CC BY
71ПЦР В НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ СТУДЕНТОВ СПЕЦИАЛЬНОСТИ _"БИОТЕХНОЛОГИЯ"
Погосян Гаянэ Павловна
кандидат биологических наук, доцент, Карагандинский Государственный Университет им. Е.А. Букетова, г. Караганда
Протас Валерия Викторовна
магистр естественных наук по специальности "Биология", Карагандинский Государственный Университет
им. Е.А. Букетова, г. Караганда
PCR IN RESEARCHES OF SPECIALTY "BIOTECHNOLOGY" STUDENTS
Gayane Pogossyan, Candidate of Science, assistant professor, Karaganda State University, Karaganda Protas Valeria
Master of Biology, Karaganda State University, Karaganda АННОТАЦИЯ
В статье рассмотрены возможности использования метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) при проведении научных исследований студентами специальности «Биотехнология». Описаны этапы ПЦР, компоненты, приборы амплификаторы, используемые для постановки реакции. Указаны преимущества метода, применение его научных и диагностических лабораториях. Указаны такие возможности ПЦР, как клонирование, секвенирование последовательностей ДНК, определение трансгенных организмов и другие. ABSTRACT
The possibility of using the polymerase chain reaction (PCR) for research students specialty "Biotechnology" discussed in the article. PCR steps, components, thermocyclers used for setting the reaction are described. Were indicated the advantages of the method, the application of its in research and diagnostic laboratories. PCR features such as cloning, DNA sequencing, identification of transgenic organisms are described.
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция, учебный процесс, биотехнология. Keywords: polymerase chain reaction, the educational process, biotechnology.
Биотехнология в настоящее время занимает важное место в науке и повседневной жизни. В связи с этим все больше студентов выбирают для обучения специальность "Биотехнология". Как будущие специалисты, они должны знать основные направления и методы научно-исследовательской деятельности в рамках своей специальности.
Разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) К. Мюллисом в 1983 г. способствовала существенному ускорению и продвижению биотехнологии как науки. И в настоящее время данный метод остается одним из главных и часто применяемых в биотехнологических исследованиях [1, с. 29].
ПЦР представляет собой серию из трех циклически повторяющихся стадий реакции (15-30 циклов по 1 -3 мин):
1) тепловая денатурация исходной ДНК при ~94 °С;
2) отжиг ДНК-затравок (праймеров) при ~50-60 °С на получившиеся одноцепочечные матрицы;
3) синтез двухцепочечных ДНК при 72 °С с каждым из праймеров навстречу друг другу по противоположным цепям ДНК (рис. 1) [2, с. 386].
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
- ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
- два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК;
- термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus
(Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus ^^-полиме-раза и другие.
- дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP);
- ионы Mg2+, необходимые для работы полиме-разы;
- буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин [3, с. 81-83].
Реакцию проводят в специальном приборе - термо-циклере, или амплификаторе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок. По завершении каждого цикла количество синтезированного продукта удваивается и происходит увеличение количества исходных копий ДНК в геометрической прогрессии [4, с. 35].
Метод ПЦР обладает значительными преимуществами:
1. Универсальность. Метод принципиально позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно.
2. Специфичность. Высокая специфичность (100%) метода обусловлена тем, что в исследуемом материале определяется уникальный фрагмент НК (нук-леотидная последовательность), характерный только для данного возбудителя или гена.
3. Чувствительность. Возможность проведения не только качественной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания НК.
4. Актуальность ответа (быстрота получения результата). Высокая технологичность и автоматизация метода позволяет получить результаты исследования в руки врача и пациента в день проведения анализа.
5. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы. Возможно проведение ПЦР в пробе, объемом до нескольких микролитров, что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п. [5, с. 1644-1649], [6, с. 27-29].
В настоящее время ПЦР широко используется в научных и диагностических лабораториях во многих областях. Кроме простого удвоения последовательностей ДНК, метод ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), клонирование любых последовательностей в пробирке, выделение новых генов, секвенирование. Также ПЦР широко используется в биологической и медицинской практике, в первую очередь, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, степени родства, популяционных исследований, в криминалистике -везде, где нужно установить уникальную последовательность ДНК, опираясь на минимальное количество исходного ДНК-содержащего материала [7].
Рассмотрим подробнее возможности применения метода полимеразной цепной реакции в научных исследованиях студентов специальности "Биотехнология".
1. Клонирование и искусственный синтез ДНК. Технологии рекомбинантных ДНК - это совокупность процедур, позволяющих осуществить конструирование нового генного комплекса и перенос его в организм-реципиент, где новый генетический материал начинает работать. Не существует единого универсального набора методик, все зависит от конкретной задачи, но чаще всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме.
1) Получение нужной последовательности - ДНК для клонирования может быть получена химико-ферментативным синтезом, обратной транскрипцией мРНК и путем непосредственного расщепления геномной ДНК нужной рестрикционной эндонуклеазой. Но самый распространенный путь сейчас - синтез ДНК методом ПЦР. Учитывая генетическое родство всех живых организмов на Земле, целевая последовательность для предполагаемого клонирования известна, хотя бы частично. После выбора и синтеза праймеров к известной последовательности, ДНК можно амплифицировать методом ПЦР [8, с. 247], [9, с. 302].
В качестве матрицы для синтеза используют геномную ДНК или матричную РНК, в этом случае первым шагом в синтезе целевой последовательности будет синтез комплементарной ДНК (кДНК) обратной транскриптазой (ревертазой - РТ), затем обычная ПЦР. Иногда эти реакции объединяют в одну РТ-ПЦР (RT-PCR). Как правило, в концы ПЦР-праймеров вводят сайты рестриктаз для удобства дальнейшего клонирования синтезированной последовательности.
2) После обработки рестриктазами полученный ген соединяют (лигируют) с клонирующим вектором с образованием новой, рекомбинантной молекулы - конструкция «клонирующий вектор - встроенная ДНК».
3) Полученную рекомбинантную конструкцию вводят в клетку-мишень (рецепиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией (прокариоты и дрожжи) и трансфекцией (эу-кариоты).
4) Используя селективный маркер, идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК.
5) Получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена [2, с. 154], [8, с. 121].
2. Изучение последовательности ДНК путем секве-нирования. Секвенирование (sequencing) - это общее название методов, которые позволяют установить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК. Методы се-квенирования лежат в основе геномики - направление биологии, исследующее структуру и функции нуклеотид-ных последовательностей геномов живых организмов. Структурная геномика - последовательность нуклеотидов, наличия их модификаций, взаимодействий с белками, функциональная геномика - реализация генетической информации, систематическая геномика - использование последовательностей специфических участков ДНК для уточнения систематического положения живых организмов. Спектр применения данной методики достаточно широк и открывает возможности для проведения научных исследований студентами [10, с. 228], [11, с. 406].
3. Применение ПЦР для обнаружения генетически модифицированной ДНК в трансгенных растениях и продуктах их переработки (анализ на ГМИ). Генетически модифицированные продукты абсолютно ничем не отличаются по внешнему виду от своих природных аналогов. Установить генетическую модификацию проще всего методами генетического анализа, а именно методом поли-меразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР-анализ основан на поиске последовательностей, общих для большинства генно-модифированных организмов [12, с. 193].
Одним из направлений исследований студентов Карагандинского Государственного Университета им. академика Е.А. Букетова является определение фрагментов нуклеиновых кислот трансгенных организмов в различных продуктах питания. Для этого студенты осваивают методы выделения РНК, ДНК, постановку реакции амплификации с использованием праймеров для обнаружения ДНК генетически модифицированных сои и кукурузы различных линий, электрофореза ДНК в агарозном геле. Первоначальные исследования проводятся с тест-системой "Плант-Скрин", являющейся скрининговой системой, способствующей выявлению фрагментов ДНК сои и кукурузы нескольких линий. После анализа продуктов электрофореза с помощью компьютерной системы "TotalLab" последующие исследований проводятся с использованием тест-систем "ГМ-соя-40-3-2" и "Терминатор Nos" для выявления фрагментов ДНК конкретных линий сои и кукурузы.
Все картины электрофореза фотографируются и анализируются. Студенты используют положительные, отрицательные и внутренние контрольные образцы с целью получения достоверных результатов. В течение трех лет студентами проведены исследования по обнаружению фрагментов ДНК трансгенных растений в колбасных, шоколадных, молочных, мясопродуктах, фруктовых соках, продуктах детского питания. При проведении исследований студенты модифицировали методы выделения ДНК с учетом консистенции продукта и концентрации ДНК.
Результаты исследований отражены в дипломных работах, научных публикациях, выступлениях на конференциях различных уровней.
На рисунке 1 представлена фотография электрофореза определения ГМО в двенадцати образцах тушеного мяса.
1. ПКО 1 соя 400 и 194 пн. 8. Тушенка говяжья Кусковая №5
2. ПКО 2 кукуруза 544 пн. 9. Свинина тушеная №6
3. ОКО. 10. Конина тушеная №7
4. Баранина тушеная №1 11. Говядина тушеная №8
5. Говядина тушеная №2 12. Говядина тушеная №9
6. Говядина тушеная №3 13. Говядина тушеная №10
7. Свинина тушеная №4 14. Свинина тушеная №11
Рисунок 1. Электрофореграмма ДНК группы D - «Мясо тушеное», мплифицированных с применением
тест-системы «ПЛАНТ-СКРИН»
4. Определение структурных хромосомных перестроек, вызывающих онкогематологические заболевания. С применением ПЦР-анализа студенты специальности "Биотехнология" изучают делеции, инверсии, транслокации, приводящие к образованию химерных генов, продукты которых вызывают различные виды лейкозов. В зависимости от типа хромосомной перестройки возникают различные патологические гены, обнаружение которых показывает практическую значимость таких исследований для медицинской биотехнологии [13, с. 8].
Этапы данных исследований сопоставимы с предыдущими при выявлении генетически модифицированных организмов, однако имеется определенная специфика.
После выделения РНК из образцов плазмы крови необходима постановка реакции обратной транскрипции с целью получения кДНК, т.к. для полимеразной цепной реакции необходима в качестве матрицы молекула ДНК. Реакция амплификации ставится в режиме реального времени, что позволяет наблюдать накопление ампликонов в процессе реакции. Анализ продуктов амплификации проводится непосредственно на графиках, формируемых на мониторе в течение реакции [3, с. 62].
Метод ПЦР используется также для определения генотипов инфекционных агентов: вируса гепатита С, вируса папилломы человека. На рисунке представлена электрофореграмма одного из исследований по определению генотипов гепатита С.
1 - маркеры молекулярного веса. 2 - РНК с генотипом 3а. Рисунок 2. Электрофореграмма результатов анализа образцов с генотипом Н^3а с помощью тест-системы
АмплиСенс Н^-генотип
5. Генотипирование и паспортизация растений и животных. Большое значение для современных биотехнологических исследований, а также селекции хозяйственно-ценных культур и семеноводства имеет разработка методов паспортизации сортов растений и пород животных на основе молекулярных маркеров. Применение ДНК-маркеров позволяет проводить генетическое маркирование растений для идентификации их сортовой принадлежности, организовывать генетическую экспертизу племенных животных, в том числе проводить ДНК-
диагностику наследственных заболеваний крупного рогатого скота, ДНК-диагностику вирусных заболеваний сельскохозяйственных животных. Генетическая «паспортизация» животных проводится преимущественно в отношении крупнорогатого скота по заказу племенных предприятий, предприятий Министерства сельского хозяйства. Создание генетических паспортов для сельскохозяйственных животных - дело государственной важности. «Породистые» бычки приносят немалую прибыль хозяйствам. Животное с генетическим паспортом, подтверждающим его высокопродуктивность, стоит в 3-4 раза дороже.
Также возможно проведение ДНК-паспортизации и сельскохозяйственных культур: картофеля, томатов, льна, пшеницы, ячменя, сои, подсолнечника. Выданный на основе анализа ДНК паспорт содержит информацию об уникальности сорта, его однородности или загрязненности, степени его родства с другими сортами из базы данных, присутствия положительных или отрицательных аллелей наиболее важных генов. Одна из проблем, которую планирует решить биотехнологи в ближайшем будущем - сохранение видов животных и растений, занесенных в Красную книгу [14, с. 215-216], [15, с. 231].
6. Маркерная селекция. Метод ПЦР нашел широкое применение при анализе геномов растений различных сельскохозяйственных культур, в частности, как инструмент для маркирования генов и проведения маркерной селекции. Маркерная селекция отличается от классической селекции тем, что проводит оценку генов в организме молекулярными методами и позволяет исследователю выбрать лучшую комбинацию для скрещивания. Таким образом, селекционный процесс идет более целенаправленно и ускоренными темпами. Молекулярное маркирование осуществляется, как правило, на основе метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) [5, с. 1649], [6, с. 27].
Таким образом, можно сделать вывод, что студенты специальности "Биотехнология" имеют значительное разнообразие в выборе направления научных исследований с применением метода полимеразной цепной реакции.
Литература
1. Егорова Т.А., Клунова С. М., Живухина Е. А. Основы биотехнологии. - М.: Академия, 2006.
2. Глик, В. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. / Пер. с англ. Н.В.Баскаковой и др. -М.: Мир, 2002.
3. Теоретические основы полимеразной цепной реакции. - Москва: ДНК-Технология, 1998.
4. Бонецкий А. А., Таирова М. М., Кутукеев Т. С. и др. Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) в клинической практике. Методические рекомендации. - Бишкек, 2000.
5. Erlich H.A., Gelfard D., Sninsky J.J. Recent advances in the polymerase chain reaction // Science, 1991. - V 252. - P. 1643-1651.
6. Костюк С. А. Преимущества и сферы применения полимеразной цепной реакции // Медицинская панорама, 2003. - № 9. - С. 26-30.
7. Охапкина С.С., Акишев А.Г. Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) и ее применение // Опубликовано на сайте http://sciencerussian.sibenzyme.com
8. Методы молекулярной генетики и генной инженерии / под ред. Саиганика Р.И. Новосибирск: Наука, 1990.
9. Жимулев И.Ф. Общая молекулярная генетика. - Новосибирск: Сибирское университетское издание, 2003.
10. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. -М., 2002.
11. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. - Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004.
12. http://www.znaytovar.ru/s/Texnologii_sozdaniya_gm rasteni.html.
13. Аксенов М.Ю., Гинцбург А.Л. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1993. - С. 3-15.
14. Биотехнология животных: учебник для ВУЗов / Джамалова Г.А. - Алматы: «Маматай», 2004.
15. Валиханова Г.Ж. Биотехнология растений: учебное пособие. - Алматы: Конжык, 1996.
СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И МЕТОДЫ ОТОБРАЖЕНИЯ ПРОЦЕССА ИХ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ
Садыхова Халида Рагим
Студентка, Первый МГМУ им. И.М.Сеченова, г.Москва Молодожникова Наталья Михайловна
Кандидат биологических наук, доцент, Первый МГМУ им. И.М.Сеченова, г.Москва
STEM CELLS AND METHODS FOR DISPLAYING THE PROCESS OF THEIR DIFFERENTIATION. Sadikhova Khalida Rahim kyzy, A student, Of First Moscow State Medical University, Moscow
Molodozhnikova Natalia Mihajlovna, Candidate of Biological Sciences, associate professor, Of First Moscow State Medical University, Moscow АННОТАЦИЯ
Один из разделов регенеративной клеточной медицины, сулящий людям излечение от многих тяжелых болезней - это изучение так называемых стволовых клеток (СК). Стволовая клетка - это незрелая клетка, способная к самообновлению и развитию в специализированные клетки организма. О стволовой клетке мы знаем достаточно давно и довольно много. Приоритет открытия стволовой клетки принадлежит русскому ученому профессору Императорской Военно-медицинской академии А.А.Максимову, который в 1908 году в Гамбурге озвучил теорию о кроветворной стволовой клетке. В последние десятилетия развитие биотехнологической отрасли позволило сделать колоссальный прорыв в изучении стволовой клетки. Она уникальна именно потому, что в ней содержатся стволовые клетки, полностью идентичные организму данного ребенка. Стволовые клетки обладают ценными свойствами: способностью к самообновлению, росту, и дифференцировке (из них могут формироваться клетки разных органов и тканей: клетки крови, печени, мышечные клетки и т.д.). Иначе говоря, у них есть потенциал, необходимый для успешного лечения поврежденных тканей и органов. Интерес к стволовым клеткам возрос, когда была
