CC BY
118
УДК 581.1
раздел БИОЛОГИЯ
ПРОТЕКТОРНАЯ И РЕГУЛЯТОРНАЯ РОЛЬ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ ПРИ ДЕЙСТВИИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА РАСТЕНИЯ ПШЕНИЦЫ
© А. Р. Еникеев1*, И. Ю. Усманов1, З. Ф. Рахманкулова2
1 Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
E-mail: enikeev. aleksandr@mail. ru 2Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН Россия, 127276 г. Москва, ул. Ботаническая, 35.
E-mail: [email protected]
В работе было изучено влияние экзогенной аскорбиновой кислоты на растения пшеницы Triticum aestivum L., подвергнутый воздействию повыгшенной концентрации тяжелыгх металлов на примере кадмия, которыгй выгзыгвал снижение ростовыгх параметров, способствовал резкому ухудшению энергетического баланса и развитию окислительного стресса. Аскорбиновая кислота оказыгвала защитныгй эффект, которыгй выгражался в повыгшении значений морфометрических показателей, стабилизации энергетического баланса и уменьшении перекисного окисления липидов (ПОЛ). Выгявлена положительная корреляция между изменением энергетического и редокс-балансов при токсических концентрациях кадмия и протекторном действии аскорбиновой кислоты. Обсуждается роль аскорбата в регуляции энергетического обмена в условиях окислительного стресса.
Ключевые слова: Triticum aestivum L., фотосинтез, дыгхание, аскорбиновая кислота, кадмий, окислительный стресс.
Введение
Проблема устойчивости растений занимает важное место в физиологии растений. Избыток тяжелых металлов (ТМ) в почве - распространенный стрессовый фактор, нарушающий рост и развитие растений, повреждающий липидные мембраны, белки и нуклеиновые кислоты в клетках, вызывающий повышенное образование активных форм кислорода (АФК) и, как следствие, приводящий к окислительному стрессу [1]. Это, в свою очередь, ведет к усилению активности защитных систем у растительного организма [2]. Реакция растений на действие кадмия носит неспецифичный характер и аналогична реакции растений на действие других тяжелых металлов [3].
Кадмий попадает в ткани растений через поглощающую систему корней вместе с ионами, необходимыми для минерального питания [4]. Доказана связь между кадмиевым стрессом у растений и увеличением содержания АФК в клетках, однако известно, что Сё не участвует в окислительно-восстановительных процессах и не способен продуцировать АФК через реакцию Фентона [5]. Изменение редокс-статуса клеток обусловлено негативным воздействием Сё на активность тиолсодер-жащих ферментов [6], а также на функциональность электротранспортных путей хлоропластов и митохондрий - основных источников АФК [7, 8]. В таких условиях концентрация кислородных радикалов, являющихся побочным продуктом нормального метаболизма, достигает токсических значений.
У растений имеется эффективная антиоксида-тивная система, регулирующая уровень АФК и препятствующая окислительному разрушению липидных мембран и белковых комплексов. Аскорбат
(Лвс), играющий основную роль в ликвидации Н202, возможно, является наиболее важным и мощным антиоксидантом в растениях [9, 10]. Функции этой молекулы являются на данный момент достаточно изученными [11], так выявлено ее участие в регуляции роста и развития, во многих метаболических процессах и антистрессовых механизмах. Показано, что при длительном воздействии Сё содержание Л8С в клетке в восстановленной форме уменьшается [12, 13], при этом увеличивается концентрация Н202 и активность ферментов ас-корбат-глутатионового цикла [6]. Это указывает на участие Л8С в защитных реакциях против метал-линдуцированного окислительного стресса. Однако влияние аскорбата на адаптационные механизмы на уровне основных энерготрансформирующих процессов на сегодняшний день остаются малоизученным аспектом.
Целью нашей работы явилось изучение действия экзогенного аскорбата на растения пшеницы, подвергнутых действию повышенных концентраций Сё, выяснение его протекторной и регуляторной роли в установлении энергетического и редокс-балансов в клетках растений.
Материалы и методы
Объектами исследования были растения мягкой пшеницы Triticum aestivum Ь., сорта Башкирская 26. Растения выращивали в условиях водной культуры в кюветах на светоплощадке: освещенность 15 кЛк, световой период - 16 ч. Средняя температура воздуха составляла 27±2 °С, влажность воздуха 80-90 %.
Для создания условий повышенного содержания металлов в питательную среду добавляли Сё(К03)2, в концентрации в 150 мкМ,
* автор, ответственный за переписку
при которой растения длительное время сохраняют жизнеспособность [14]. Для изучения влияния экзогенного ЛзС в кюветы добавляли 1 мкМ аскорбиновой кислоты. Растения выращивали на растворе Хогланда-Арнона. Растворы ТМ и Asc вносили на 9-ые сутки от прорастания семян. Исследования проводили на 11-суточных растениях.
В ходе экспериментов регистрировали изменение сырой и сухой массы (А ДО). Сухую массу определяли после высушивания корней и побегов растений при 90 °С в течение 24 ч. Относительную скорость роста (ОСР) рассчитывали по формуле ОСР = АW/W А^ где W - исходная сухая масса растения; Аt - время, сут. Интенсивность суммарного дыхания (Дсум) определяли манометрическим методом на аппарате Варбурга и выражали в мкл 02/сут на растение [15]. Истинный фотосинтез (Фист) рассчитывали, как сумму АWсух + Дсум.
Содержание продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида (МДА) определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой [16].
Измерения проводили в 3-кратной биологической и 3-кратной аналитической повторности.
Результаты и обсуждение
Известно, что присутствие избыточных концентраций ТМ в окружающей среде приводит к нарушениям метаболизма в клетках растений и, как
следствие, отражается на их ростовых характеристиках [17]. В наших экспериментах действие Сё также приводило к угнетению роста растений. ОСР (в расчете на сухую биомассу) снижалась в 5 раз (рис. 1). Существенно уменьшалась и сырая биомасса - на 18% (рис. 2), что может быть связано с негативным влиянием ионов Сё2+ на поглощение и транспорт воды, а также транспирацию [14]. Снижение сухой массы целых растений на 8%, скорее всего, связано с нарушениями баланса между энерготрансформирующими процессами, вызванными, в свою очередь, воздействием на активность фото-синтетического аппарата и ферментов, участвующих в процессе дыхания.
Сухая масса растений, выращенных на растворе Л8С, возросла относительно контроля на 13%. Установлен благотворный эффект Л8С на растения, выращенные при повышенной концентрации ТМ. Аскорбиновая кислота способствовала трехкратно -му возрастанию ОСР в обоих случаях, соответственно (рис. 1).
Очевидно, что стимулирование ростовых процессов у растений в присутствии Л8С по сравнению с контролем может свидетельствовать о достижении оптимального баланса между основными энергопроизводящими и энергопотребляющими процессами в клетках за счет уменьшения диссипаци-онных затрат.
0,20 -
0,18 -
0,16 -
0,14 -
0,12 -
2
2 0,10 -
Оъ О О 0,08 -
0,06 -
0,04 -
0,02 -
0,00 -
1 2 3 4
Рис.1. Относительная скорость роста (ОСР) растений пшеницы в контроле (1), при действии Лзс (2), Сё (3) и Лзс+Сё (4).
А Б
Рис. 2. Изменения в накоплении сухой (А) и сырой (Б) массы растений пшеницы в контроле (1), при действии Азс (2), Сё (3) и Азс+Сё (4).
Кроме того, показано, что А8С оказывает протекторное действие в присутствии Сё, на что указывает повышение значений ОСР у растений, выращенных на растворе содержащем и ТМ и А8С.
В ходе проведенных экспериментов мы исследовали влияние ТМ на отношение суммарного темнового дыхания к истинному фотосинтезу (Дсум/Фист). Данный параметр является показателем физиологического состояния и сбалансированности основных физиологических процессов -фотосинтеза, дыхания, транспорта ассимилятов, роста и т.д. в растениях [18]. Известно, что данное соотношение консервативно и видонеспецифично, т.е. стремится к минимальному оптимальному отношению 38-40% [11]. Воздействие стрессовых факторов влечет за собой изменение Дсум/Фист, как правило, в сторону увеличения соотношения в результате возникновения дополнительных дыхательных затрат на адаптацию растений, возрастания диссипационных процессов или снижения истинного фотосинтеза [19]. Нами было показано, что воздействие Сё на исследуемые растения приводит к серьезному нарушению энергетического
баланса, которое выражалось в возрастании доли дыхательных затрат от истинного фотосинтеза (Дсум/Фист) в 2.3 раза (рис. 3). Обработка Лзс растений, растущих в условиях токсических концентраций ТМ, приводила к стабилизации энергетического баланса до значения равного 40%. Интересно, что у растений, растущих вне условий кадмиевого стресса, Азс вызывал снижение доли суммарных дыхательных затрат.
Ранее было показано, что дополнительные энергетические затраты растений, подвергнутых действию стрессовых факторов, по-видимому, связаны с возрастанием доли участия альтернативного цианидрезистентного пути дыхания [17]. Воздействие Сё ведет к нарушению функций митохондрий, в которых усиливается генерация АФК. Известно, что Н202 индуцирует экспрессию альтернативной оксидазы [20], чья активность ускоряет электронный транспорт через митохондриальную электрон-транспортную цепь (ЭТЦ), что, в свою очередь, способствует снижению образования АФК. Известно также, что скорость накопления АФК контролируется системой антиоксидантов [21].
Рис. 3. Доля дыхательных затрат от гросс-фотосинтеза (XR/Pg, %) растений пшеницы в контроле (1), при действии Лзс (2),
Сё (3) и Лзс+Сё (4).
А Б
Рис. 4. Содержание малонового диальдегида (МДА, нМ/г сырой массы) в побегах (А) и корнях (Б) растений пшеницы в контроле (1), при действии Лзс (2), Сё (3) и Лзс+Сё (4).
Ь,2
Ь,0
4,8 -
4,6
4,4 -
4,2
4,0
З
4
Чтобы подтвердить связь изменений энергетического баланса с интенсификацией образования АФК, мы исследовали интенсивность ПОЛ, основываясь на содержании МДА в корнях и побегах растений. Являясь относительно стабильным продуктом пероксидации липидов, МДА служит удобным показателем степени окислительного стресса [4]. В присутствии Сё уровень МДА повышался (рис. 4), что указывает на интенсификацию образования АФК и нарушение про/антиоксидантного баланса. Протекторное действие Лзс, препятствующее избыточному образованию АФК, наблюдалось в корнях растений, в побегах антиокислитель-ный эффект не выражен.
Итак, показана высокая положительная корреляция между изменениями концентрации МДА в корнях и Дсум/Фист в целых растениях при действии токсических концентраций кадмия и протекторном действии Лзс (г = 0.97 при p < 0.05), т.е. при нарушении энергетического баланса, вызванного действием стрессового фактора, усиливается образование АФК. В таких условиях активизируются процессы, связанные с диссипацией невостребованной энергии, что, в свою очередь, приводит к возрастанию Дсум и установлению нового равновесия между процессами фотосинтеза и дыхания. Таким образом, подтверждена протекторная и регуляторная роль Азс, которая выражается в нейтрализации АФК и снижении степени окислительного стресса, что, в свою очередь, способствует улучшению энергетического баланса.
ЛИТЕРАТУРА
1.
Lijuna L., Xuemeia L., Yapinga G., Enbo M. Activity of the enzymes of the antioxidative system in cadmium-treated Oxya chinensis (Orthoptera Acridoidae) // Environ Toxicol Pharmacol. 2005. V. 20. №3. P. 412-416.
2. Foyer C. H., Noctor G. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. V. 49. F. 249-279.
3. Rodrfguez-Serrano M., Romero-Puertas M. C., Pazmino D. M., Testillano P. S., Risueno M. C., del Rfo L. A., Sandalio L. M. Cellular response of pea plants to cadmium toxicity: cross talk between reactive oxygen species, nitric oxide, and calcium // Plant Physiol. 2009. T. l5o. №1. P. 229-243.
4. Paradiso A., Berardino R., Pinto M. C., Toppi L. S., Storelli M. M., Tommasi F., Gara L. Increase in ascorbate-glutathione metabolism as local and precocious systemic responses induced by cadmium in durum wheat plants // Plant Cell Physiol. 2008. V. 49. P. 362.
5. Horemans N., Raeymaekers T., Beek K.V., Nowocin A., Blust R., Broos K., Cuypers A., Vangronsveld J., Guisez Y. Dehy-
droascorbate uptake is impaired in the early response of Ara-bidopsis plant cell cultures to cadmium // J. Exp. Bot. 2007. V. 58. P. 4307-4017.
6. Paradiso A., Berardino R., Pinto M. C., Toppi L. S., Storelli M. M., Tommasi F., Gara L. Increase in ascorbate-glutathione metabolism as local and precocious systemic responses induced by cadmium in durum wheat plants // Plant Cell Physiol. 2008. V. 49. P. 362-374.
7. Keck R. W. Cadmium alteration of root physiology and potassium ion fluxes // Plant Physiology. 1978. V. 62. №1. P. 94.
8. Sandalio L. M., Dalurzo H.C., Gomez M., Romero-Puertas M. C., Rfo L. A. Cadmium-induced changes in the growth and oxidative metabolism of pea plants // J. Exp. Botany. 2001. V. 52. P. 2115-2126.
9. Arora A., Sairam R. K., Srivastava G. C. Oxidative stress and antioxidative system in plants // Current Science. 2002. V. 82. P.1227-1238.
10. Gill S. S., Tuteja N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in Abiotic stress tolerance in crop plants // Plant Physiol. Biochem. 2010. V.48. P. 909- 930.
11. Blokhina O., Virilainen E., Fagerstedt K. V. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress // Annals of Botany. 2003. V. 91. P.179-194.
12. Demirevska-Kepova K., Simova-Stoilova L. , Stoyanova Z., Feller U. Cadmium stress in barley: growth, leaf pigment, and protein composition and detoxification of reactive oxygen species // J. Plant Nutrition. 2006. V. 29. P. 451-468.
13. Balestrasse K. B., Gardey L., Gallego S. M., Tomaro M. L. Response of antioxidant defence system in soybean nodules and roots subjected to cadmium stress // Aust. J. Plant Physiol. 2001. V. 28. P. 497-504.
14. Балахнина Т. И., Кособрюхов А. А., Иванов А. А., Кре-славский В. Д. Влияние кадмия на ^2-газообмен, переменную флуоресценцию хлорофилла и уровень антиокси-дантных ферментов в листьях гороха // Физиология растений. 2005. Т. 52. С. 21-27.
15. Гавриленко В. Ф., Ладыгина М. Е., Хандобина Л. М. Определение количественных и качественных параметров дыхания // Большой практикум по физиологии растений. М.: Высш шк., 1975. C. 251.
16. Heath R. L., Packer L. Photoperoxidation in isolated chlorop-lasts: II. Role of electron transfer // Arch. Biochem Biophys. 1968. V. 125. №3. Pp. 850-857.
17. Гильванова И. Р., Еникеев А. Р., Степанов С. Ю., Рахман-кулова З.Ф.. Участие салициловой кислоты и оксида азота в защитных реакциях растений пшеницы при действии тяжелых металлов // Прикладная биохимия и микробиология. 2012. Т. 48. №1. С. 103.
18. Рахманкулова З. Ф. Энергетический баланс целого растения в норме и при неблагоприятных внешних условиях // Журн. общ. биологии. 2002. Т. 63. №3. С. 239-248.
19. Рахманкулова З. Ф. Уровни регуляции энергетического обмена в растениях // Вестник Башкирского университета. 2009. Т. 14. №3(I). С. 1141-1154.
20. Apel K., Hirt H. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction // Annual Review of Plant Biology. 2004. V. 55. Р. 373-399.
21. Foyer C. H., Noctor G. Redox homeostasis and antioxidant signaling: a metabolic interface between stress perception and physiological responses // Plant Cell. 2005. T. 17. №7. Р. 1866-1875.
Поступила в редакцию 25.I0.20I2 г.
