CC BY
33
УДК 618.145-007.415-07
ПРОЦЕССЫ ЦИТОКИН- И НИТРОКСИДЕРГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ПРИ НАРУЖНОМ ГЕНИТАЛЬНОМ ЭНДОМЕТРИОЗЕ, АССОЦИИРОВАННЫМ С БЕСПЛОДИЕМ
Е.Е. Привалова, С.Н. Теплова, Б.И. Медведев, Л.Ф. Зайнетдинова ЧГМА, г. Челябинск
Установлено достоверное повышение количества цитокинов (УЕвЕ, ЕСЕ и 1Ь-12) и уровня конечных стабильных метаболитов оксида азота в циркуляции у женщин репродуктивного возраста при наличии наружного генитального эндометриоза, ассоциированного с бесплодием. В перитонеальной жидкости установлено трехкратное достоверное увеличение уровня факторов роста (УЕОГ, ЕСБ1) без существенного подъема количества 1Ь-12. Выявлена утрата негативной сильной корреляционной связи менаду уровнями эпидермального фактора роста в крови и количеством 1Ь-12, характерной для здоровых женщин, и появление корреляционных связей, отсутствующих в физиологических условиях.
Ключевые слова: наружный генитальный эндометроз, бесплодие, васкулоэн-дотелиальный фактор роста, эпидермальный фактор ростау интерлейкин-12, оксид азота.
Введение. Эндометриоз относится к распространенным заболеваниям женской половой системы, занимая третье место в структуре гинекологической патологии после воспалительных процессов и миомы матки. В 30-60 % случаев эндометриозу сопутствует бесплодие, что определяет важное ме-дико-социальное значение данной проблемы [1-4].
До настоящего времени неизвестно, почему часть отторгнутых клеток эндометрия сохраняет не только свою жизнеспособность и активность, но и способность к имплантации и пролиферации вне полости матки. Недостаточно изучены моле-кулярно-биологические аспекты эндометриоза, которые по своим особенностям относятся к аномалиям роста клеток.
Одним из интенсивно развиваемых направлений изучения проблемы эндометриоза является обоснование значимости особенностей иммунного ответа на эктопическое разрастание ткани эндометрия. У женщин с эндометриозом увеличено содержание перитонеальных макрофагов [5], усилена их биохимическая и секреторная активность [7, 8], а в самой перитонеальной жидкости повышено содержание провоспалительных цитокинов. На этом основании предполагается, что гиперактивация перитонеальных макрофагов с последующим усилением продукции ими провоспалительных цитокинов и ростовых факторов создает в перитонеальной полости условия, благоприятные для развития эндометриоидных гетеротопий [5, 8]. В развитие иммунологической гипотезы патогенеза эндометриоза нами было предпринято изучение некоторых патогенетически значимых факторов контроля клеточного роста и характера иммунного ответа на системном и локальном уровнях у женщин с эндометриозом.
Цель исследования: анализ процессов системной и локальной цитокин- и нитроксидергиче-ской регуляции у женщин с наружным генитальным эндометриозом, ассоциированным с бесплодием, для выявления их значимости в патогенезе гетеротопического роста эндометрия.
Материалы и методы. Нами обследовано 24 женщины, госпитализированных для манипуляционной лапароскопии по поводу бесплодия. Из них в 1-ю группу вошли 12 пациенток с наружным генитальным эндометриозом (НГЭ) и бесплодием. Вторую группу составили 12 женщин с бесплодием и без признаков НГЭ. Третья (контрольная) группа включала 10 здоровых фертильных женщин. Средний возраст пациенток 1-й группы составил 32,40 ± 1,74, 2-й группы 32,80 ± 1,09 года. На момент обследования женщины не получали медикаментозную терапию.
Классификацию эндометриоза на 1-4-й стадии заболевания проводили в соответствии с предложениями Американского общества фертильности (R-AFS, 1985), учитывающих локализацию, площадь, глубину поражения, наличие спаечного процесса.
Материалом для исследования служила перитонеальная жидкость (ПЖ), взятая во время лапароскопии, и сыворотка крови.
Определяли уровень васкулоэндотелиального (VEGF) и эпидермального (EGF) факторов роста с помощью твердофазного иммуноферментного метода с тест-системами производства компании Cytimmune (Maryland). В системе использованы мышиные моноклональные и биотинилированные кроличьи античеловеческие антитела против VEGF и EGF. Чувствительность тест-системы VEGF 18,6 пг/мл, a EGF - 8,3 пкг/мл. Учет реакции проводили
на планшетном фотометре «Multiscan plus» (Lab-system) при длине волны 490 нм.
Уровень интерлейкина-12 (IL-12) определяли с использованием твердофазного иммунофермент-ного анализа с тест-системой Biosource Internetional Inc., при длине волны 450 нм, чувствительность тест-системы составляет 2 пк/мл.
Уровень продукции эндогенного оксида азота (NOx) оценивали по концентрации конечных стабильных метаболитов оксида азота (нитритов, нитратов и суммарным продуктам) с помощью модифицированной реакции Griess (Коробейникова Э.Н., 2002).
Статистическая обработка материала проводилась с помощью пакета прикладных программ StatSoft Statistica v6.0. Результаты представлены в табл. 1,2 в виде средней и ошибки средней (М ± ш). Различия между группами оценивали по непараметрическим критериям Манна-Уитни (при р < 0,05).
Результаты и обсуждение. При анализе жалоб пациенток с наружным генитальным эндомет-риозом, ассоциированным с бесплодием (1-я группа), было выявлено наличие хронической тазовой боли у 100 % женщин, в то время как у пациенток с бесплодием без НГЭ (2-я группа) только в 25 % случаев. При анализе гинекологического анамнеза были установлены следующие особенности: наличие миомы матки в 1-й группе у половины женщин, во 2-й - у 12 %, спаечный процесс был выявлен у 75 и 33 % женщин соответственно. У всех женщин 1-й и 2-й группы были обнаружены хронические воспалительные процессы верхних или нижних отделов полового тракта в неактивной стадии. Значимых различий в уровне половых гормонов между группами сравнения выявлено не было, в 1-й и 2-й группах выявлены признаки недостаточности лютеиновой фазы (17 и 8 %), гипе-рандрогения (25 % в каждой из групп).
Согласно классификации R-AFS у женщин 1-й группы 1-2 стадия НГЭ была выявлена в 58 % случаев (п = 7), 3-4 стадия - в 42 % случаев (п = 5).
В соответствии с целями исследования у женщин обеих групп были определены в сыворотке крови и перитонеальной жидкости цитокины, оказывающие регулирующее влияние на процессы роста клеток и ангиогенеза. В качестве фактора роста эпителиальных клеток нами определен уровень EGF в биологических жидкостях. Выбор факторов роста для исследования определялся тем, что эпителиальный фактор роста имеет принципиальное значение в контроле роста клеток эндометрия. При взаимодействии фактора с его рецептором EGF стимулирует процессы внутриклеточного фосфорилирования белков и тем самым способствует росту и пролиферации клетки-мишени. EGF участвует в контроле роста эпителиоцитов как в условиях нормы, так и при опухолевых процессах. VEGF является митогеном для клеток эндотелия и влияет на процессы неоангиогенеза в физиологических и патологических условиях, без которых невозможен гетеротопический рост эпителиоцитов. Человеческий интерлейкин-12 (IL-12) секре-тируется активированными антиген-представля-
ющими клетками (в частности, макрофагами) при их примировании антигенами, патоген - ассоциированными молекулами и молекулами, ассоциированными с повреждением собственных клеток, что приводит к инициации Т-11е1рег-1 (ТЫ) иммунного ответа. 1Ь-12 действует как ростовый фактор Т- и 1ЧК-клеток, является ключевым цитокином в развитии ТЫ лимфоцитов, индуцирует апоптоз, ингибирует ангиогенез. 1Ь-12 усиливает цитотоксичность макрофагов, дефицит его продукции макрофагами может значительно снижать противоопухолевую активность клеток.
Оксид азота относится к универсальным внутриклеточным мессенджерам. Активными продуцентами его являются эндотелиоциты, макрофаги, газообразное состояние мессенджера определяет не только его внутриклеточное действие, но и регулирующие объемные эффекты, включающие вазодилятацию, инициацию воспалительного процесса и апоптоза клеток. Данные о содержании цитокинов в изучаемых биологических жидкостях представлены в табл. 1.
При анализе табл. 1 видно, что у пациенток с НГЭ уровни УЕСТ и БОР в сыворотке крови максимальны в сопоставлении с показателями группы контроля и группы женщин без НГЭ, что подтверждает вероятную роль обоих факторов роста в процессе гетеротопического расселения клеток эндометрия. Локально на уровне перитонеальной жидкости у женщин 1-й и 2-й групп выявляются достоверные различия содержания изучаемых факторов роста с существенным превалированием \nEGF и ВОР у женщин с бесплодием, ассоциированным с наружным генитальным эндометриозом.
При сопоставлении содержания ВОР в сыворотке крови и перитонеальной жидкости в каждой из групп пациенток четко выявляется более высокое содержание данного фактора роста на локальном уровне, в перитонеуме. Уровень эпидермального фактора роста в перитонеальной жидкости в 1-й группе превышал уровень сывороточного ЕвР семикратно и составило 455 пк/мл против 65 пг/мл в сыворотке крови. Во 2-й группе это превышение было всего трехкратным (98 и 32 пг/мл соответственно).
Анализ количества 1Ь-12 в биологических жидкостях пациенток с бесплодием был предпринят нами в связи с предполагаемым значением данного цитокина в инициации клеточного иммунного ответа на эктопическое развитие эндометриальной ткани. Как следует из табл. 1, никаких различий в уровне этого цитокина, определяющего ТЫ поляризацию иммунного ответа, между 1-й и 2-й группами не установлено, не выявлено также различий по содержанию этого интерлейкина в сыворотке крови у женщин контрольной группы. Полученные данные позволяют сделать вывод об отсутствии усиления продукции ГЬ-12 антиген-представляющими клетками крови и перитонеальной полости на эктопический рост эндометрия, что свидетельствует об отсутствии условий не только для ТЫ-поляризации иммунного ответа, но и для эффекта понижающей регуляции 1Ь-12 в отношении факторов неоангиогенеза.
Проблемы здравоохранения
Таблица 1
Уровень цитокинов в биологических жидкостях у обследованных женщин (М ± т)
Показатель 1 2 - 3 Р
Группа с НГЭ Группа сравнения Группа здоровых
УЕвР Сыворотка 32,67 ± 7,06 15,4 ± 2,44 10,46 ± 0,46 Р1-2 = 0,02 Р1-3 = 0,04
Перитонеальная жидкость 43,80 ±8,21 14,30 ± 1,72 — Р1_2= 0,0003
БОБ Сыворотка 57,85 ±7,93* 33,77 ± 4,87* 25,42 ± 4,39 Р1-2 = 0,02 Р1_з = 0,0036
Перитонеальная жидкость 459,72 ± 72,56* 102,15 ± 10,00* — Р1-2 = 0,00008
П.-12 Сыворотка 63,17 ±22,97 34,94 ± 7,38 33,41 ± 8,54 —
Перитонеальная жидкость 50,40 ±14,50 51,60 ±11,78 — —
Шх Сыворотка 27,53 ± 2,26 32,21 ± 4,46 16,66 ± 2,80 Р1-3 = 0,035 Р2-3 = 0,05
Перитонеальная жидкость 27,66 ± 3,25 25,67 ± 2,68 — —
Примечание: р!_2, Р2-3, Р1-3 - достоверность различий между сравниваемыми группами; * - достоверность различий между уровнем фактора в сыворотке крови и в перитонеальной жидкости.
При определении содержания терминальных стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови у пациенток 1-й и 2-й групп выявлено увеличение уровня суммарного количества метаболитов в обеих группах в сравнении со здоровыми женщинами. Достоверных различий по содержанию Ж)х в перитонеальной жидкости между 1-й и 2-й группами не выявлено, что позволяет рассматривать существенный и одинаково выраженный рост уровня конечных метаболитов азота в крови у пациенток в сопоставлении с контрольной группой здоровых женщин и одинаковый уровень Ж)х в перитонеальной жидкости у пациенток 1-й и 2-й групп с бесплодием как результат нарушения процессов нит-роксидергической регуляции при неактивном хроническом воспалении, выявленном в обеих группах.
Для определения патогенетической роли нарушений цитокин- и нитроксидергической регуляции при бесплодии, ассоциированном с НГЭ и без проявлений эндометриоза, проведен анализ корреляционных взаимосвязей между уровнями отдельных изучаемых регуляторных молекул у пациенток с НГЭ 1-2 ст. и 3-4 степени, во 2-й и 3-й группах, результаты анализа приведены в табл. 2. Из таблицы следует, что у здоровых женщин и в группе сравнения (у женщин с бесплодием и хроническим неактивным воспалением в эндометрии без признаков НГЭ) достоверных положительных корреляционных связей между изучаемыми цитокинами и количеством 1ЧОх В 1фОВИ не выявляется. У здоровых женщин установлена лишь одна отрицательная сильная достоверная корреляционная связь (-0,95)
между уровнями 1Ь-12 и ВОР, что позволяет предполагать в физиологических условиях понижающее регуляторное действие на продукцию эпидермального ростового фактора высоких концентраций 1Ь-12 и повышающее действие низких концентраций цитокина. Не исключено, что, напротив, у здоровых женщин увеличение количества ЕСР тормозит продукцию 1Ь-12 и тем самым инициацию клеточного иммунного ответа, а снижение уровня ЕОБ оказывает противоположный, повышающий эффект на продукцию интерлейкина. Интерпретация полученного факта может быть различной, однако он однозначно свидетельствует о реципрокных отношениях в физиологических условиях между уровнями эпидермального фактора роста и интерлейкином, инициирующим ТЬ1 -зависимый иммунный ответ.
При эндометриозе 1-2 ст. и 3-4 ст. и наличии достоверного роста в крови уровней УВОР, ВОР и 1ЧОх появляются иные, чем у здоровых женщин, достоверные и сильные связи между цитокинами. Так, какие-либо достоверные корреляционные связи между уровнями ВОР и 1Ь-12 в крови при 1-2 и 3-4 стадиях эндометриоза утрачиваются, что свидетельствует об отсутствии эффекта измененных концентраций эпидермального фактора роста в отношении запуска ТЫ-зависимого иммунного ответа при НГЭ, что было характерно для здоровых женщин. Результаты корреляционного анализа с большой долей вероятности дают основания для утверждения значимости для патогенеза развития НГЭ нарушения петли обратной связи между измененными концентрациями факторов роста и 1Ь-12.
Таблица 2
Характер корреляционных связей между уровнями цитокинов и ЫОх в крови и перитонеальной жидкости при эндометриозе в группе сравнения и у здоровых женщин (метод Спирмена)
Корреляционная пара Эндометриоз 1-2 ст. Эндометриоз 3-4 ст. Группа сравнения Здоровые женщины
1Ь-12/ЕОЕ (сыворотка) - - - -0,95 (метод Пирсона)
УВОР/ВвР (перитонеальная жидкость) - -0,90 - -
МОх/ЕСБ (перитонеальная жидкость) 0,90 - - —
ГГОх/УЕОЕ (сыворотка) 0,86 — - -
Ж)х/1Ь-12 (перитонеальная жидкость) - 0,90 - -
Всего 2 2 0 0
При 3-4 ст. НГЭ обнаружена очень сильная отрицательная связь (г = -0,9) между двумя изучаемыми общими факторами роста: ВОР и УЕвБ, что также подтверждает нарушение цитокинерги-ческой регуляции при тяжелых степенях эндомет-риоза на локальном уровне. Нарушение нитроксидергической регуляции при НГЭ отражает появление сильных позитивных связей при 1-2 ст. процесса между уровнем Ж)х, с одной стороны, и количеством УВОВ и ВОВ - с другой, что делает правомочным предположение о повышающем регуляторном влиянии роста уровней оксида азота в отношении этих факторов. На этом основании можно также предполагать инициирующую роль повышения продукции оксида азота как универсального внутриклеточного мессенджера в нарушениях роста клеток эндометрия и эндотелия при НГЭ.
В 3-4 стадии НГЭ связи между уровнями Ж)х и изучаемыми факторами роста утрачиваются, но появляется сильная позитивная связь (г = 0,9) между уровнями Ж)х и 1Ь-12 на локальном уровне, что в свете выявленной тенденции некоторого роста 1Ь-12 при НГЭ, хотя и не достигающего степени статистической достоверности, позволяет предполагать, что при более выраженном распространении эктопического роста эндометрия продукция индуцибельного Ж)х усиливается, параллельно растет и продукция 1Ь-12, что косвенно свидетельствует об усилении функции антиген-представляющих клеток (в частности, макрофагов) при более тяжелых степенях НГЭ.
Таким образом* на основании исследований можно заключить, что формирование и эктопическое функционирование эндометриоидного «трансплантата» у женщин с бесплодием происходят на фоне существенных изменений характера цито-кин- и нитроксидергической регуляции в организме пациенток в сопоставлении со здоровыми женщинами и пациентками с бесплодием, не имеющих признаков НГЭ.
Заключение. Для пациенток с бесплодием, ассоциированным с НГЭ, характерно достоверное повышение количества цитокинов (УЕОБ, ЕОБ и ГЬ-12) и повышение уровня конечных стабильных
метаболитов оксида азота в циркуляции. У пациенток с бесплодием, ассоциированным с НГЭ, в отличие от больных группы сравнения, не имеющих признаков эндометриоза, в перитонеальной жидкости выявлено трехкратное достоверное увеличение уровня факторов роста (VEGF, EGF) без существенного подъема количества IL-12. Проявлением нарушения цитокин- и нитроксидергической регуляции иммунного ответа при НГЭ является утрата негативной, сильной корреляционной связи между уровнями эпидермального фактора роста в крови и количеством IL-12, характерной для здоровых женщин, и появление корреляционных связей, отсутствующих в физиологических условиях.
Литература
1. Адамян, Л.В. Эндометриозы / JI.B. Адамян, В.И. Кулаков // Руководство для врачей. — М.: Медицина. -1998.
2. Баскаков, В.П. Эндометриоидная болезнь / В.П. Баскаков, Ю.В. Цвелев, Е.Ф. Кира. - СПб.: ООО «Издательство Н-Л», 2002.
3. Железное, Б.И. Генитальный эндометриоз / Б.И. Железное, А.Н. Стрижаков. -М.: Медицина. -1985.
4. Ищенко, А.И Эндометриоз. Диагностика и лечение/А.И Ищенко, Е.А. Кудрина. - М.: Гэотар-Мед. - 2002.
5. Halme, J. Altered maturation and function of peritoneal macrophages: Possible in the pathogenesis of endometriosis / J. Halme, S. Becker, S. Haskill // Am. J. Obstet.Gynecol. - 1987. - V. 156, N° 4. -P. 783-789.
6. Ho, H.W. Peritoneal cellular immunity and endometriosis/H.W. Ho, M.Y. Wu, Y.S. Yang//Am. J. Reprod. Immunol. -1997. - V. 38, № 6. - P. 142.
7. Uterine chemocines in reproductive physiology and pathology / J.A. Kennan, T.T. Chen, N.L. Chad-well et al. //Am. J. Reprod. Immunol. - 1994. - V. 32, № 3. - P. 180-183.
8. Immunobiology of endometriosis / J.A. Kennan, T.T. Chen, N.L. Chadwell et al. //Ibid. — 1995. — V. 34, №6. -P. 381-385.
Поступила в редакцию 28 февраля 2009 г.
