CC BY
60
УДК 616.211
ПРОВОКАЦИОННЫЙ НАЗАЛЬНЫЙ ТЕСТ С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В НАЗАЛЬНОМ ЛАВАЖЕ У ПАЦИЕНТОВ С АЛЛЕРГИЧЕСКИМ РИНИТОМ Щурок И.Н., д.м.н., проф. Новиков Д.К.
УО «Витебский государственный медицинский университет», Республика Беларусь, 210023, Витебск, пр. Фрунзе, 27. Shchurok. [email protected] - Щурок Ирина Николаевна
Резюме. Данное исследование описывает метод диагностики аллергического ринита с помощью оценки миелопероксидазной активности назального лаважа при проведении провокационного назального теста с аллергеном клеща рода Dermathophagoides pteronyssinus .В исследуемой группе у пациентов с аллергическим ринитом у 53% наблюдался достоверный прирост миелопероксидазной активности в назальном лаваже, что является критерием нейтрофильного воспаления слизистой, т.е. подтверждением гиперчувствительности слизистой оболочки в целом. Определение прироста биомаркера аллергической реакции является объективным критерием для оценки провокационного назального теста. Повышение миелопероксидазной активности в назальнам лаваже при провокации аллергеном подтверждает факт клеточно-опосредованных реакций на аллерген, расширяя тем самым понимание аллергического воспаления на слизистых оболочках.
Ключевые слова: аллергический ринит, провокационный назальный тест, назальный лаваж,миелопероксидаза,. PROVOCATIVE NAZAL TEST WITH DETERMINATION OF MIELOPEROXIDASE ACTIVITY IN NAZAL LAVAGE IN PATIENTS WITH ALLERGIC RHINITIS. Shchurok I. N., Doctor of Medicine, professor Novikov D. K.
Vitebsk state medical University,
27, Frunze Ave., Vitebsk, 210023, Republic of Belarus
Abstract. This study describes a methodfor diagnosing allergic rhinitis by evaluating the myeloperoxidase activity of nasal lavage in a provocative nasal test with the mite allergen of the genus Dermathophagoides pteronyssinus. In the study group, a significant increase in myeloperoxidase activity in nasal lavage was observed in patients with allergic rhinitis in 53% who are a criterion for neutrophil inflammation of the mucosa, i. e. confirmation of hypersensitivity of the mucosa as a whole. Determining the increment of the biomarker of an allergic reaction is an objective criterion for evaluating a provocative nasal test. The increase in myeloperoxidase activity in nasal lavage during allergen provocation confirms the fact of cell-mediated reactions to the allergen, thereby expanding the understanding of allergic inflammation in the mucous membranes. Key words: allergic rhinitis, provocative nasal test, nasal lavage, myeloperoxidase
Введение. Аллергический ринит является следствием реакции слизистой оболочки носа на аллерген, которая сопровождается освобождением медиаторов воспаления, цитокинов, хемокинов и факторов роста [1;2]. Изменения уровня медиаторов и ферментов могут быть использованы в качестве биомаркеров для диагностики и оценки эффективности методов лечения. Изучение различных профилей цитокинов, медиаторов в носовой секреции в разные моменты времени могут оказаться полезными в качестве диагностического инструмента [8]. Так основными эффекторными клетками при аллергических заболеваниях являются лейкоциты - базофилы (тучные клетки), гранулоциты - эозинофилы и нейтрофилы [1, 2, 3, 4]. На поверхности всех лейкоцитов имеются Fc-рецепторы, которые связывают Fc-фрагменты иммуноглобулинов различных классов (IgG, IgE, IgA), в том числе обладающие специфичностью антител. Поэтому, с одной стороны, лейкоциты с помощью этих антител могут специфично взаимодействовать с антигенами-аллергенами, с другой - концентрация антител в крови снижается и нередко из-за этого они не выявляются в сыворотке крови. Базофилы и эозинофилы имеют FceRI-рецепторы, связывающие IgE, а нейтрофилы несут Fcy , фиксирующие IgG, и FceRII CD23 (низкоаффинные) и лектин-галектин 3, способный связывать IgE. У больных аллергией на нейтрофилах кроме низкоаффинного рецептора FceRII появляются высокоаффинные - FceRI [1, 2, 4]. После связывания этих IgE-антител с аллергеном лейкоциты, несущие их, активируются, дегранулируют и секретируют медиаторы и ферменты: эозинофильный катионный белок, эозинофильную пероксидазу, нейтрофилы -миелопероксидазу, эластазу и другие ферменты.
В нейтрофилах расположены первичные (азурофильные) и вторичные (специфические) гранулы, образовавшиеся в процессе созревания. Первичные гранулы содержат главным образом миелопероксидазу (МПО), несколько протеаз и антибиотические дефензин-пептиды, все высвобождаются в потенциально активном состоянии [8]. Специфические гранулы хранят скрытые проформы преимущественно металлопротеаз, активированные азурофильными протеазами сначала после дегрануляции [8]. Высокоцитотоксическая миелопероксидаза из первичных гранул использовалась в качестве маркера активности нейтрофилов [1]. Поэтому данные белки при аллергии присутствуют в различных биологических жидкостях (носовой секрет, слюна, лаважная жидкость и др.)
Концепция минимального персистирующего воспаления (Minimal Persistent Inflammation) является одним из ключевых понятий в аллергологии. Согласно этой концепции, аллергический воспалительный процесс имеет место постоянно (даже при полном отсутствии симптоматики) у пациентов с аллергией, подвергающихся воздействию аллергенов. Минимальное персистирующее воспаление характеризуется инфильтрацией воспалительными клетками (эозинофилами и нейтрофилами), дегрануляцией медиаторов воспаления, а также экспрессией молекул адгезии [4]. Отек слизистой оболочки при аллергическом воспалении обусловлен преимущественно переполнением капилляров венозной кавернозной сети слизистой оболочки. В настоящее время установлено, что для пациентов, склонных к аллергическим реакциям, характерны особенности иммунного ответа, обусловливающие частое развитие ОРЗ. Также обострение АР могут вызвать не только аллергены, но и непосредственно сами возбудители ОРЗ. Таким образом, формируется
замкнутый круг: склонность к аллергии провоцирует внедрение респираторных вирусов, а затем вирусы способствуют развитию клинических симптомов аллергии [4].
Учитывая вышесказанное, определение биомаркеров воспаления методом провокационного тестирования является патогенетическим аспектом для прогнозирования течения заболевания. Провокационный тест («challenge test») — метод выявления сенсибилизации (аллергии), основанный на введении аллергена в орган-мишень. Респираторные (дыхательные) провокационные тесты (назальный, конъюнктивальный, бронхиальный) служат объективным «золотым стандартом» определения значимой клинической гиперчувствительности (аллергии).
Цель нашего исследования - разработка и апробация провокационного назального теста с аллергеном клеща Dermathophagoides pteronyssinus по приросту пероксидазной активности в назальном лаваже .
Материалы и методы исследования. Проведено одноцентровое исследование. на базе аллергологического отделения УЗ «Витебская областная клиническая больница» и кафедры клинической иммунологии и аллергологии с курсом ФПК и ПК УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет» в 2017 году. В исследовании приняли участие 30 пациентов с верифицированным диагнозом аллергического ринита и 20 здоровых добровольцев без аллергопатологии на основании скрининг опросников. Средний возраст добровольцев составил 22 года распределение по полу м/ж=4/16. Диагноз аллергического заболевания верифицировался по жалобам, анамнезу, положительным при предшествующих обследованиях кожным пробам с бытовыми аллергенами, объективного обследования. Средний возраст пациентов с аллергическим ринитом составил 35 , распределение по пол, м/ж =9/21 (таблица 1).
Таблица 1. Демографическая характеристика участников исследования
Показатели Группы
Пациенты с аллергическим ринитом n=30 Здоровые добровольцы n=20 Все исследуемые n=50
Возраст ,г 35[31;40] 22[21;22] 30[21;40]
Пол, м/ж 9/21 4/16 13/37
Примечание: данные представлены как М[-ДИ;+ДИ].
Критериями включения в исследуемую группу были некурящие пациенты с верифицированным диагнозом аллергического ринита вне обострения на основании анамнеза, клинической картины, осмотра, положительного кожного тестирования с аллергеном клеща рода Dermathophagoides pteronyssinus; TNSS не менее 2.
Для контрольной группы критерии включения были отсутствие в анамнезе аллергического ринита и отрицательного результата кожного тестирования. Критерии исключения: структурный дефект носа, полипы носа, инфицирование верхних дыхательных путей в течение 4 недель до исследования, синусит, беременность, грудное вскармливание, текущая иммунотерапия, наличие гиперчувствительности и аллергии, прием антигистаминных, антилейкотриеновых препаратов и интраназальных кортикостероидов.
До участия в исследовании каждый участник давал письменное информированное согласие после того, как был проинформирован устно и письменно. Согласие, полученное от участников, также включало согласие на публикацию и отчетность участников. Исследование было одобрено комитетом по этике Витебского государственного медицинского университета и выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией (Поправка Somerset West, 1996). Оценивали влияния заболевания на качество жизни (опросник пациента с аллергическим ринитом RQLQ), назальные симптомы оценивали с помощью общего индекса назальных симптомов (опросник TNSS- Total Nasal Symptoms Score), Показания к применению: выявление аллергических и неспецифических реакций на аллергены, определение уровня миелопероксидазной активности как объективного критерия для оценки оптимизированного минимального провокационного назального теста Противопоказания: метод не имеет абсолютных противопоказаний. Относительные противопоказания: повреждения и заболевания ротовой полости; гипосаливация у больного - менее 1 мл слюны; гнойно - воспалительные заболевания ЛОР-органов.
Перечень необходимого оборудования: центрифуга (8000 об/мин), стерильные пробирки 10-20 мл (20-30 шт.), микропробирки 1,5 мл с крышкой (10-20 шт.), микроворонка (10 шт), нейлоновые фильтры (10 шт.), холодильник, автоматические дозаторы 20-200 мкл, планшеты плоскодонные полистироловые для иммуноферментного анализа (ИФА), автоматический ИФА анализатор. Реактивы: физиологический 0,9% раствор хлорида натрия на фосфатном буфере (ФРФ) рН 7,2, фосфат-цитратный буферный раствор с рН 5,0, дистиллированная вода, перекись водорода 0,015% раствор, хромоген: тетраметилбензидин (ТМБ), серная кислота 4%, физиологический раствор хлорида натрия 0,9%, дозированный интраназальный распылитель, водно-солевые растворы аллергенов. Метод включал несколько этапов: Назальный лаваж и сбор носового секрета.
Пациенты и здоровые за 12 часов до тестирования не употребляли алкоголь, продукты с кофеином, противоаллергические лекарственные средства (антигистаминные, глюкокортикостероиды, антилейкотриеновые препараты), не курили, исключали продукты с высокими аллергенными свойствами. Исследование проводилось натощак. 1. Сбор назального лаважа проводился перед воздействием аллергена и через 30 минут после провокации. Назальные лаважи проводили с предварительно нагретым до комнатной температуры стерильным физиологическим раствором, который вводили в обе ноздри участников с помощью шприца с распылителем. Назальную воронку помещали к носовому входу, чтобы предотвратить утечку промывной жидкости. Участники наклоняли голову вперед и вниз. Перед провокацией обе ноздри промывали 6 мл физиологического раствора, и полученную жидкость собирали в микропробирки в течение 1 минуты. Назальный лаваж центрифугировали 10 минут при 8000 об,мин., затем надосадочную жидкость фильтровали через синтетический нейлоновый фильтр (проба Но).
2. Провокационный назальный тест проводился методом инстиляции водно-солевым раствором аллергена клеща рода Dermatophagoides pteronyssinus в носовой ход с помощью дозированного интраназального распылителя в количестве 10 PNU («Биомед», Москва) без наращивания дозы. Эту оптимальную минимальную дозу аллергена определяли путем предварительного тестирования больных с аллергическим ринитом. Концентрация была такой, которая вызывала минимальную положительную реакцию при кожном тестировании (2-3 мм)
3. Через 30 минут после провокационного теста собирали назальный лаваж (проба Н1) аналогичным образом.
4. Определение уровня пероксидазной активности в назальном лаваже.[4]
В лунки планшета для ИФА вносили носовой секрет в объеме 100 мкл, собранный до проведения провокационного теста, а также по 100 мкл носового секрета после провокации. Все пробы дублировали. Добавляли проявляющий раствор. Во все лунки планшеты для ИФА добавляли по 100 мкл хромоген-субстратной смеси (0,015% перекись водорода и ТМБ, разведенными фосфат-цитратным буфером с рН 5,0). Проявляющий раствор готовили непосредственно перед внесением; Инкубировали при комнатной температуре в течение 10-25 мин до появления выраженного окрашивания синего цвета. Реакцию останавливали внесением 100 мкл 4% серной кислоты, цвет раствора изменяли на желтый.
5. Учет результатов.
Реакцию оценивали через 10 минут на ИФА анализаторе при длине волны 450 нм. Статистическая обработка и представление данных
Для исключения ложноположительных реакций контролем положительной реакции считалась начальная оптическая плотность пробы до провокационного теста не меньше 0,600 единиц, При отсутствии прироста пероксидазной активности или уменьшения оптической плотности опытной пробы результат считался отрицательным и приравнивался нулю. Полученные данные не имели характер нормального распределения. Для статистического анализа применяли непараметрический метод (критерий Манна--Уитни (М-U)). Значения показателей приводятся в виде медианы Ме (LQ;UQ). Различия считали достоверными при вероятности р<0,05.Сравнение переменных до и после провокации проводилось отдельно для каждой группы. Статистическая обработка и представление данных производилась с помощью программы Statistica 10. Полученные данные по назальному лаважу имели характер нормального распределения. Для статистического анализа применяли параметрический метод T-test, достоверность р<0,05 (критерий Стьюдента), значения представлены в виде среднего значения (М) и среднего квадратичного отклонения (s). При анализе корреляция между результатами кожного тестирования и уровнем пероксидазной активности, которые были обнаружены в первичном анализе для пациентов с аллергическим ринитом, была рассчитана с использованием коэффициента корреляции Спирмена. Размер выборки в этом исследовании не был рассчитан априори, но был определен по возможности.
Результаты и обсуждение. Тридцати пациентам с персистирующим аллергическим ринитом и двадцати здоровыми участниками произведен провокационный назальный тест аллергеном клеща рода Dermatophagoides pt. c целью изучения миелопероксидазной активности назального лаважа. Ни у кого из участников не было серьезных побочных эффектов. Мы не наращивали дозы аллергенов до появления клинических симптомов как при проведении провокационного назального теста в классическом исполнении.
Средний общий показатель назальных симптомов по оценке шкалы TNSS до провокации у здоровых участников и пациентов с аллергическим ринитом достоверно различался (^<0,05) . Учитывая факт, что провокация не вызвала клинических проявлений, данные различия сохранились и после провокационного теста.
Уровень миелопероксидазной активности в назальном лаваже у пациентов с аллергическим ринитом составил 1,38±0,74 Eоп. У здоровых этот уровень был достоверно ниже 0,71±0,45 Еоп (р=0,027) Выявленный у пациентов с аллергическим ринитом достоверно повышенный уровень миелопероксидазы в назальном лаваже (р=0,027) может являтся критерием нейтрофильного воспаления слизистой, т.е. подтверждением гиперчувстсительности слизистой оболочки носа в целом [7].
Выявлена прямая умеренная корреляция между уровнем миелопероксидазы назальном лаваже до провокации и результатами кожного тестирования в контрольной группе R= 0,46 (коэфициент Спирмена).
При изучение миелопероксидазной активности в назальном лаваже после проведения провокационного назального теста выявлена, что у 16 больных с аллергическим ринитом, т.е. у 53% пациентов с аллергопатологией происходил достоверный прирост (свыше 16%) миелопероксидазной активности в назальном лаваже р=0,03 Средний прирост МПО в назальном лаваже у пациентов, ответивших на ПНТ, составил 25,8%.
Выводы. Повышение уровня миелопероксидазной активности в назальном лаваже у пациентов с аллергическим ринитом в сравнении с группой контроля является критерием нейтрофильного воспаления слизистой, т.е. подтверждением гиперчувствительности слизистой оболочки в целом.
У 60% пациентов с аллергическим ринитом определяется достоверный прирост миелопероксидазной активности в назальном лаваже после провокационного назального теста, что служит диагностическим критерием аллергического заболевания с нейтрофильной гиперчувствительностью. Определение прироста биомаркера аллергической реакции является объективным критерием для оценки провокационного назального теста.
Повышение миелопероксидазной активности в назальнам лаваже при провокации аллергеном подтверждает факт клеточно-опосредованных реакций на аллерген, расширяя тем самым понимание аллергического воспаления на слизистых оболочках. Литература
1. Новиков Д.К., Новиков П.Д. Клиническая иммунопатология: руководство. М.: Мед. лит. - 2009. C.464.
2. Новиков П.Д. Иммунодиагностика. Витебск, 2006, 250 с.
3. Аллергологи и иммунология. Национальное руководство. Краткое издание/ под ред. Р.М.Хаитова, Н.И. Ильиной.-М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012.-640с.
4. Новиков П.Д., Новикова Н.Д. Диагностика аллергии в реакции выброса миелопероксидазы под влиянием аллергена //Иммунопатология, аллергология, инфектология - 2002; №1: 63-68.
5. Титова Н.Д. Применение реакции выброса миелопероксидазы гранулоцитами для диагностики аллергии к пищевым добавкам //Клиническая лабораторная диагностика. - 2011. - №2. - С.42-45.
6. Трансбуккальный метод диагностики аллергии по увеличению пероксидазной активности в слюне / Д. К. Новиков [и др.]. 2015; №4: 35-43.
7. Щурок И.Н. Повышение пероксидазной активности в носовом лаваже и слюне у пациентов с аллергическим ринитом //Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2017. - №2. P.82-86.
8. König, K., Klemens, C., Eder, K. et al. Cytokine profiles in nasal fluid of patients with seasonal or persistent allergic rhinitis. Allergy Asthma Clin Immunol. 2015. P.11-26
УДК 616.24-007
ВЛИЯНИЕ ВОДНОГО ЭКСТРАКТА ТАБАКА СИГАРЕТ НА ВЫБРОС МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ ЛЕЙКОЦИТАМИ И ЭКСПРЕССИЮ ЦИТОКИНОВ У КУРИЛЬЩИКОВ С ХОБЛ
Научный руководитель:к.м.н., доцент Ищенко О.В., д.м.н., проф. Новиков Д.К
УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет»
Беларусь, 210023, Витебск, пр-т Фрунзе, 27.
tatyana. [email protected] - Юпатова Татьяна Геннадьевна
Резюме. В результате исследования выявлена гиперчувствительность лейкоцитов к табаку, проведена оценка воспалительного ответа у курильщиков с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) и курильщиков с нормальной легочной функцией. Установлено, что нейтрофилы курильщиков с ХОБЛ и курильщиков с нормальной легочной функцией реагировали на водный экстракт табака увеличением активности МПО. Максимальный прирост МПО выявлен у 8 из 12 пациентов. У 40% здоровых курильщиков активность МПО была выше 250%. В этих группах выявлен прирост ФНОа. Уровень ИЛ-lß увеличился у каждого курильщика с ХОБЛ и здорового курильщика. Реакция выброса МПО нейтрофилами может использоваться для диагностики гиперчувствительности нейтрофилов к табаку у пациентов с ХОБЛ и здоровых курильщиков, а также выявлять группу риска по развитию обструктивного заболевания. Ключевые слова: хроническая обструктивная болезнь легких, водный экстракт табака, нейтрофилы, миелопероксидаза, ФНОа, ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-4.
INFLUENCE OF WATER CIGARETTE TOBACCO EXTRACTION ON MYELOPEROXIDASE EMISSION BY LEUKOCYTES AND EXPRESSION OF CYTOKINS IN SMOKERS WITH COPD
Yupatova T. G., Candidate of Medicine, assistant professor Ishchenko O. V., Doctor of Medicine, professor, Novikov D. K.
Vitebsk state medical University, 27, Frunze Ave., Vitebsk, 210023, Republic of Belarus Abstract. This study is devoted to the hypersensitivity of leukocytes to extract of tobacco and assessing the inflammatory response in smokers with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and smokers with normal pulmonary function. The MPO release from neutrophils occurred during the incubation of leukocytes with extract of tobacco in patients with COPD and healthy smokers. The maximum MPO level was found in 8 from 12 patients. 40% of healthy smokers had MPO activity above 250%. In these groups, an increase in TNFa was revealed. The level of IL-lß increased in every smoker with COPD and a healthy smoker. The reaction of MPO release to neutrophils can be used for diagnosis of the neutrophils hypersensitivity to extract of tobacco in patients with COPD and healthy smokers, and to identify the risk group for the development of obstructive disease.
Key words: chronic obstructive pulmonary disease, myeloperoxidase, extract of tobacco, hypersensitivity Введение. Основным патогенетическим фактором развития хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) является вдыхание токсикантов. Токсиканты, включая сигаретный дым, действуют, в первую очередь, на эпителий слизистой оболочки бронхов и клетки врожденного иммунитета (дендритные, макрофаги, нейтрофилы) через Toll -рецепторы, это приводит к выделению группы провоспалительных цитокинов (ФНОа, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, хемокинов и др.) [1]. В развитии обструктивных заболеваний важную роль играют МПО, металлопротеазы, элластаза, катепсин G, протеиназа-3, лактоферрин, простагландины, тромбоксан, интерлейкин-8 (ИЛ-8), фактор некроза опухоли - а (ФНОа) и др. МПО, ИЛ-8, лейкотриен В4 используют в качестве маркеров активации нейтрофилов [2].
В предыдущих исследованиях мы показали, что у лиц с хронической бронхолегочной патологией после инкубации с токсикантами происходит дегрануляция нейтрофилов и выброс МПО [2].
Целью настоящего исследования было изучить влияние водного экстракта табака сигарет на выброс миелопероксидазы лейкоцитами и экспрессию цитокинов у курильщиков с ХОБЛ.
Методика. Исследование проведено на базе пульмонологического отделения УЗ «ВОКБ» и кафедры клинической иммунологии и аллергологии с курсом ФПК и ПК УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет» в 2017 году. Обследованы 12 курящих мужчин с верифицированным диагнозом ХОБЛ, II-III степени тяжести (критерии GOLD), средний возраст составил 59,3±3,1 лет, ОФВ1 49±12,5%. Контрольную группу составили курящие мужчины n=10, с нормальной легочной функцией - ОФВ1 102±12,4%, средний возраст 56,3±5,1 лет. Пациенты были однородны по полу и возрасту. Перед проведением исследования все участники заполнили добровольное информированное согласие. Пациенты за 12 часов до тестирования не употребляли алкоголь, продукты с кофеином, никотин, исключали продукты с высоким гликемическим индексом. Противоаллергические лекарственные средства
