CC BY
145
Прямое наблюдение образования комплекса «холестерин - модель биологической мембраны» методами ЯМР-спектроскопии
Л.Ф. Галиуллина, Д.С. Блохин, А.В. Аганов, В.В. Клочков Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань
Direct observation of «cholesterol - model of biological membrane» complex by NMR spectroscopy
L.F. Galiullina, D.S. Blohin, A.V. Aganov, V.V. Klochkov Kazan (Volga region) Federal University, Kazan
Целью данной работы являлось исследование взаимодействия и комплексообразования холестерина и молекул додецилсульфата натрия, взятых в качестве модели биологической мембраны, а также описание комплекса холестерин — додецилсульфат натрия в растворе современными методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса.
Спектры ядерного магнитного резонанса были записаны на импульсном спектрометре с Фурье-преобразованием Вгикег Avance 500.
Сигналы в 1Н спектрах ядерного магнитного резонанса холестерина, додецилсульфата натрия, а также смеси холестерин + додецилсульфат натрия были соотнесены на основании литературных данных и данных 2D гомо- и гетерокорреляционных экспериментов ядерного магнитного резонанса. Для исследования мицеллообразова-ния додецилсульфата натрия и образования комплекса холестерин+мицеллы додецилсульфата натрия были проведены селективные эксперименты спектроскопии ядерного эффекта Оверхаузера.
Образование мицелл на основе додецилсульфата натрия в растворе диметилсульфоксида было подтверждено данными спектроскопии ядерного эффекта Оверхаузера. Наличие комплекса между холестерином и мицеллами, образованными молекулами додецилсульфата натрия, устанавливалось с помощью одномерных селективных экспериментов спектроскопии ядерного эффекта Оверхаузера. В эксперименте наблюдается эффект Оверхаузера между ОН-группой холестерина и концевыми группами гидрофобной части додецилсульфата натрия, что соответствует их близкому пространственному расположению и наличию комплекса между холестерином и мицеллами додецил-сульфата натрия.
На основании экспериментов, проведенных с использованием ядерного магнитного резонанса, было установлено, что додецилсульфата натрия образует в растворе диметилсульфоксида обратные мицеллы при концентрации выше критической концентрации мицеллообразова-ния. Молекулы холестерина образуют межмолекулярный комплекс с мицеллами додецилсульфата натрия путем взаимодействия ОН-группы холестерина с концевыми алифатическими группами СН3-1 и СН2-2 молекулы додецилсульфата натрия. Такое взаимодействие имеет сходство с поведением холестерина в фосфолипидных бислойных мембранах, в которых холестерин проникает своей циклической частью в гидрофобные хвосты фосфолипидных молекул, ориентируясь преимущественно перпендикулярно к бислоям.
Ключевые слова: спектроскопия ядерного магнитного резонанса, холестерин, додецилсульфат натрия, мицеллы, ядерный эффект Оверхаузера.
Interaction and aggregation of cholesterol and sodium dodecyl sulfate molecules were studied in this paper. Sodium dodecyl sulfate was taken as a model for biological membranes. Cholesterol-sodium dodecyl sulfate complex was described by modern methods of nuclear magnetic resonance spectroscopy.
Nuclear magnetic resonance spectra were recorded on «Avance-500» spectrometer (BrukerJ.
To assign 1H signals of cholesterol, sodium dodecyl sulfate and cholesterol+sodium dodecyl sulfate mixture in nuclear magnetic resonance spectra literature data was used, and 2D homo- end hetero-correlation nuclear magnetic resonance spectra were recorded. To study the formation of sodium dodecyl sulfate micelles and complex of cholesterol-sodium dodecyl sulfate micelles selective nuclear Overhauser effect spectroscopy experiments were carried out.
The formation of sodium dodecyl sulfate micelles in dimethyl sulfoxide solution was confirmed by nuclear Overhauser effect spectroscopy data. The presence of a complex between sodium dodecyl sulfate micelles and cholesterol molecules has been proven by selective nuclear Overhauser effect spectroscopy experiments. Nuclear Overhauser effect between OH-group of cholesterol and «tail» groups of sodium dodecyl sulfate hydrophobic part was observed in the experiment. This observation corresponds to close spatial arrangement of these parts of different molecules and the presence of a complex between cholesterol and sodium dodecyl sulfate micelles.
On the basis of the nuclear magnetic resonance experiments was established that molecules of sodium dodecyl sulfate form micelles in dimethyl sulfoxide solution at concentrations above the critical micelle concentration. Cholesterol molecules form an intermolecular complex with sodium dodecyl sulfate micelles by interaction of the OH group of cholesterol and CH3-1 and CH2-2 «tail» aliphatic groups of sodium dodecyl sulfate. This interaction is similar to the behavior of cholesterol in phospholipid bilayer membranes in which cholesterol enters its cyclic part in the hydrophobic tails of phospholipid molecules oriented primarily across the bilayers.
Key words: Nuclear magnetic resonance spectroscopy, cholesterol, sodium dodecyl sulfate, micelles, nuclear Overhauser effect.
e-mail: [email protected]
Холестерин (холестерол), «холестериновый каркас», представляет собой основу клеточной мембраны, регулирует проницаемость и активность мембранных ферментов, определяет «выживаемость» клетки, образование новых клеток при их делении, то есть играет ключевую роль в биосинтезе и метаболизме клетки [1], следовательно, и в обеспечении жизнедеятельности организма. Количество холестерина в разных его фракциях рассматривается как фактор риска в развитии атеросклероза (холестериновая теория атеросклероза) и, в целом, заболеваний сердечно-сосудистой системы, болезни Альцгеймера [2, 3] и др. Молекулы холестерина гидрофобны и образуют различные молекулярные комплексы с кислотами, белками, аминами, солями, что, вероятно и обуславливает сложности в установлении причинно-следственных связей в исследовании влияния холестерина на организм.
Возможности современных методик ядерномагнитно-резонансной (ЯМР) спектроскопии для исследования структуры и межмолекулярных взаимодействий внутри фосфолипидных мембран все еще сильно ограничены. Время протонной релаксации для фосфолипидных агрегатов мало в шкале ЯМР, что затрудняет такие исследования с помощью наиболее эффективной для подобных целей методики, основанной на использовании ядерного эффекта Оверхаузера. Кроме того, холестерин плохо растворим в воде, а большинство фосфолипидов не растворяются в органических растворителях. В связи с этим актуальной является задача поиска адекватных модельных систем, пригодных для изучения методом спектроскопии ЯМР высокого разрешения. В качестве компоненты такой системы нами был выбран додецилсульфат натрия (ДСН) как модель биологической мембраны.
В отличие от фосфолипидов, которые формируют бислои и мультислои в водных растворах, молекулы додецилсульфата натрия в растворах способны формировать мицеллы — относительно небольшие агрегаты сферической формы, распределенные по всему раствору, что делает ДСН подходящей модельной системой для изучения взаимодействия различных составляющих клеточных мембран и, в частности, холестерина с фосфолипидными мембранами [4—6].
Целью данной работы являлось исследование структуры и свойств молекулярного комплекса: холестерин — додецилсульфат натрия в растворе современными методами ЯМР высокого разрешения.
Материал и методы
Спектры ЯМР были записаны на импульсном ЯМР спектрометре с Фурье-преобразованием Bruker Avance 500 с частотой 1Н 500,13 МГц, 13С 125,758 МГц с использованием с 5 мм z-градиентного инверсного датчика при температуре 298±0,1 K. Образцы для экспериментов представляли собой растворы холестерина (концентрация 2 г/л), ДСН (концентрация варьировалась от 2 г/л до 80 г/л) и холестерина + ДСН (концентрация холестерина 2 г/л, ДСН — 80 г/л) в смешанном растворителе дейтерированный (степень дейтерирования 98%) ДМСО + Н2О (в соотношении 5:1), приготовленные непосредственно в стандартных 5 мм ампулах (XR-55). Объем каждого из образцов — 500 мкл. Химические сдвиги 1Н и 13С отсчитывали от соответствующих линий метоксиль-ных групп ДМСО (5 1Н 2,5 м.д., 5 13С 39,5 м.д.).
1Н ЯМР спектры записаны с использованием 90° импульсов длительностью 7.0 мкс и задержкой между импульсами 2 с; ширина спектра sw = 9,4 м.д. 13С ЯМР спектры записаны с использованием 45° импульсов и широкополосной развязки от протонов (длительность импульсов 14.0 мкс, задержка между импульсами 2 с, ширина спектра sw = 200 м.д.). Полное отнесение 1Н ЯМР спектров произведено с использованием 2D COSY, HSQC и HMBC экспериментов. Точность в измерении химических сдвигов 1Н и 13С составляла ± 0,01 м.д. и ± 0,1 м.д., соответственно. Для определения эффектов Оверхаузера проводились селективные 1D NOESY эксперименты [7, 8], для радиочастотного облучения образца использовали импульсы Гауссовой формы. Время между двумя накоплениями NOESY спектров было не менее, чем в три раза больше времени продольной релаксации Т1 для молекул ДСН и холестерина. Использовали времена смешивания 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,4; 0,6 и 0,8 с.
Результаты
Одномерная и двумерная ЯМР 1Н и 13С спектроскопия холестерина в растворе 1Н ЯМР спектр холестерина в растворе ДМСО + Н20 приведен на рис. 1. Сигналы в 1Н ЯМР спектре холестерина были соотнесены на основании литературных данных [9] и полученных нами данных 2D гомо- и гетерокорреляционных ЯМР экспериментов 2D COSY, HSQC (рис. 2) и HMBC (рис. 3).
Одномерная ЯМР 1Н и селективная NOESY спектроскопия додецилсульфата натрия Начальным этапом в этой части исследования были регистрация и анализ ЯМР 1Н спектров ДСН в растворе ДМСО при концентрациях ниже (2 г/л) и выше (80 г/л) критической концентрации мицел-лообразования [10]. Далее были получены ЯМР селективные 1D NOESY спектры для растворов ДСН в ДМСО с концентрациями 2 г/л (рис. 4) и 80 г/л (рис. 5).
Одномерная ЯМР 1Н и селективная NOESY спектроскопия комплекса додецилсульфата натрия и холестерина
Эксперименты с растворами ДСН и холестерина проводились при концентрации ДСН 80 г/л, то есть при условиях, когда молекулы ДСН в растворе образовывали мицеллы. Последнее дополнительно контролировалось с помощью 2D NOESY экспериментов. 1Н ЯМР спектры ДСН, холестерина, а также смеси холестерин + ДСН в растворе ДМСО + Н^ представлены на рис 6. Для установления образование молекулярного комплекса между холестерином и мицеллами, образованными молекулами ДСН, были проведены одномерные селективные NOESY эксперименты (рис. 7).
Обсуждение
Образование мицелл на основе додецилсульфата натрия в растворе ДМСО по данным ЯМР NOeSy спектроскопии 1Н ЯМР спектры ДСН (рис. 4с; рис. 5с) содержат четыре сигнала — это сигнал от метильной группы СН3-1, разрешены также сигналы от групп СН2-12 и СН2-11, сигналы же остальных СН2-групп алифа-
тической цепочки (СН2-(2-10)) резонируют в одной области и представляют собой один интенсивный широкий сигнал в районе 1,2—1,25 м.д. Видно, что химические сдвиги сигналов в спектре с большей концентрацией ДСН (80 г/л, рис. 5с) отличаются от химических сдвигов сигналов ДСН в растворе с меньшей концентрацией (2 г/л, рис. 4с). В частности, при увеличении концентрации наблюдается существенный сдвиг сигнала СН2-12 (+0,7 м.д) в слабые поля, положение сигнала СН2-11 практически не изменяется, в то же время сигналы групп СН2-(2-10) и СН3-1 испытывают небольшое смещение (-0,1 м.д.) в сильные поля. Такие изменения химических сдвигов свидетельствуют о появлении межмолекулярных комплексов, которыми являются мицеллы ДСН.
Для исследования образования различных молекулярных комплексов эффективным является использование метода NOESY. Известно, что максимальный наблюдаемый эффект Оверхаузера зависит от времени корреляции молекулярного движения, которое связано с размерами молекул [11, 12]. Эффект Оверхаузера оказывается положительным для малых молекул (молекулярная масса < 600) и отрицательным для больших молекул (молекулярная масса > 1200) [13]. Таким образом, ожидаемый эффект Оверхаузера для мономерной формы ДСН должен быть положительным, а для мицеллярной формы — отрицательным.
При низкой концентрации ДСН (2 г/л) (рис. 4) в спектрах ЯМР селективного 1й NOESY [7, 8] при облучении образца на частоте сигнала группы СН2-12 наблюдается эффект Оверхаузера для атомных групп СН2-11 и одной из групп, вносящих вклад в интенсивный сигнал СН2-(2-10), которой, вероятнее всего, является группа СН2-10, наиболее близкая по расположению к облучаемому сигналу. При облучении образца на частоте сигнала СН2-11 соответственно наблюдается эффект Оверхаузера для сигналов СН2-10 и СН2-12. Все наблюдаемые эффекты Овер-хаузера являются положительными и, следовательно, соответствуют эффектам Оверхаузера для малых молекул, и ДСН при данной концентрации находится в мономерной форме. При высокой концентрации ДСН в растворе ДМСО (80 г/л) (рис. 5) в спектрах селективного 1й NOESY при облучении образца на частоте сигнала группы СН2-12 наблюдается эффект Оверхаузера для сигнала группы СН2-10. При облучении образца на частоте интенсивного сигнала от групп СН2-(2-10) наблюдается отрицательный эффект Оверхаузера и для группы СН3-1 и для группы СН2-11. Это соответствует области эффектов Оверхаузера для больших молекул, следовательно, в растворе ДСН присутствует в мицеллярной форме.
Диметилсульфоксид (ДМСО) представляет собой апротонный органический растворитель, соответственно, в растворе ДМСО молекулы ДСН могут образовывать обратный тип мицелл [14].
Рис. 1.1Н ЯМР (500,13 МГц] спектр холестерина в растворе ДМСО + Н20 (концентрация 2 г/л] при Т=2 98 К. На рисунке также показана химическая структура молекулы холестерина с нумерацией атомов
Рис. 2.2D 1Н-13С HSQС (1Н 500,13 МГц, 13С 125,758 МГц] ЯМР спектр холестерина в растворе ДМСО + Н20 (концентрация 2 г/л] при Т=298 К
СМ
Рис. 3.2D 1Н-13С НМВС (1Н 500,13 МГц, 13С 125,758 МГц] ЯМР спектр холестерина в растворе ДМСО + Н20 (концентрация 2 г/л] при Т=298 К
Рис. 4.1Н ЯМР (500,13 МГц] спектр (с] и селективные Ю NOESY спектры (а, Ь] ДСН в растворе ДМС0+Н20 при Т=298 К (концентрация ДСН 2 г/л]. Стрелкой показан сигнал, на частоте которого прикладывался селективный радиочастотный импульс. Время смешивания тм = 400 мс
1.1 3.1 ІЛ і.! 1Л 1.! 1.0 «.! &.0
Ґ1 (ид)
СнГ13
1.! +о 3.5 ю г.! ;.о і.; ю о.о
П <«Ц)
сЛі-и-іО)
-Г----------’---------1--------->------- I --------■---------1--------->------- I ---------’--------1---------'---------1---------1---------Г--------->------- 1 --------1---------1
4$ и 1Ї Ы І5 Ї-0 1-5 ІЛ п.5 Ьй
'Пил)
Рис. 5.1Н ЯМР (500,13 МГц] спектр (с] и селективные Ю NOESY спектры (а, Ь] ДСН в растворе ДМСО + Н20 при Т=298 К (концентрация ДСН 80 г/л]. Стрелкой показан сигнал, на частоте которого прикладывался селективный радиочастотный импульс. Время смешивания тм = 50 мс
Рис. 6.1Н ЯМР (500,13 МГц] спектры ДСН (а], холестерина (Ь], а также смеси ДСН + холестерин (с] в растворе ДМСО + Н20 при Т=298 К. На рисунке также показана химическая структура молекулы холестерина и молекулы ДСН с нумерацией атомов
Рис. 7. Селективный 1D NOESY спектр (снизу) и 1Н ЯМР (500,13 МГц) спектр (сверху) смеси холестерина + ДСН в растворе ДМСО + Нг0 при Т=P98 К. Время смешивания тм = 50 мс. На рисунке также показана химическая структура молекулы холестерина и молекулы ДСН с нумерацией атомов, стрелкой показаны атомы, для которых наблюдается эффект Оверхаузера
Комплексообразование «холестерин - додецилсульфата натрия» в растворе ДМСО по данным ЯМР спектроскопии
Химические сдвиги сигналов ДСН (рис. 6а) и холестерина (рис. 6Ь) в ДМСО по отдельности практически не отличаются от химических сдвигов тех же сигналов в спектре смеси ДСН + холестерин (рис. 6с). Небольшие отличия наблюдаются лишь для сигналов циклической части холестерина для атомов, наиболее близких к ОН-группе. Это означает, что если в растворе имеет место взаимодействие между молекулами холестерина и мицеллами ДСН, то в нем принимает участие ОН-группа молекулы холестерина.
Наличие молекулярного комплекса «холестерин — мицеллы ДСН» устанавливалось с помощью одномерных селективных NOESY экспериментов (рис. 7) [7, 8]. Радиочастотное облучение образца проводилось на частотах сигналов ДСН и холестерина, не перекрывающихся с другими сигналами: ОН, СН3-18, СН-6 групп холестерина, а также СН2-12 группы ДМСО. При радиочастотном воздействии на образец на частоте сигнала ОН-группы холестерина в селективном 1й NOESY спектре наблюдаются сигнал молекул воды, сигнал от СН3-1 группы ДСН и сигнал от одной из СН2 групп алифатической цепи молекулы ДСН.
Вероятнее всего, им является сигнал от СН2-2 группы ДСН, ближайшей к метильной группе СН3-1 ДСН. Это означает, что наблюдается диполь-дипольное взаимодействие ОН-группы холестерина с концевыми группами гидрофобной части ДСН (рис. 7), что соответствует их близкому пространственному расположению и наличию комплекса между холестерином и мицеллами ДСН. Схематическое изображение комплекса приведено на рис. 8.
Данное наблюдение хорошо согласуется с реальными молекулярными системами. При взаимодействии холестерина с фосфолипидными мембранами, он проникает в пространство между гидрофобными «хвостами» фосфолипидных бислоев [15, 16] и, таким образом, близость ОН-группы холестерина и концевых алифатических групп ДСН оказывается аналогичной близкому расположению тех же групп холестерина и атомов алифатических цепочек фосфолипидных молекул. Отличие лишь в том, что в фосфолипидных мембранах холестерин «глубже» проникает в пространство между гидрофобными «хвостами» фосфолипидных молекул, а в модельной системе холестерин взаимодействует практически только с поверхностью мицелл ДСН, о чем свидетельствует отсутствие в 1й NOESY спектре сигналов групп СН2-(3..12) при облучении ОН-группы холестерина.
Заключение
На основании проведенных ЯМР экспериментов было установлено, что додецилсульфат натрия образует в растворе ДМСО обратные мицеллы при концентрации выше критической концентрации ми-целлообразования. Молекулы холестерина образуют молекулярный комплекс с мицеллами додецил-сульфата натрия путем взаимодействия ОН-группы
холестерина с концевыми алифатическими группами СНЗ-1 и СН2-2 молекулы додецилсульфата натрия. Такое взаимодействие имеет сходство с поведением холестерина в фосфолипидных бислойных мембранах, в которых холестерин проникает своей циклической частью в пространство между гидрофобными «хвостами» фосфолипидных молекул, ориентируясь преимущественно ортогонально к бислоям.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Yeagle P.L. Cholesterol and the cell membrane. Biochim. Biophys. Acta. 1985; 822: 267-87.
2. Borroni B., Pettenati C., Bordonali T. et al. Serum cholesterol levels modulate long-term efficacy of cholinesterase inhibitors in Alzherimer disease. Neuroscience Lett. 2003; 343: 213-5.
3. Mironov V.S., Galyametdinov Y.G., Ceulemans A. et al. J. Chem. Phys. 2000; 113: 10293-303.
4. Wang G., Keifer P., Peterkofsky A. Solution structure of the N-terminal amphitropic domain of Escherichia coli glucose-specific enzyme IIA in membrane-mimetic micelles. Protein Science 2003; 12: 1087-96.
5. Blokhin D.S., Efimov S.V., Klochkov A.V. et al. Spatial structure of the decapeptide Val-Ile-Lys-Lys-Ser-Thr-Ala-Leu-Leu-Gly in water and in a complex with sodium dodecyl sulfate micelles. Appl. Magn. Reson. 2011; 41(2): 267-82.
6. Henry G.D., Sykes B.D. Methods to study membrane protein structure in solution. Methods in Enzymology 1994; 239: 515-35.
7. Stonehouse J., Adell P., Keeler J. et al. Ultrahigh-quality NOE spectra. J. Am. Chem. Soc. 1994; 116: 6037-8.
8. Stott K., Stonehouse J., Keeler J. et al. Excitation sculpting in high-resolution nuclear magnetic resonance spectroscopy: application to selective NOE experiments. J. Am. Chem. Soc. 1995; 117: 4199-200.
9. Castagne D., Dive G., Evrard B. et al. Spectroscopic studies and molecular modeling for understanding the interactions between
cholesterol and cyclodextrins. J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 2010; 13(2): 362-77.
10. Singh H.N., Singh S., Tewari K.S. Surface active anions in polar solvents: Conductometric studies on solutions of sodium decyl and dodecyl sulfate in water, N,N-dimethylformamide, and dimethyl sulfoxide. Journal of the American oil chemists society. 1995; 52: 436-8.
11. Ernst R.R., Bodenhausen B., Wokaun A. Principles of nuclear magnetic resonance in one and two dimensions. Oxford: Oxford University Press; 1987.
12. Gadiev T.A., Khairutdinov B.I., Antipin I.S. et al. Analysis of the spatial structure of calixarenes in solutions by 2-D NMR (NOESY) spectroscopy. Appl. Magn. Reson. 2006; 30(2): 65-73.
13. Gordon S.R., Hitchens T.K. Fundamentals of Protein NMR spectroscopy. Dordrecht: Springer; 2006.
14. Elles Ch.G., Levinger N.E. Reverse micelles solubilizing DMSO and DMSO-water mixtures. Chemical Physics Letters 2000; 317: 624-30.
15. Robinson A.J.; Richards W.G., Thomas P.J. et al. Behavior of cholesterol and its effect on head group and chain conformations in lipid bilayers: a molecular dynamics study. Biophysical Journal 1995; 68: 164-70.
16. Tiburu E.K., Dave P.C., Lorigan G.A. Solid-state 2H NMR studies of the effects of cholesterol on the acyl chain dynamics of magnetically aligned phospholipid bilayers. Magn. Reson. Chem. 2004; 42: 132-8.
Поступила 19.08.9019
