Протекторный эффект эндофитных штаммов бактерий при токсическом действии ионов кадмия на растения Sinapis alba Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

УДК 581.1

ПРОТЕКТОРНЫЙ эффект эндофитных штаммов бактерии ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ДЕЙСТВИИ ИОНОВ КАДМИЯ НА РАСТЕНИЯ SINAPIS ALBA

© З. М. Курамшина1*, Ю. В. Смирнова1, Р. М. Хайруллин2

1Башкирский государственный университет, Стерлитамакский филиал Россия, Республика Башкортостан, 453109 г. Стерлитамак, пр. Ленина, 49.

Тел./факс: +7 (347) 343 38 69.

E-mail: [email protected] 2Институт биохимии и генетики УНЦРАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.

Тел./факс: + 7 (347) 235 60 88.

Изучено влияние инокуляции семян горчицы (Sinapis alba L.) эндофитными штаммами бактерий B. subtilis на рост и активность антиоксидантных ферментов растений при стрессе, вызванном ионами кадмия (Cd-стрессе). Показано, что под действием клеток B. subtilis уменьшался токсический эффект кадмия на растения, что проявлялось в улучшении их роста при высоких концентрациях металла в среде, сохранении активности ферментов ка-талазы и пероксидазы, снижении интенсивности перекисного окисления липидов.

Ключевые слова: Sinapis alba, Bacillus сидантные ферменты, перекисное окисление

Введение

Кадмий является одним из наиболее токсичных среди тяжелых металлов (ТМ). В почвах сельскохозяйственных угодий кадмий может достигать высоких концентраций и легко ассимилироваться растениями, приводя к остановке их роста и развития, негативно влияя на фотосинтез, дыхание, водный обмен и минеральное питание [1].

Фитотоксичность кадмия может быть связана с его способностью индуцировать в клетках повышенное образование активных форм кислорода (АФК), ведущих к развитию окислительного стресса [2]. Увеличение АФК приводит к усилению перекисного окисления липидов (ПОЛ), что является одной из причин дестабилизации мембран [3].

Одной из важнейших систем, способствующих устойчивости растений в условиях воздействия ТМ является антиоксидантной защита, особая роль в которой принадлежит антиоксидантным ферментам, активность которых значительно возрастает в условиях воздействия стрессовых факторов [4].

В настоящее время, одним из перспективных направлений по повышению устойчивости растений к действию ТМ является использование экологически чистых технологий, основанных на применении эндофитных штаммов B. subtilis, обладающих фунгицидной и ростстимулирующей активностями [5]. Бациллы, как известно, продуцируют большое количество биологически активных веществ, таких как ферменты, антибиотики, различные аминокислоты [6]. Известен антистрессовый эффект B. subtilis (например, штаммы 26Д и 11ВМ) при воздействии на растения различных абиотических факторов (засоление, водный дефицит, действие ТМ) [7, 8, 9]. В литературе, однако, отсутствуют сведения о механизмах антистрессового эффекта этих бактерий, в том числе и при воздействии на растения ТМ. В связи с этим, целью настоящей работы явилось изучение влияния инокуляции семян

subtilis, кадмий, липидов.

окислительный стресс, антиок-

горчицы белой эндофитными штаммами бактерий B. subtilis на рост побегов и активность антиоксидантных ферментов растений горчицы при Cd-стрессе.

Методика

Растительный материал. Объектом исследования служили проростки горчицы белой (Sinapis alba L.). Эксперименты проводили в лабораторных условиях. Семена перед посадкой промывали в мыльной воде, стерилизовали 96%-ым этанолом (1 мин), трижды ополаскивали в дистиллированной воде, подсушивали. В экспериментах использовали бактерии B. subtilis - штамм 26Д (получен из коллекции ВНИИСХМ С.-Пб.- Пушкин, №128) и штамм 11ВМ (выделены в лаборатории биотехнологии Башкирского ГАУ из поверхностно стерилизованных тканей растений мягкой яровой пшеницы Triticum aestivum L.). Обработку семян бактериями проводили в ламинар-боксе. В опытах использовали 20-часовую культуру бактерий, растущую на мясо-пептонном агаре при +37 °С. Клетки бактерий отмывали раствором 0.001М KCl. Суспензию клеток доводили до необходимой концентрации по оптической плотности. 1 г семян обрабатывался 20 мкл суспензии бактерий в концентрации 106 кл/мл. Обработанные семена выдерживали в течение часа, затем использовали в экспериментах. Контрольные семена обрабатывали дистиллированной водой.

Инокулированные и контрольные семена проращивали в вегетационных сосудах, заполненных почвой- черноземом выщелоченным. В почву ионы металла вносили в виде раствора соли Сd(NO3)2•4H2O, однократно после посева семян. Растворы готовили в пересчете на ионы металла в концентрации 10 и 200 мг/кг почвы. Контрольные растения поливали дистиллированной водой. Растения выращивали при температуре 18-20 °С. Размещение вегетационных сосудов меняли каждый день по единой схеме, чтобы обеспечить равномерную освещенность.

* автор, ответственный за переписку

Измерение сырой массы побегов и отбор проб проводили на 3, 6, 9, 14, 30 сутки от начала эксперимента.

Экстракция. Проростки растений, выращенные в почве с различной концентрацией ионов кадмия, промывали в дистиллированной воде, удаляли избыток воды фильтровальной бумагой, взвешивали. Растительный материал гомогенизировали в 0.1М К-фосфатном буфере pH 6.0 (при определении пероксидазы) или в Трис буфере pH 7.8 (при определении каталазы и малонового диальдегида (МДА)) в соотношении навеска: экстрагент - 1:10 (г:мл), центрифугировали 10 минут при 8 тыс. об./мин. Надосадочную жидкость центрифугировали еще 10 минут при 16-18 тыс. об./мин. Для определения активности ферментов и уровня МДА использовали надосадочную жидкость.

Определение активности ферментов и концентрации МДА. Активность пероксидазы оценивали согласно методике Хайруллина с соавторами (2001), исходя из количества окисленного ортофе-нилендиамина [7]. Концентрацию белка определяли согласно методу Bradford [10]. Активность каталазы определяли согласно методике Королюк с соавторами. Принцип метода основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс [11]. Содержание МДА измеряли, используя метод Costa с соавторами [12]. Метод основан на образовании окрашенного комплекса между МДА и тиобарби-туровой кислотой при нагревании.

Все эксперименты проводили в трех биологических повторностях. В таблицах и на рисунках приведены средние значения трех повторностей и их стандартные отклонения.

Результаты и их обсуждение

Влияние ионов кадмия на сырую массу побегов. Обработка семян бактериями B. subtilis положительно влияла на рост растений. Растения, ино-кулированные клетками B. subtilis, имели более высокие показатели биомассы побегов, чем необработанные, и по мере роста эти различия становились заметнее (табл. 1). Ростстимулирующий эффект бактерий, вероятно, связан с тем, что бациллы могут продуцировать фитогормоно-подобные ве-

Влияние кадмия на сырую

щества [13, 14], а также повышать содержание питательных веществ в доступной для растений форме [9] и подавлять развитие фитопатогенных микроорганизмов [14].

Содержание тяжелого металла в почве в концентрации 10 и 200 мг/кг на начальных этапах роста растений (до четырнадцати суток) оказывало слабое стимулирующее действие, однако на тридцатые сутки роста начинался проявляться ингиби-рующий эффект металла. Подобные эффекты ТМ описаны в литературе. Так, известно, что кадмий в очень низких концентрациях не вызывает заметных изменений и даже способен оказывать положительное влияние на состояние растений: стимулировать рост, повышать содержание пигментов, уменьшать интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) [15]. При действии высоких концентраций кадмия происходит торможение роста, уменьшение сырой и сухой массы растений, прогрессирующие с увеличением концентрации металла в среде выращивания [16, 17].

Растения, обработанные бактериями, в присутствии кадмия росли лучше необработанных. Так, при концентрации 200 мг/кг масса побегов у обработанных бактериями В. тЫШь 26Д и 11ВМ растений была больше на 8% и 19%, соответственно.

Влияние ионов кадмия на активность антиок-сидантных ферментов. У контрольных растений активность каталазы повышалась по мере роста растений, достигая максимума на девятые сутки, и снижалась к тридцатым суткам (табл. 2). У растений, обработанных В. тЫШь, активность фермента увеличивалась и была максимальной на шестые сутки роста проростков, затем начинала снижаться. При наличии ионов кадмия в почве в концентрации 10 мг/кг и 200 мг/кг активность каталазы у необработанных растений увеличивалась на начальных этапах роста, на тридцатые сутки снижалась в 1.6 и 1.8 раза, соответственно. У инокулированных бациллами растений активность каталазы была высокой во все точки фиксации (при концентрации кадмия 10 мг/кг и 200 мг/кг почвы показатели активности каталазы на тридцатые сутки были в 1.5 и 2.1 раза, соответственно выше, чем необработанных).

Таблица 1

массу побегов горчицы, мг

Концентрация, (мг/кг) Вариант Время, сутки

3 6 9 14 30

0 Не обр. 30.6±4.9 60.1±5.6 71.8±5.7 86.6±7.1 110.0±2.5

Обр. B.s. 26Д 32.2±5.3 59.7±4.6 72.3±3.3 88.5±2.5 123.8±2.2

Обр. B.s. 11ВМ 29.4±2.9 59.2±2.4 69.2±2.8 88.2±2.4 118.1±6.1

10 Не обр. 37.8±8.9 54.6±6.2 76.6±6.2 81.4±1.2 106.2±5.7

Обр. B.s. 26Д 27.8±4.7 57.1±3.9 82.1±8.8 85.0±2.8 123.8±8.6

Обр. B.s. 11ВМ 34.2±5.7 58.9±5.7 82.1±2.8 94.1±9.4 107.6±6.8

200 Не обр. 36.6±6.5 63.4±6.6 78.9±9.1 92.0±9.0 101.4±7.8

Обр. B.s. 26Д 27.5±3.1 60.4±3.7 83.7±3.0 93.3±9.2 121.4±5.4

Обр. B.s. 11ВМ 35.9±6.8 64.2±6.7 93.3±1.6 105.4±9.5 110.9±5.1

Таблица 2

Активность каталазы и пероксидазы в побегах горчицы, при загрязнении почвы тяжелым металлом

Концентрация, (мг/кг) Вариант Время, сутки

3 | 6 | 9 | 14 | 30

0 Активность каталазы, мкат/л

Не обр. 0.6±0.1 0.7±0.1 0.8±0.1 0.8±0.1 0.7±0.1

Обр. B.s. 26Д 0.4±0.1 0.8±0.1 0.7±0.1 0.7±0.1 0.7±0.1

Обр. B.s. 11ВМ 0.5±0.1 0.9±0.1 0.7±0.1 0.7±0.1 0.7±0.1

10 Не обр. 0.6±0.1 0.7±0.1 0.6±0.1 0.6±0.1 0.4±0.1

Обр. B.s. 26Д 0.6±0.1 0.6±0.1 0.7±0.1 0.6±0.1 0.7±0.1

Обр. B.s. 11ВМ 0.6±0.1 0.6±0.1 0.7±0.1 0.6±0.1 0.7±0.1

200 Не обр. 0.7±0.1 0.7±0.1 0.6±0.1 0.6±0.1 0.4±0.1

Обр. B.s. 26Д 0.7±0.1 0.8±0.1 0.7±0.1 0.8±0.1 0.9±0.1

Обр. B.s. 11ВМ 0.7±0.1 0.7±0.1 0.7±0.1 0.8±0.1 0.9±0.1

Активность пероксидазы, ед. мг'1-с'1

0 Не обр. 2.3±0.1 5.4±0.5 5.0±0.1 3.1±0.4 3.3±0.2

Обр. B.s. 26Д 3.7±0.1 7.3±0.2 5.6±0.3 2.6±0.1 2.7±0.1

Обр. B.s. 11ВМ 3.5±0.1 7.2±0.9 5.2±0.6 2.6±0.1 2.9±0.2

10 Не обр. 3.8±0.2 7.8±0.5 5.6±0.3 2.0±0.1 2.6±0.2

Обр. B.s. 26Д 5.2±0.3 6.7±0.8 4.7±0.1 3.5±0.3 3.5±0.2

Обр. B.s. 11ВМ 4.7±0.1 4.7±0.5 4.6±0.1 3.4±0.4 3.2±0.1

200 Не обр. 3.2±0.1 7.4±0.2 3.1±0.1 2.3±0.1 2.1±0.1

Обр. B.s. 26Д 2.8±0.1 7.1±0.3 3.6±0.1 4.2±0.1 3.9±0.1

Обр. B.s. 11ВМ 3.2±0.3 7.1±0.1 4.2±0.1 4.0±0.3 3.9±0.2

Активность пероксидазы в побегах растений была максимальной на шестые сутки роста в почве без металла (табл. 2), у обработанных растений клетками В. тЫШь обоих штаммов активность фермента была выше, чем у необработанных на в среднем на 35%. При внесение ионов кадмия в почву в концентрации 10 мг/кг и 200 мг/кг активность пероксидазы у неинокулированных бациллами растений на шестые сутки роста повышалась на 44% и 37%, а к 30-м суткам роста активность снижалась на 22% и 35%, соответственно при обработке клетками штаммов 26Д и 11ВМ. У обработанных бактериями растений резкого изменения активности пероксидазы под действием кадмия не наблюдали, на тридцатые сутки опыта активности фермента у растений оставалась высокой и была сопоставима с показателями активности у контрольных растений.

На начальных этапах роста растений (3 сутки) содержание МДА в побегах было наиболее высоким, по мере взросления отмечена тенденция уменьшения продуктов ПОЛ (табл. 3). У инокули-рованных бактериями В. ьпЫШь 26Д и 11ВМ растений показатели ПОЛ на тридцатые сутки опыта были ниже на 42% и 37%, соответственно, чем у необработанных. Наличие кадмия в почве приводило к снижению уровня МДА у молодых растений почти в два раза, затем по мере роста растений концентрация МДА увеличивалась и к тридцатым суткам содержание МДА в побегах неинокулиро-ванных бациллами растений было на 23% (Сё 10 мг/кг) и 57% (Сё 200 мг/кг) выше, чем в варианте без металла. В тканях побегов растений, обработанных бактериями, показатели МДА колебались на уровне контрольных растений, не подвергшихся воздействию металла.

Таблица 3

Концентрация малонового диальдегида в побегах горчицы, выросшей на почве, содержащей кадмий,

моль/г сырого веса х10-5

Концентрация, (мг/кг) Вариант Время, сутки

3 6 9 14 30

0 Не обр. 6.5±0.6 1.9±0.3 2.9±0.2 3.3±0.2 3.5±0.4

Обр. B.s. 26Д 6.1±0.6 1.3±0.3 3.0±0.1 2.1±0.2 2.0±0.2

Обр. B.s. 11ВМ 5.9±0.2 3.5±0.1 2.5±0.1 2.5±0.1 2.2±0.1

10 Не обр. 3.1±0.3 2.9±0.1 3.2±0.5 3.6±0.2 4.3±0.6

Обр. B.s. 26Д 4.8±0.9 2.8±0.1 2.4±0.2 2.9±0.2 2.8±0.1

Обр. B.s. 11ВМ 5.6±0.1 2.0±0.1 1.4±0.4 3.6±0.7 3.1±0.3

200 Не обр. 2.9±0.4 2.5±0.4 2.4±0.4 3.5±0.6 5.5±0.1

Обр. B.s. 26Д 4.4±0.2 1.1±0.1 1.7±0.2 2.3±0.6 3.6±0.2

Обр. B.s. 11ВМ 5.3±0.5 1.7±0.1 1.5±0.1 2.5±0.4 3.7±0.2

Известно, что в токсичных концентрациях ионы ТМ индуцируют образование АФК и могут вызывать значительные отклонения метаболизма [2, 3]. В растениях горчицы вызванный кадмием окислительный стресс выражался в повышении активности антиокислительных ферментов. Активация каталазы и пероксидазы направлена на разрушение H2O2 и АФК и защиту клетки от вызываемых ими повреждений [17]. Об эффективной работе ферментов свидетельствует низкий уровень продуктов ПОЛ в побегах горчицы. Более высокий уровень МДА у необработанных бактериями растений по сравнению с контрольными позволяет предположить нарушение растительной ферментной системы антиоксидантной защиты. Повреждающий эффект ионов кадмия был хорошо заметен только на тридцатые сутки эксперимента. Вероятно, это связано с меньшей чувствительностью к воздействию стрессора надземной части, по сравнению с корнями [1]. Кроме того, можно предположить, что в течение определенного времени растение активно борется с действием фактора, и только затем наступают повреждения.

Инокуляция клетками B. subtilis снижала токсический эффект кадмия, что проявлялось не только в показателях лучшего роста при высоких концентрациях металла, но и в сохранении активности каталазы и пероксидазы, уменьшении интенсивности ПОЛ. Таким образом, повышение устойчивости растений, обработанных бактериями B. subtilis, при воздействии ионов кадмия можно объяснить повышением активности антиокислительных ферментов и менее интенсивным развитием окислительного стресса.

ЛИТЕРАТУРА

1. Серегин И. В., Иванов В. Б. Физиологические аспекты токсического действия кадмия и свинца на высшие растения // Физиология растений. 2001. Т.48. № 4. С. 606-630.

2. Cho U. H., Seo N. H. Oxidative Stress in Arabidopsis thaliana Exposed to Cadmium Is due to Hydrogen Peroxide Accumulation // Plant Sci. 2005. V. 168. P. 113-120.

3. Курганова Л. Н., Балалаева И. В., Веселов А. П., Синицы-на Ю. В., Васильева Е. А., Цыганова М. И. Прооксидант-но-антиоксидантный статус хлоропластов гороха при действии стрессирующих абиотических факторов среды: 1. Продукция активных форм кислорода и липопероксида-ция // Вестник Нижегородского университета им. Н. И. Лобачевского. 2010. №2(2). С. 544-549.

4. Шевякова Н. И., Нетронина И. А., Аронова Е. Е., Кузнецов Вл. В. Распределение Cd и Fe в растениях Mesembryanthemum crystallinum при адаптации к Cd-стрессу // Физиология растений. 2003. Т. 50. №5. С. 756-763.

5. Мубинов И. Г. Реакции пшеницы на действие клеток эндофитного штамма 26D Bacillus subtilis: основы биофунгицида фитоспорин: Автореф. дисс... канд. биол. наук. Уфа. 2007. 22 с.

6. Недорезков В. Д. Биологическое обоснование применения эндофитных бактерий в защите пшеницы от болезней на Южном Урале: Автореф. дисс. д-ра с.-х. наук. С-Пб, 2003. 41 с.

7. Хайруллин Р. М., Недорезков В. Д., Мубинов И. Г., Захарова Р. Ш. Повышение устойчивости пшеницы к абиотическим стрессам эндофитным штаммом Bacillus subtilis // Вестник ОГУ. 2007. №2. С. 129-134.

8. Курамшина З. М., Смирнова Ю. В., Хайруллин Р. М. Повышение толерантности проростков подсолнечника Helianthus annuus, инокулированных эндофитным штаммом Bacillus subtilis, к действию тяжелых металлов. Сообщение 2. Антистрессовая активность эндофита Bacillus subtilis 26D при действии тяжелых металлов на растения подсолнечника Helianthus annuus // IV Всероссийская научно-практическая конференция «Проблемы экологии Южного Урала»: приложение к 10 номеру (2009 г.) журнала «Вестник ОГУ», 2021 октября 2009 г. Оренбург: Оренбургский государственный университет, 2009. С. 461-463.

9. Егоршина А. А., Р. М. Хайруллин, Лукьянцев М. А., Курамшина З. М., Смирнова Ю. В. Фосфат-мобилизующая активность эндофитных штаммов Bacillus subtilis и их влияние на степень микоризации корней пшеницы / Научный журнал Сибирского федерального университета. Краснояраск. 2011. №1. С. 172-182.

10. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding//Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. №2. P. 248-254.

11. Королюк М. А., Иванова Л. И., Майорова И. Г., Токарев В. Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. 1988. № 1. С. 16 - 18.

12. Costa H., Gallego S. M., Tomaro M. L. Effect of UV-B radiation on antioxidant defense system in sunflower cotyledons // Plant Sci. 2002. V. 162. P. 939-945.

13. Архипова Т. Н., Веселов С. Ю., Мелентьев А. И., Мартынен-ко Е. В., Кудоярова Г. Р. Сравнение действия штаммов бактерий, различающихся по способности синтезировать цитоки-нины, на рост и содержание цитокининов в растениях пшеницы // Физиология растений. 2006. Т. 53. №4. С. 567-574.

14. Мелентьев А. И. Аэробные спорообразующие бактерии Bacillus Cohc в агроэкосистемах. М.: Наука. 2007. 147 с.

15. Титов А. Ф., Таланова В. В., Казнина Н. М., Лайдинен Г. Ф. Устойчивость растений к тяжелым металлам. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2007. 172 с.

16. Ghorbanli M., Kavaeh S.H., Serehr M.F. Effects of Cadmium and Gibberellin on Growth and Photosynthesis of Glycine max // Photosynthetica. 1999. V. 37. P. 627-631.

17. Zhang F., Shi W., Jin Z., Shen Z. Response of Antioxidative Enzymes in Cucumber Chloroplasts to Cadmium Toxicity // J. Plant Nutr. 2003. V. 26. P. 1779-1788.

Поступила в редакцию 03.08.2013 г.