раза, концентраций та питомого вмюту бГлка Hif-1a — в 1,5 та 1,8 раза. Под1бною була реакц1я кл1тин поля СА3, в якому площа Hif-1а-1РМ, концентрацгя та питомий ум1ст б1лка Hif-1a зросли в 1,7; 1,3 та 2,3 раза вщповщно. У пол1 СА4 щур1в ц1е! експериментально! групи виявлено зростання концентраций та питомого вмюту бГлка Hif-1a в 1,8 та 1,7 раза.
Аналiз отриманих результатiв свiдчить, що в ран-ньому iшемiчно-реперфузiйному перiодi в полях ri-покампа посилюеться активнiсть транскрипцшного фактора Hif-1a (судячи 3i змш продукту його д1яль-ностi бшка Hif-1a).
На 12-ту добу тсля моделювання 20-хвилинно! каротидно! шемп в полi СА1 концентрацiя бшка Hif-1a залишалася пiдвищеною (на 20 %) стосовно значень показника в щур!в групи контролю, хоча й в!ропдно знижувалася стосовно раннього тер-мшу в 1,8 раза. Питомий ум1ст бшка Hif-1a також був зниженим стосовно попереднього термшу в 1,8 раза i набув значень, притаманних тваринам групи
контролю. У пол1 СА2 в п1зньому шем!чно-репер-фуз1йному перiодi вс1 три дослщжуваних показ-ники залишалися пiдвищеними стосовно значень у контрольних тварин: площа Hif-la-IPM — у 2,2 раза, концентрац!я та питомий ум1ст бшка Hif-1a — на 13 % та у 2,1 раза вщповщно. Однак динамжа !х вiдрiзнялася: стосовно раннього постiшемiчного перiоду концентрацiя бшка Hif-1a знизилася в 1,3 раза, його питомий умют не зм1нився, а площа Hif-1а-1РМ зросла в 1,4 раза. У пол1 СА3 на 12-ту добу спостереження також ус дослщжуваш показники перевищували контрольш значення: площа Hif-1а-1РМ — у 2 рази, концентрац!я та питомий умют
Таблиця 1. Вплив Шемй'-реперфузи на реакцию блка Hif-1 а в нейронах пол'в ппокампа СА1-СА2 контрольних щурiв i тварин i3 цукровим дiабетом (М ± m)
Група спостереження Концентращя бiлка Hif-1 а (Еф Площа 1РМ на 10 000 мкм2 Питомий yMicT бiлка Hif-1 а (Е|ф)
Поле СА1
Контроль 0,0103 ± 0,0003 11,412 ± 0,953 0,110 ± 0,026
lшемiя-реперфузiя 20 хв/1 год 0,0212 ± 0,0005* 10,871 ± 0,828 0,207 ± 0,028*
lшемiя-реперфузiя 12 дiб 0,0120 ± 0,0008*А 10,706 ± 1,41 0,114 ± 0,010л
Дiабет 0,0259 ± 0,0025* 13,552 ± 1,120 0,251 ± 0,027*
Дiабет та iшемiя-реперфузiя 20 хв/1 год 0,0290 ± 0,0023 10,918 ± 1,069 0,267 ± 0,028
Дiабет та iшемiя-реперфузiя 12 дiб 0,0451 ± 0,0017й 22,028 ± 2,066й 0,491 ± 0,044й
Поле СА2
Контроль 0,0076 ± 0,0002 7,566 ± 0,709 0,064 ± 0,007
lшемiя-реперфузiя 20 хв/1 год 0,0116 ± 0,0007* 11,905 ± 1,091* 0,116 ± 0,016*
lшемiя-реперфузiя 12 дiб 0,0086 ± 0,0004*л 16,724 ± 1,314*л 0,136 ± 0,024*
Дiабет 0,0112 ± 0,0005* 11,071 ± 1,043* 0,118 ± 0,017*
Дiабет та iшемiя-реперфузiя 20 хв/1 год 0,0138 ± 0,0009# 7,552 ± 0,694# 0,103 ± 0,017
Дiабет та iшемiя-реперфузiя 12 дiб 0,0199 ± 0,0023й 11,489 ± 1,312& 0,160 ± 0,018&
Примтки: тут i в табл. 2: вiрогiднiсть рiзницi: *—порiвняно з контролем;л — '¡шем'1ею-реперфуз'1ею (20хв/1 год) у контрольних тварин; * — дiабетом; & — iшемieю-реперфузieю (20 хв/1 год) у тварин i3 ^абетом.
Таблиця 2. Вплив шеми-реперфузи на реакц!ю блка Hif-1 а в нейронах пол'в ппокампа СА3-СА4 контрольних щурiв i тварин i3 цукровим дiабетом (М ± m)
Група спостереження Концентрацiя бiлка Hif-1 а (Е|ф) Площа 1РМ на 10 000 мкм2 Питомий умют бшка Hif-1 а (Е|ф)
Поле СА1
Контроль 0,0072 ± 0,0003 9,254 ± 0,893 0,058 ± 0,007
lшемiя-реперфузiя 20 хв/1 год 0,0093 ± 0,0003* 15,507 ± 1,776* 0,133 ± 0,020*
lшемiя-реперфузiя 12 дiб 0,0132 ± 0,0012*л 18,649 ± 1,459*л 0,227 ± 0,038*л
Дiабет 0,0116 ± 0,0005* 12,676 ± 1,155* 0,142 ± 0,023*
Дiабет та iшемiя-реперфузiя 20 хв/1 год 0,0189 ± 0,0013# 13,869 ± 1,861 0,167 ± 0,022
Дiабет та iшемiя-реперфузiя 12 дiб 0,0159 ± 0,0021 # 20,746 ± 2,248й 0,204 ± 0,034
Поле СА2
Контроль 0,0068 ± 0,0001 7,563 ± 1,014 0,052 ± 0,007
lшемiя-реперфузiя 20 хв/1 год 0,0124 ± 0,0006* 7,118 ± 0,879 0,087 ± 0,013*
lшемiя-реперфузiя 12 дiб 0,0136 ± 0,0011* 12,158 ± 1,148*л 0,125 ± 0,016*л
Дiабет 0,0229 ± 0,0021* 10,796 ± 1,067* 0,151 ± 0,021*
Дiабет та iшемiя-реперфузiя 20 хв/1 год 0,0299 ± 0,0023# 12,733 ± 1,542 0,252 ± 0,027#
Дiабет та iшемiя-реперфузiя 12 дiб 0,0988 ± 0,0092й 6,776 ± 1,327й 0,177 ± 0,025&
бГлка Hif-1a — в 1,8 та 3,9 раза. Однак два останшх показники i стосовно раннього постшемГчного пе-рiоду були пщвищеними в 1,4 та 1,7 раза вщповщно, а площа Hif-la-IPM залишалася на рiвнi тако! в по-передньому термiнi. У полi СА4 стосовно показни-кiв у тварин контрольно! групи площа Hif-1a-IPM, концентрацгя та питомий умiст быка Hif-1a були вищими в 1,6; 2,0, 2,4 раза. Динамка полягала в зростанш порiвняно з показниками в ранньому тер-мiнi спостереження площi Hif-1a-IPM та питомого вмГсту бiлка Hif-1a в 1,7 та 1,4 раза.
Обговорення
Сукупний аналiз отриманих результатiв дозво-ляе дшти висновку, що активацiя транскрипцш-ного фактора Hif-1a в ранньому ГшемГчно-репер-фузiйному перiодi притаманна усiм дослщженим вщдГлам гiпокампа. На 12-ту добу спостереження в усгх полях, крГм поля СА1, за бiльшiстю вивчених показникГв активнiсть його продовжуе зростати, а в полi СА1 — знижуеться. Це свiдчить, що адаптивш механiзми до 12-1 доби спостереження в полях СА2-СА4 залишаються напруженими, а в полi СА1 вони пригшчуються, що в цшому збiгаeться з iснуючою уявою про найбГльшу вразливiсть до ушкоджуючих чинниюв саме цього поля.
У щурiв iз чотиримiсячним ЦД в усГх полях ви-явлено ознаки активацГ! транскрипцiйного фактора Hif-1a. У полГ СА1 це проявлялося вищими, нгж у контролГ, значеннями концентрацГ! та питомого вмГсту бГлка Hif-1a (у 2,5 та 2,3 раза), у полях СА2, СА3, СА4 — значеннями площГ Hif-1a-IPM, концентрацГ! та питомого вмГсту бГлка Hif-1a (в 1,5; 1,5; 1,8 раза — у полГ СА2; 1,4; 1,6; 2,4 раза — у полГ СА3; 1,4; 3,4; 2,9 раза — у полГ СА4). Щ результати дають пГдстави вважати, що в зазначеному термш форму-вання ЦД мають мюце прояви ангГопатГ!, що ство-рюе гГпоксичнГ умови в дослГджених вщдГлах мозку. К1лькГснГ вщмшносп ступеня зростання значень дослГджених показникГв свГдчать про рГзну схиль-нГсть полГв гшокампа до формування дГабетично! енцефалопатГ!.
У ранньому шемГчно-реперфузшному перГодГ стосовно показникГв за дГабету, неускладненого по-рушеннями церебрального кровообГгу, в полГ гшокампа СА1 щурГв Гз ЦД жодних вГропдних змГн до-слщжуваних показникГв не виявлено, а отже, в цей перюд спостереження на вщмшу вГд тварин без дГабету адаптивш мехашзми не спрацьовують. У полГ СА2 в цьому термш спостереження на 23 % зросла концентрацгя бГлка Hif-1a при одночасному зни-женнГ в 1,5 раза площГ Hif-1a-IPM; у полГ СА3 в 1,6 раза зросла концентрацгя бГлка Hif-1a; у полГ СА4 — концентрацгя та питомий умют бглка Hif-1a — в 1,3 та 1,7 раза. ПорГвняння змш вивчених показникГв пГсля 20-хвилинно! Гшемп/одногодинно! реперфузГ! у тварин без дГабету та за його наявнютю демонструе бГльш обмежену реакцГю продукту транскрипцшно-го фактора Hif-1a у тварин останньо! групи.
На 12-ту добу тсля моделювання каротидно! шемп порГвняно з показниками за дГабету, не
ускладненого порушеннями церебрального кровообГгу, в полГ гГпокампа СА1 ввдбулося зростання площГ Hif-1a-IPM, концентрацГ! та питомого вмГсту бшка в 1,6; 17; 1,96 раза. Стосовно попереднього термшу щ показники були вищими в 2,0; 1,6; 1,8 раза. У полГ СА2 стосовно показникГв за дГабету залишалася шдвищеною концентрацГя бшка Hif-1a (в 1,6 раза). Слщ зазначити, що цей показник зрю i щодо раннього термшу спостереження (в 1,4 раза). Площа Hif-1a-IPM та питомий умют бГлка Hif-1a в цей перюд повернулися до значень у тварин Гз дГабетом без порушення мозкового кровообГгу, а стосовно раннього термшу вони були вищими в 1,5 та 1,6 раза. Що стосуеться поля СА3, на 12-ту добу постГшемГчного перюду тут щодо показникГв за дГабету були тдвищеними концентрацГя бГлка Hif-1a та площа Hif-1a-IPM в 1,4 та 1,6 раза. Останнш показник перевищував також значення в ранньому постшемГчному перюдГ в 1,5 раза. У полГ СА4 суттево перевищувала значення як у тварин Гз ЦД, так i в ранньому постГшемГчному перюдГ концентрацГя бшка Hif-1a (в 4,3 та 3,3 раза). Беручи до уваги зниження в 1,6 та 1,9 раза значень площГ Hif-1a-IPM, можна думати, що концентрацГя цього бшка зросла саме завдяки зниженню площГ. Питомий умют бшка Hif-1a повернувся до значень у тварин Гз ЦД i був нижчим, нГж у попередньому термш, в 1,4 раза.
Висновки
1. У щурГв без ЦД 20-хвилинна ГшемГя з одно-годинною реперфузГею пщвищуе вмГст бшка Hif-1a в усГх дослГджених полях гГпокампа. На 12-ту добу ГшемГчно-реперфузшного перюду в полях гГпокампа СА2-СА4 значення окремих дослГджених показникГв активностГ транскрипцшного фактора Hif-1a продовжують зростати, а в полГ СА1 — нормалГзу-ються або наближаються до значень у тварин контрольно! групи.
2. У щурГв Гз чотиримГсячним ЦД виявлено вищГ, нгж у тварин контрольно! групи, значення активностГ Hif-1a в усГх дослГджених полях гГпокампа.
3. У щурГв Гз дГабетом у ранньому ГшемГчно-ре-перфузГйному перюдГ в полГ СА1 змГни вмГсту бГлка Hif-1a вГдсутнГ, в полГ СА2 наявнГ ознаки зниження його активностГ, в полГ СА3 — обмежеш реакцГею одного показника, в полГ СА4 мають такий же характер, як i в контрольних щурГв за даних експери-ментальних умов. На 12-ту добу ГшемГчно-реперфу-зГйного перГоду в полГ СА1 зростають усГ показники активностГ транскрипцшного фактора Hif-1a, за абсолютними значеннями перевищуючи вГдповГднГ у тварин контрольно! групи за тих же експеримен-тальних умов; в полГ СА2 i СА3 змши дослГджених параметрГв обмеженГ порГвняно з такими у тварин групи контролю; в полГ СА4 знижуються показники, яю у тварин групи контролю зростали.
Конфлжт штереав. Автори заявляють про вщ-сутнють конфлГкту ГнтересГв при пщготовш дано! статп.
References
1. Singh N, Sharma G, Mishra V. Hypoxia inducible factor-1: its potential role in cerebral ischemia. Cell Mol Neurobiol. 2012 May;32(4):491-507. doi: 10.1007/ s10571-012-9803-9.
2. Wenger RH. Cellular adaptation to hypoxia: O -sensing protein hydroxylases, hypoxia-inducible transcription factors, and O2-regulated gene expression. FASEB J. 200216(10)1151-1162. DOI: 10.1096/fj.01-0944rev.
3. Xu W, Xu R, Li X, Zhang H, Wang X, Zhu J. Down-regulating hypoxia-inducible Jactor-1a expression with perfluorooctyl-bromide nanoparticles reduces early brain injury following experimental subarachnoid hemorrhage in rats. Am J Transl Res. 2016May 15;8(5):2114-26.
4. Thelin EP, Frostell A, Mulder J, et al. Lesion Size Is Exacerbated in Hypoxic Rats Whereas Hypoxia-Inducible Factor-1 Alpha and Vascular Endothelial Growth Factor Increase in Injured Normoxic Rats: A Prospective Cohort Study oJ Secondary Hypoxia in Focal Traumatic Brain Injury. Front Neurol. 2016 Mar 7;7:23. doi: 10.3389/ fneur.2016.00023.
5. Chen C, Hu Q, Yan J, et al. Multiple effects oJ 2ME2 and D609 on the cortical expression oJ HIF-¡alpha and apoptotic genes in a middle cerebral artery occlusion-induced focal ischemia rat model. J Neuro-chem. 2007 Sep;102(6):1831-1841. doi: 10.1111/j.1471-4159.2007.04652.x.
6. Higashida T, Peng C, Li J, et al. Hypoxia-inducible Jactor-1a contributes to brain edema after stroke by regulating aquaporins and glycerol distribution in brain. Curr Neurovasc Res. 2011 Feb;8(1):44-51.
7. Shenaq M, Kassem H, Peng C, et al. Neuronal damage and functional deficits are ameliorated by inhibition of aquaporin andHIF1a after traumatic brain injury (TBI). J Neurol Sci. 2012 Dec 15;323(1-2):134-40. doi: 10.1016/j. jns.2012.08.036.
8. Chen C, Ostrowski RP, Zhou C, Tang J, Zhang JH. Suppression of hypoxia-inducible factor-1alpha and its downstream genes reduces acute hyperglycemia-enhanced hemorrahagic transformation in a rat model of cerebral
ischemia. J Neurosci Res. 2010 Jul;88(9):2046-55. doi: 10.1002/jnr. 22361.
9. Higashida T, Kreipke CW, Rafols JA, et al. The role of hypoxia-inducible factor-1a, aquaporin-4, and matrix metalloproteinase-9 in blood-brain barrier disruption and brain edema after traumatic brain injury. J Neurosurg. 2011 Jan;114(1):92-101. doi: 10.3171/2010.6.JNS10207.
10. Bento CF, Fernandes R, Ramalho J, et al. The Chaperone-Dependent Ubiquitin Ligase CHIP Targets HIF-1a for Degradation in the Presence of Methylglyoxal. PLoS One. 2010 Nov 29;5(11):e15062. doi: 10.1371/jour-nal.pone.0015062.
11. Xiao H, Gu Z, Wang G, Zhao T. The Possible Mechanisms Underlying the Impairment of HIF-1a Pathway Signaling in Hyperglycemia and the Beneficial Effects of Certain Therapies. Int J Med Sci. 2013 Aug 22;10(10):1412-21. doi: 10.7150/ijms.5630.
12. Catrina SB, Zheng X. Disturbed hypoxic responses as a pathogenic mechanism of diabetic foot ulcers. Diabetes Metab Res Rev. 2016 Jan;32 Suppl 1:179-85. doi: 10.1002/dmrr. 2742.
13. Tkachuk SS, Lenkov AM. Expression of Hif-1a, p53 and Bcl-2 proteins in the brain under under the conditions of bilateral carotid ischemia-reperfusion in experimental diabetes mellitus in male rats. Klinicna ta eksperimental'na patologia. 2010;2(32):111-113. (in Ukrainian).
14. Konig JF, Klippel PA. The rat brain. A stereotaxis atlas of forebrain and lower part of the brain stem. Balti-mora: The Williams and Wilkins Company; 1963. 162 p.
15. Kolesnik YM, Orlovsky MA. Image analysis system for quantitative immunofluorescence measurement. Microscopy and Analysis. 2002;5:19-21.
OTpuMaHO 25.05.2018 ■
Бойчук Т.Н., Ткачук С.С., Ника О.М.
Высшее государственное учебное заведение Украины «Буковинский государственный медицинский университет», г. Черновцы, Украина
Ранняя и отсроченная реакция белка ЫМа в полях гиппокампа на ишемию-реперфузию у крыс со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом
Резюме. Актуальность. Роль транскрипционного фактора Hif-1a в патогенезе гипоксических повреждений и сахарного диабета (СД) доказана, однако молекулярные механизмы, лежащие в основе дисфункции данного фактора при сочетании СД с ишемически-реперфузионным повреждением головного мозга, остаются невыясненными. Цель. Изучить содержание белка Hif-1a в нейронах полей гиппокампа крыс с экспериментальным СД в динамике ишемически-реперфузионного повреждения головного мозга. Материалы и методы. Исследование выполнено на 6-месячных крысах, которым в возрасте два месяца моделировали СД однократным введением стрептозотоцина (60 мг/кг массы) (Sigma, США). Нарушение мозгового кровообращения воспроизводили путем окклюзии обеих сонных артерий в течение 20 минут. Содержание белка Hif1-a определяли методом иммуно-флуоресценции после 20-минутной ишемии с часовой реперфузией и на 12-е сутки постишемического периода
в полях гиппокампа СА1, Са2, СА3, СА4. Результаты. У крыс без СД 20-минутная ишемия с одночасовой репер-фузией повышает содержание белка ШМа во всех исследованных полях гиппокампа. На 12-е сутки ишемически-реперфузионного периода в полях гиппокампа СА2-СА4 значения отдельных исследованных показателей активности транскрипционного фактора ШР-1а продолжают расти, а в поле СА1 — нормализуются либо приближаются к значениям у животных контрольной группы. У крыс с СД в раннем постишемическом периоде в поле СА1 изменения содержания белка ШМа отсутствуют, в поле СА2 имеются признаки снижения его активности, в поле СА3 — ограничены реакцией одного показателя, в поле СА4 носят такой же характер, как и у контрольных крыс при данных экспериментальных условиях. На 12-е сутки ишемически-реперфузионного периода в поле СА1 увеличиваются все показатели активности транскрипционного фактора ШМа, по абсолютным значениям превы-
шая соответствующие у животных контрольной группы при тех же экспериментальных условиях; в поле СА2 и СА3 изменения исследованных параметров ограничены по сравнению с таковыми у животных группы контроля; в поле СА4 снижаются показатели, которые у животных группы контроля повышались. Выводы. СД ограничивает
реакцию белка ШМа на ишемию-реперфузию в нейронах полей СА1-СА3 в раннем ишемически-реперфузи-онном периоде и в нейронах полей СА2-СА4 — на 12-е сутки наблюдения.
Ключевые слова: сахарный диабет, ишемия-реперфузия головного мозга, белок ШМа.
T.M. Boychuk, S.S. Tkachuk, O.M. Nika
State Higher Education Institution of Ukraine "Bukovinian State Medical University", Chernivtsi, Ukraine
Early and delayed reaction of the Hif-1a protein in the hippocampal fields on ischemia-reperfusion in rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus
Abstract. Background. The role of the transcriptional hy-poxia-inducible factor-1a (Hif-1a) in the pathogenesis of hypoxic damage and diabetes mellitus (DM) is proved, although molecular mechanisms underlying dysfunction of this factor, when DM is combined with ischemic-reperfusion damage of the brain, remain unknown. The purpose was to study the content of Hif-1a protein in the hippocampal neurons of rats with experimental DM in the dynamics of ischemic-reperfusion damage of the brain. Materials and methods. The study was performed on 6-month-old rats with DM modeled by single administration of 60 mg/kg weight streptozotocin (Sigma, USA). The cerebrovascular disorders were reproduced by occlusion of both carotid arteries for 20 minutes. The content of Hif1-a protein was determined by immunofluorescence method after 20-minute ischemia with one-hour reperfusion, and on the 12th day of the post-ischemic period in the fields CA1, CA2, CA3, and CA4 of the hippocampus. Results. In rats without DM, 20-minute ischemia with one-hour reperfusion increases the content of Hif-1a protein in all the fields of the hippocampus. On the 12th day of ischemic-reperfusion period, the values of certain examined indices of transcriptional Hif-1a activity con-
tinue to increase in the hippocampal fields CA2-CA4, and in CA1 field they normalize or approach to the values of animals in the control group. In rats with DM during early post-isch-emic period, there are no changes of Hif-1a protein content in CA1 field, in CA2 field there are signs of its reduced activity, in CA3 field they are limited by the reaction of one index, in CA4 field they are similar to those of the control rats under experimental conditions. On the 12th day of ischemic-reperfusion period, all the indices of transcriptional Hif-1a activity in CA1 field increase exceeding the corresponding indices in animals of the control group by absolute values under the same experimental conditions. In CA2 and CA3 fields, changes of the examined parameters are limited as compared to those in animals from the control group, in CA4 field, the values that were increased in the control group decrease. Conclusions. DM restricts the reaction of Hif-1a protein on ischemia-reperfusion in the neurons of CA1-CA3 fields in the early ischemic-reperfusion period and in the neurons of CA2-CA4 fields — on the 12th day of observation.
Keywords: diabetes mellitus; cerebral ischemia-reperfusion; Hif-1a protein
